[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌及其应用。

[0002] 兰科植物是世界上最珍贵的野生植物资源之一，具有巨大的经济价值。兰科植物多数种是著名的药用植物，具有很高的药用价值，随着中药现代化的快速发展，对兰科药用植物的市场需求越来越大。但由于兰科植物种子细小，仅具有未分化的原胚，没有胚乳，在自然条件下难以萌发，使得兰科植物的人工栽培相当困难。有研究表明，自然状态下大多需要特定的真菌与兰科植物种子形成共生关系，兰科植物种子才能萌发。

[0003] 杜鹃兰(Cremastra appendiculata)为兰科杜鹃兰属植物，是名贵、珍稀的药用植物，其干燥假鳞茎被称为山慈菇，具有清热解毒、活血化瘀、抗肿瘤等功效，有很高的药用价值，药材市场需求量巨大。但杜鹃兰种子萌发不易，且生长周期过长，导致资源稀缺。

[0004] 杜鹃兰为地生兰，其菌根真菌的种类和数量相当丰富，这也必然导致菌根真菌与杜鹃兰植物体之间存在着复杂的关系。基于杜鹃兰菌根真菌种类和数量丰富这一特点，研究人员进行了大量研究，证实了菌根真菌能够与杜鹃兰种子形成共生关系从而促进萌发。本发明通过大量研究，从菌根分离获得真菌，成功筛选出来一种有效促进杜鹃兰种子萌发的真菌，该真菌感染能力强，为优势菌，能够大大缩短杜鹃兰种子的萌发时间，提高杜鹃兰种子的萌发率。

[0051] 下面申请人结合图1～图7对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，对本发明进行详细说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明请求保护的范围。

[0052] 以下实施例中所用真菌通过菌根分离获得，为纯净菌株；本发明提供了一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌菌株；为从杜鹃兰健康根部分离真菌，之后通过筛选获得一株促进杜鹃兰种子萌发的真菌—小鬼伞属庭院小鬼伞。

[0053] 实施例1、一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌的分离、纯化、鉴定及与杜鹃兰种子共生实验，其具体步骤如下：

[0054] 1材料与方法

[0055] 1.1培养基

[0056] 本实施例中所用的真菌培养基质为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其制备方法为：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g切成小块，加水，煮沸30min，用八层纱布过滤后得滤液，在滤液中加入15g琼脂粉，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装于锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20min后取出摇匀，将冷却至40℃左右的PDA培养基倒入无菌培养皿中，待其凝固后贮存备用。

[0057] 本实施例中所用的真菌共生培养基质为燕麦琼脂培养基(OMA)，其制备方法为：称取燕麦片3g，加水，煮沸30min，后加入15g琼脂粉，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装于锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20min后取出摇匀，将冷却至40℃左右的OMA培养基倒入无菌培养皿中，待其凝固后贮存备用。

[0058] 1.2供试菌株

[0059] 本实施例中所用的真菌为通过分离杜鹃兰菌根真菌获得，杜鹃兰为在重庆野外采集所得，将杜鹃兰菌根用蒸馏水洗净，除去表面杂质；再用75％乙醇(75％是体积分数，下同，不赘述)表面消毒30s，然后用蒸馏水洗去乙醇；再用0.1％升汞表面消毒3min，然后用蒸馏水洗去升汞；再用2％次氯酸钠表面消毒3min，无菌水冲洗三次。将消毒完全的菌根用无菌刀切开，切面置于步骤1中制备的PDA培养基上，待菌丝长出后，取边缘真菌菌丝置于1.5％水琼脂培养基上，分离得到20株真菌，分别纯化四次后获得纯净菌株，取一部分纯净菌株置于新的PDA培养基上待用，同时另取一部分纯净菌株保存于PDA培养基斜面试管中备用。

[0060] 1.3植物材料

[0061] 本实施例中所用的杜鹃兰种子液为未开裂的成熟杜鹃兰果荚通过表面消毒制得：用75％乙醇表面消毒30s，蒸馏水冲洗三次；再用0.1％升汞表面消毒5min，蒸馏水冲洗三次；再用2％次氯酸钠表面消毒1min，无菌水冲洗三次，将已消毒完全的果荚打开释放种子，以0.1％无菌水琼脂悬浮液保存，备用。。

