技术领域
[0001] 本发明属于药物制备技术领域和帕金森病药物研制技术领域，具体涉及一种DACA及其制备方法、应用和药物组合物。
相关背景技术
[0002] 帕金森病(PD)是继阿尔茨海默病之后人类第二常见的多因素进行性神经退行性疾病，目前并无有效手段可以将其根治。PD的主要病理学特征是黑质多巴胺神经元的进行性变性死亡，纹状体内多巴胺含量显著降低，这导致机体进行性运动系统功能障碍。其主要的临床表现是行动迟缓，静止性震颤，姿势反射障碍等。
[0003] DACA是从结构上属于松香烷型二萜类化合物，自发现确定结构以来，其药理活性一直得到广泛的关注，前期研究发现其具有良好的抗氧化活性，在神经退行性疾病中有较好的保护作用。而帕金森病是世界上公认的高发难治性疾病之一，是国内外神经系统疾病研究的重点和难点。而目前还没有关于DACA用于预防治疗帕金森病的先关专利和文献报道，DACA的对抗帕金森病药物或保健食品的方面较为空白。
具体实施方式
[0024] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025] 本发明提供了DACA，所述的DACA的分子式为：C24H30O6，结构式为：
[0026]
[0027] 本发明提供了上述技术方案所述倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0028] 取鼠尾草酚1克溶于8毫升无水吡啶中，加入1.4毫升乙酸酐，室温避光反应20小时。
[0029] 利用薄层色谱法跟踪鼠尾草酚反映情况，反应完成后停止搅拌，将反应液倒入冰水中(50毫升)萃灭。
[0030] 用乙酸乙酯萃取3次，每次50毫升，有机层减压浓缩得浸膏。所得DACA使用核磁共振技术进行鉴定。
[0031] 在本发明中，若无特殊说明，所需试剂和设备均为本领域技术人员熟知的市售商品。
[0032] 本发明提供了上述技术方案所述DACA在制备抗帕金森病药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
[0033] 本发明提供了上述技术方案所述DACA在制备抗帕金森病药物或保健食品中的应用。
[0034] 本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
[0035] 其中DACA用于制备神经保护剂或制备抗帕金森病药物时，本发明优选将所述DACA直接使用，或以药物组合物的形式使用。
[0036] 本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述DACA和药学上可接受的载体或赋型剂。
[0037] 在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。
[0038] 本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
[0039] 本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将DACA与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
[0040] 本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗帕金森病药物中的应用。
[0041] 本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
[0042] 本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备抗帕金森病药物或保健食品中的应用。
[0043] 本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
[0044] 在本发明中，当所述药物组合物用于制备抗帕金森病药物时，所述药物组合物在神经保护剂或药物中的含量优选为0.1～99％。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
[0045] 实施例一：
[0046] DACA的制备∶
[0047] 取鼠尾草酚1克溶于8毫升无水吡啶中，加入1.4毫升乙酸酐，室温避光反应20小时，化学反应式如图1所示。
[0048] 利用薄层色谱法跟踪鼠尾草酚反映情况，反应完成后停止搅拌，将反应液倒入冰水中(50毫升)萃灭。
[0049] 用乙酸乙酯萃取3次，每次50毫升，有机层减压浓缩得浸膏。所得DACA使用核磁共振技术进行鉴定；
[0050] 表征测试：
[0051] HRESI‑MS使用安捷伦LC‑MS‑Q‑TOFG6530(AgilentTechnologies,Santa Clara,USA)和岛津LC‑MS‑IT‑TOF(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；1DNMR和2DNMR使用AvanceIIIHD400,AV600(Bruker,Bremerhaven,Germany)核磁共振仪测定(TMS为内标)；薄层色谱硅胶购自上海皓鸿生物医药科技有限公司。
[0052] DACA核磁数据具体如下：
[0053] DACA,C24H30O6,HR‑ESI‑MS,m/z413.1958[M‑H]‑1
(calcd.for413.1970).H‑NMR(400MHz,CDCl3)δH:7.10(1H,s,H‑14),4.49(1H,d,J＝2.7Hz,H‑7),2.93(1H,m,H‑15),2.30(3H,s,11‑OCCH3),2.29(3H,s,12‑OCCH3),2.04(1H,s,H‑5),