[0062] 1.4共生培养

[0063] 在OMA培养基表面铺上中央剪孔的无菌滤纸，将步骤1.3所得消毒完全的杜鹃兰种子液用无菌胶头滴管吸取2mL均匀分散在无菌滤纸上，从PDA培养基中挑取纯净菌丝块接种于中央孔处，一菌一组，每组三个皿，用封口膜封好培养皿，在人工气候箱中培养。

[0064] 1.5种子萌发

[0065] 定期于体视显微镜下观察种子形态变化，拍照记录。培养20天后观察发现其中一组皿中种子膨大，出现白色原球茎(见图1)，认定为杜鹃兰种子萌发，计算其萌发率为45.85％±2.4％，后原球茎持续生长，培养45天后观察该萌发组中形成大量原球茎，且出现幼芽(见图2)；本实施例的空白组种子仍未萌发(见图3)。

[0066] 1.6菌种鉴定

[0067] 将促进萌发的真菌的PDA斜面试管重新活化，将活化后的纯净菌株接种在PDA培养基上纯培养，对菌落进行形态观察。菌落在PDA培养基上生长速率为0.312±0.004mm/h，所述菌落呈圆形，呈淡黄色，气生菌丝稀疏较粗。菌落边缘整齐，初生菌丝白色、紧贴培养基表面(见图4)，老化菌丝浅黄稀薄。显微镜下观察可见菌丝呈树枝状向外生长，显微镜下初生菌丝显银白色，带光泽，较密集明显(见图5)。

[0068] 将促进萌发的真菌的PDA斜面试管重新活化，采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，以ITS1/ITS4序列为引物进行PCR扩增。将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司纯化测序，将测定的序列提交至NCBI数据库进行BLAST比对。

[0069] DNA提取方法采用上海生工Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，步骤如下：

[0070] 准备材料：水浴锅、小型离心机(最大离心力≥12000×g)、1.5mL离心管、无水乙醇、异丙醇、β‑巯基乙醇、RNaseA(20mg/mL)等。试剂盒初次开启，按瓶身标签说明在PWSolution中加入相应量的异丙醇混匀(3：2)、Wash Solution中加入相应量的无水乙醇混匀(1：2)。于室温密封保存。

[0071] 取菌丝用液氮研磨成粉末，加入1.5mL离心管中。加入200μLBuffer Digestion和2μLβ‑巯基乙醇，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解；加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，‑20℃冰箱放置5min；室温10,000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5mL离心管中；加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀；加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀；将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管，加入500μLPWSolution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液；将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液；将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的Wash Solution；取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL TE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或‑20℃保存。

[0072] PCR扩增方法如下：ITS区域的PCR扩增在94℃下进行4min，然后进行30个循环，94℃持续45s，55℃持续45s，72℃持续1min，最后在72℃下延伸8min。

[0073] 测序结果如下：扩增引物为通用的ITS1和ITS4，

[0074] 正向引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，如SEQ ID NO:2所示；

[0075] 反向引物ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，如SEQ ID NO:3所示；

[0076] 扩增序列为：

[0077] ATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCAAATTG

[0078] TCAAGGTATTGTCCTCGCGGACGGTTAGAAGCGAGTCTGATCCTCGTCCAC

[0079] GGCGTAGATAATTATCACACCAATAGACGGAAGTTCAGTATGAACTCGCTAA

[0080] TGCATTTCAGGGGAGCGGACCGCCGTGAGGCAGCCTGCACAAACCCCCAC

[0081] ATCCAAGCCTCGAAGAACAGTTCAGAAAACTGGTGAGGTTGAGAATTTAA

[0082] TGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCG

[0083] TTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATT

[0084] TCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTT

[0085] GTATAGTGTTTTATAGGCTGAGAAGCCCATTGACTACATTCTGCATCATACTA

[0086] TTGGGGTGTGTAAAAAGACGTAGAGCCTGGAAATTCGAGGGGAGCCGTGT

[0087] GACGGGCAACCCTCGCATCCGCCCCATGAAGGGCGAGAGGTATCCAGACC

[0088] TACAGTCGGTGCACAGGTGGAAAGATAAAAATGGCGGGCGTGCACATTGC

[0089] TCCGAGGAGCCAGCTACAACCAAGACACCATAGTTATTCGTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACG，如SEQ ID NO:1所示；PCR长度为681bp左右；将测定所得序列提交至NCBI数据库中(登录号：OR186295)，与数据库中的真菌核苷酸序列进行BLAST比对，当序列与数据库中的序列之间同一性大于99％，认为是同一属和种。该真菌序列与数据库中小鬼伞属庭院小鬼伞的序列同一性大于99％，故认定该真菌为小鬼伞属庭院小鬼伞(Coprinellus xanthothrix)。

[0090] 另外，申请人在燕麦培养基中培养得到了该菌的子实体(见图6)，符合庭院小鬼伞特征，而与其他已知的鬼伞类真菌有明显区别。

[0091] 上述所得小鬼伞属庭院小鬼伞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2023年1月10日，保藏编号为CCTCC M 2023060，其分类命名为Coprinellus xanthothrix，归属于小鬼伞属庭院小鬼伞菌(Coprinellus xanthothrix)。

[0092] 1.7对比实验

[0093] 本实验同时采用墨汁鬼伞做对照，将活化后的墨汁鬼伞同本实施例实验方法处理，与杜鹃兰种子液在OMA培养基上共生培养，处理3组，定期于体视显微镜下观察种子形态变化，拍照记录。

[0094] 20天后观察发现部分种子出现膨大，持续观察未发现进一步萌发，未出现原球茎(见图7)，50天后再次观察仍未进一步萌发，认定为该菌不能促进杜鹃兰种子萌发。

[0095] 实施例2、一种小鬼伞属庭院小鬼伞菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用，在共生培养基质—营养土培养，其具体步骤如下：

[0096] 1材料与方法

[0097] 1.1培养基

[0098] 本实施例中所用的真菌培养基质为PDB液体培养基，PDB液体培养基是马铃薯葡萄糖水培养基，其制备方法为：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g切成小块，加水，煮沸30min，用八层纱布过滤后得滤液，继续加热，再向其中加20g葡萄糖、3g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁和10mg维生素B1，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20min左右后取出摇匀，冷却后贮存备用。

[0099] 本实施所用的真菌共生培养基质为营养土，其制备方法为：从网上采购营养土(主要成分为：生根粉、蛭石、珍珠岩、有机质等)、方形塑料饭盒，将营养土分装于方形塑料饭盒中，每盒放置三根木棍，加水至饱和，盖紧盖子，121℃灭菌30min后取出，叠放整齐，备用。

[0100] 1.2供试菌株

[0101] 本实施例中所用的真菌为通过实施例1分离筛选获得，菌种为小鬼伞属真菌庭院小鬼伞，保存于PDA培养基中。

[0102] 取庭院小鬼伞菌种0.5cm*0.5cm小块，放置在装有100mL PDB液体培养基的锥形瓶中，用硅胶塞塞住瓶口，在超净工作台内完成，以免被其它真菌污染，在摇床上以转速为200r/min培养，待菌丝基本长满后得庭院小鬼伞的PDB液体培养基，备用。

[0103] 1.3植物材料

[0104] 同实施例1

[0105] 1.4共生培养

[0106] 在超净台中打开饭盒盖子，将含有庭院小鬼伞的PDB液体培养基均匀洒在营养土及木棍上，盖紧盖子，相同办法处理3盒，室内进行培养；待菌丝长满饭盒后，打开盖子，将杜鹃兰种子液均匀洒在饭盒中，盖紧盖子。

[0107] 1.5种子萌发

[0108] 定期观察种子形态变化，拍照记录，15天后观察发现饭盒中种子膨大，出现原球茎，认定为杜鹃兰种子萌发；40天后再次观察发现已有幼芽形成(见图8.a)，随着培养时间的延长，幼芽快速生长形成植株(见图8.b、图8.c)验证本实施例中的种子可以萌发，且幼芽、植株可以形成。