1.18(3H,d,J＝2.2Hz,H‑16),1.19(3H,d,J＝2.2Hz,H‑17),0.91(3H,s,H‑19),0.86(3H,s,
13
H‑18)；C‑NMR(100MHz,CDCl3)δC:28.0(t,C‑1),18.8(t,C‑2),40.7(t,C‑3),32.8(s,C‑4),
44.6(d,C‑5),29.2(t,C‑6),77.1(d,C‑7),138.1(s,C‑8),129.2(s,C‑9),48.4(s,C‑10),
139.2(s,C‑11),140.9(s,C‑12),141.3(s,C‑13),118.6(d,C‑14),27.6(d,C‑15),20.4(q,C‑16),20.7(q,C‑17),31.7(q,C‑18),19.8(q,C‑19),174.2(s,C‑20),168.3(s,11‑OCCH3),
168.5(s,12‑OCCH3),22.8(q,11‑OCCH3),22.9(q,12‑OCCH3)。
[0054] 测试例
[0055] 1、测定DACA对MPP+损伤SH‑SY5Y细胞和原代神经元细胞的抗帕金森病活性[0056] 材料来源：SH‑SY5Y细胞购自中国科学院动物所。C57BL/6孕鼠购自昆明医科大学实验动物学部
[0057] 2、仪器来源：多功能酶标仪(ThermoScientificMultiskanFC，USA)；CO2恒温培养箱(ThermoForma3310，USA)。
[0058] 3、测试方法：实验：将细胞分为对照组、MPP+组、药物组，每组设5个复孔。将处于对4
数生长期的细胞SH‑SY5Y细胞，以1×10个/ml的密度接种于96孔细胞培养板上。原代神经元取孕期18天左右的孕鼠，剥离胎鼠脑组织，分离出海马和皮层，去除血膜。提取原代神经元置于Neurobasal培养液培养。第二天进行半换液，培养至第八天用于后续实验。
[0059] control组：正常培养的SH‑SY5Y细胞或原代神经元细胞；
[0060] 空白对照组：为无细胞组；
[0061] MPP+组：细胞继续培养24h后，弃去旧培养基，用1000μMMPP+处理24h；
[0062] 药物组：用含有不同浓度(5、10和20μM)药物处理24h；
[0063] 将细胞培养基更换为孔中含有10％CCK‑8的培养基。孵育2小时后，使用酶标仪在450nm处读取每个孔的吸光度，计算各组细胞存活率。实验重复3次。
[0064] 其中细胞存活率计算公式：细胞存活率(％)＝[A(加药)－A(空白)]/[A(对照)－A(空白)]×100％
[0065] DACA对SH‑SY5Y和原代神经元细胞的毒性及MPP+损伤的细胞抗帕金森活性结果如下所示。数据以平均±SEM表示。采用SPSS22.0软件进行静态分析。数据采用单因素分析，p<0.05认为有统计学意义。
[0066] 4、结果
[0067] 在进行抗帕金森活性检测前，我们先对DACA进行毒性评测。
[0068] 由图2示，DACA对SH‑SY5Y细胞和原代神经元细胞造成损伤，说明DACA对神经细胞基本无毒性，图2为DACA单独作用于SH‑SY5Y细胞和原代神经元细胞的细胞存活率。
[0069] 接着，我们评价了DACA对MPP+诱导的SH‑SY5Y细胞和原代神经元神经保护活性。
[0070] 如图3所示，MPP+组与控制组相比细胞存活率显著下降，说明MPP+损伤SH‑SY5Y细胞+和原代神经元细胞模型造模成功。图3为DACA作用于MPP诱导的SH‑SY5Y细胞和原代神经元# ##
细胞的细胞存活率。(均值±SEM,n＝5；p<0.05，p<0.01vscontrol组；*p<0.05，**p<+
0.01vsMPP组)。
[0071] DACA组与MPP+组相比细胞存活率显著提高，说明DACA对MPP+造成的神经损伤具有保护作用。综上，DACA具有抗帕金森病作用，可作为潜在的抗帕金森疾病的保护剂，可用于制备抗帕金森病药物或保健食品。
[0072] 2、测定DACA对MPTP诱导的PD小鼠的运动功能障的改善。
[0073] 1、材料来源：C57BL/6雄鼠购自昆明医科大学动物学部
[0074] 2、仪器来源：动物旷场行为学图像采集卡(欣软，上海)、VisuTrack动物旷场行为分析软件(欣软，上海)、动物爬杆行为学采集卡((欣软，上海)、VisuTrack动物爬杆行为分析软件(欣软，上海)。
[0075] 3、测试方法:
[0076] 实验：小鼠被安置在标准条件下适应1周后，将将动物分为5组(n＝13)。control组：正常对照组，给予生理盐水；MPTP组：MPTP(30mg/kg,i.p.)；低浓度药组：MPTP(30mg/kg,i.p.)+DACA(20mg/kg,I.g.)；中浓度药组：MPTP(30mg/kg,i.p.)+DACA(40mg/kg,I.g.)；高浓度药组：MPTP(30mg/kg,i.p.)+DACA(80mg/kg,I.g.)。试验持续14天。MPTP(30mg/kg/day)腹腔注射，连续7天。DACA(20、40和80mg/kg/day)灌胃14天。行为实验于实验第7天和第14天进行。
[0077] 3.1、旷场实验
[0078] 旷场实验(openfieldtest)又称敞箱实验，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，操作简便，方法可靠。实验装置由旷场反应箱和数据自动采集和处理系统两部分组成，小鼠旷场反应箱为50cm×50cm×50cm内壁涂黑，底面平均分为16个12.5cm×12.5cm小方格，正上方2m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。根据计算机软件设计不同可观察的参数不同，如单位时间内动物在中央格停留时间，某一肢体越过的格子数为水平得分(crossing)，后肢站立次数为垂直得分(rearing)，修饰次数，尿便次数；运动速度，运动距离，休息时间，沿边运动距离，中央运动距离等。
[0079] 本实验主要通过检测小鼠5min内的运动轨迹以及运动距离来探究小鼠的运动能力。实验在安静的环境下进行。将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察5min后停止摄像，75％酒精清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味)影响下次测试结果。更换动物，继续实验。
[0080] 3.2、爬杆实验
[0081] 爬杆实验是评价小鼠运动协调能力的经典方法。通过记录小鼠由杆的顶端往下爬到底部(双前爪着地)所需时间，比较其运动能力。该测试包括观察动物是否能在不跌倒或不停顿的情况下下降，可用于中风或帕金森病的啮齿动物模型。小鼠爬杆实验装置，包括底座、垂直长杆约80cm直径1cm、以及圆球。长杆上缠上纱布防止小鼠打滑，并通过连接装置与底座连接，圆球通过连接装置与长杆相连，本小鼠爬杆实验装置简单方便、清理消毒便捷，且可有效减少实验误差。
[0082] 本实验主要通过小鼠从杆子顶端爬行至杆子底端的时间来评价小鼠的运动抓握能力。实验在安静的环境下进行。将小鼠从圆球处放在长杆上让其从杆子顶端爬行至杆子底端，同时进行摄像和计时。小鼠走到杆子端底时停止计时。75％酒精喷洒长杆，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味)影响下次测试结果。酒精挥发后更换动物，继续实验。根据计算机软件统计小鼠从杆子顶端走至杆子底端的时间。
[0083] 4、结果
[0084] MPTP诱导的PD模型是一种著名的用于探索与帕金森病相关的分子改变的模型，其会导致小鼠运动功能障碍和行为改变。为了探讨DACA对运动功能障碍和行为改变的影响，我们进行了一些基本的行为研究，如旷场试验和爬杆试验。
[0085] 如图4所示，在实验进行第七天的行为学测试中，与生理盐水i.p.注射相比，MPTP治疗显著减少了小鼠在开放区域框内的总距离，而DACA各个剂量组都对其有一定的改善作用。同样的，MPTP处理组的小鼠中心区域的停留时间降低了，角落时间明显增加，而DACA处理显著上调了中心区域的停留时间和减少了角落时间。在爬杆实验中，与对照组相比，MPTP处理组下降到地板的总时间和转头时间显著增加，使用DACA治疗后，小鼠下降到地板的总时间和转头时间显著降低。
[0086] 在实验进行第十四天的行为学测试中，MPTP治疗组小鼠在开放区域框内的总距离有所恢复，DACA治疗小鼠的行动距离已经恢复(如图5所示)。
[0087] 在爬杆实验中，与对照组相比，MPTP处理组下降到地板的总时间仍较高，使用各个浓度DACA继续治疗的小鼠下降到地板的总时间都呈现正常水平(如图5所示)。
[0088] 这些数据表明，DACA可以改善MPTP诱导的小鼠肌肉控制能力减弱和运动功能障碍。
[0089] 其中图4为，DACA改善第7天MPTP诱导的帕金森状小鼠行为学障碍结果图，包括小鼠在开放区域框内的总距离，开放区域框小鼠中心区域的停留时间和角落时间，小鼠爬杆落地时间。图5为DACA改善第14天MPTP诱导的帕金森状小鼠行为学障碍结果图，包括小鼠在开放区域框内的总距离和爬杆落地时间。(均值±SEM,n＝10；#p<0.05，##p<0.01vscontrol组；*p<0.05，**p<0.01vsMPTP组)
[0090] 应用例1～6
[0091] 在以下应用例中，选择常规试剂，并按照现有常规方法进行制剂制备，本应用例仅体现本发明所述化合物DACA够制备成不同的制剂，对具体试剂和操作不作具体限定∶[0092] 应用例1
[0093] 将实施例1制备的DACA，按常规口服液制备方法制成口服液。
[0094] 应用例2
[0095] 将实施例1制备的DACA，用DMSO溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为1.0～5.0mg/mL。
[0096] 应用例3
[0097] 将实施例1制备的DACA，用DMS0溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
[0098] 应用例4
[0099] 将实施例1制备的化DACA，按其与赋形剂质量比为8：2的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。
[0100] 应用例5
[0101] 将实施例1制备的DACA，按其与赋形剂质量比为8：2的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0102] 应用例6
[0103] 将实施例1制备的DACA，按其与赋形剂质量比为8：2的比例加入赋形剂，制成胶囊。
[0104] 由以上实施例可知，本发明提供了DACA及其制备方法和应用。本发明提供的DACA，+是一种松香烷型二萜。该类化合物对MPP 损伤的SH‑SY5Y细胞和原代神经元细胞具有神经保护作用，对MPTP诱导的帕金森状C57BL/6小鼠运动功能障碍具有改善作用。能够与可药用载体或赋型剂组成药物组合物，能够用于制备神经保护剂、帕金森病治疗药物或保健食品。
[0105] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