[0109] 实施例3、一种小鬼伞属庭院小鬼伞菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用，在共生培养基质—玉米芯培养，其具体步骤如下：

[0110] 1材料与方法

[0111] 1.1培养基

[0112] 本实施例中所用的真菌培养基质为PDB液体培养基，同实施例2；

[0113] 本实施所用的真菌共生培养基质为玉米芯，其制备方法为：从网上采购玉米芯，用清水清洗干净，浸泡在1％石灰水中进行消毒灭菌，一天后取出，大量清水清洗除去石灰水，将消毒灭菌完毕的玉米芯置于自封袋中，每袋放置3‑4根玉米芯，密封保存，备用。

[0114] 1.2供试菌株

[0115] 本实施例中所用的真菌通过实施例1分离筛选获得，菌种为小鬼伞属真菌庭院小鬼伞，保存于PDA培养基中。

[0116] 取庭院小鬼伞菌种0.5cm*0.5cm小块，放置在装有100mLPDB液体培养基的锥形瓶中，用硅胶塞塞住瓶口，在超净工作台内完成，以免其它真菌污染，在摇床上以转速为200r/min培养，待菌丝基本长满后得庭院小鬼伞的PDB液体培养基，备用。

[0117] 1.3植物材料

[0118] 同实施例1

[0119] 1.4共生培养

[0120] 在超净台中打开自封袋，将庭院小鬼伞的PDB液体培养基均匀洒在玉米芯上，关闭自封袋，相同办法处理3袋，室内进行培养；待菌丝长满玉米芯后，打开自封袋，将杜鹃兰种子液均匀洒在玉米芯上，关闭自封袋。

[0121] 1.5种子萌发

[0122] 定期观察种子形态变化，拍照记录，17天后观察发现自封袋中种子膨大，出现原球茎，认定为杜鹃兰种子萌发；45天后再次观察发现已有幼芽形成；验证本实施例中的种子可以萌发，且幼芽可以形成。

[0123] 实施例4、一种小鬼伞属庭院小鬼伞菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用，在共生培养基质—木头上培养，其具体步骤如下：

[0124] 1材料与方法

[0125] 1.1培养基

[0126] 本实施例中所用的真菌培养基质为PDB液体培养基，同实施例2；

[0127] 本实施例中所用的真菌共生培养基质为木头，其制备方法为：从室外采集的腐朽木头，除去表面杂质，包扎，121℃灭菌30min左右后取出，冷却后置于自封袋中，每袋放置3‑4块木头，密封保存，备用。

[0128] 1.2供试菌株

[0129] 本实施例中所用的真菌通过实施例1分离筛选获得，菌种为小鬼伞属真菌庭院小鬼伞，保存于PDA培养基中。

[0130] 取庭院小鬼伞菌种0.5cm*0.5cm小块，放置在装有100mLPDB液体培养基的锥形瓶中，用硅胶塞塞住瓶口，在超净工作台内完成，以免其它真菌污染，在摇床上以转速为200r/min培养，待菌丝基本长满后得庭院小鬼伞的PDB液体培养基，备用。

[0131] 1.3植物材料

[0132] 同实施例1

[0133] 1.4共生培养

[0134] 在超净台中打开自封袋，将庭院小鬼伞的PDB液体培养基均匀洒在木头上，关闭自封袋，相同办法处理3袋，室内进行培养；待菌丝长满木头后，打开自封袋，将杜鹃兰种子液均匀洒在木头上，关闭自封袋。

[0135] 1.5种子萌发

[0136] 定期观察种子形态变化，拍照记录，13后天观察发现自封袋种子膨大，出现原球茎，认定为杜鹃兰种子萌发；35天后再次观察发现已有幼芽形成；验证本实施例中的种子可以萌发，且幼芽可以形成。

[0137] 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0138] 以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解得到的变换或者替换，都应该涵盖在本发明的包含范围之内。