技术领域
[0001] 本披露涉及CRISPR基因编辑领域，具体涉及一种Cas蛋白及其应用。
相关背景技术
[0002] CRISPR‑Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白系统（CRISPR‑Cas系统）可直接在细胞中对基因序列进行更改，是一种快速、有效的方法。
[0003] 本领域的很多研究人员都在致力于寻找新的Cas蛋白及CRISPR‑Cas基因编辑系统。
具体实施方式
[0099] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0100] 在本发明中，“多个”指代大于等于两个。
[0101] 在本发明中，氨基酸序列中的字母表示本领域公知的氨基酸的单字母缩写，例如J. Biol. Chem, 243, p3558（1968）中所述：丙氨酸：Ala‑A、精氨酸：Arg‑R、天冬氨酸：Asp‑D、半胱氨酸：Cys‑C、谷氨酰胺：Gln‑Q、谷氨酸：Glu‑E、组氨酸：His‑H、甘氨酸：Gly‑G、天冬酰胺：Asn‑N、酪氨酸：Tyr‑Y、脯氨酸：Pro‑P、丝氨酸：Ser‑S、甲硫氨酸：Met‑M、赖氨酸：Lys‑K、缬氨酸：Val‑V、异亮氨酸：Ile‑I、苯丙氨酸：Phe‑F、亮氨酸：Leu‑L、色氨酸：Trp‑W、苏氨酸：Thr‑T。
[0102] 在本发明中，“氨基酸差异”指的是蛋白的氨基酸序列上特定位点的氨基酸残基的差异，包括取代、增加或减少。
[0103] 本领域技术人员皆知，在蛋白或肽中，相邻的两个氨基酸各脱去一个OH或H、脱水缩合形成肽键，每一个氨基酸实际上是以氨基酸残基的形式存在的。因此本披露中，术语“氨基酸”和“氨基酸残基”通常代表同一意思。此外，为了简化表达，本披露中在氨基酸残基所处的位点前保留了取代前的氨基酸残基，位点前的字母表示原氨基酸残基，位点后的字母表示取代后的氨基酸残基。例如S211代表在211位点上原有的氨基酸残基为S，当它被R取代时，则可以表示为S211R。
[0104] 在本发明中，如果氨基酸被取代，则意指其被不同于原氨基酸残基的另一氨基酸残基取代。如果原氨基酸原属于带正电的氨基酸，其被取代为带正电的氨基酸，则意指其被另一不同于原氨基酸残基的带正电的氨基酸残基所取代。例如，原氨基酸残基为R，其被取代为带正电的氨基酸，则意指其被取代为H或K。
[0105] 序列的同一性
[0106] 如本文中所使用的，术语“同一性”（identity或percent identity）用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子中的每一个的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽中的每一个的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分比序列同一性”（percent identity）是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100%的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的序列同一性。通常，在将两个序列比对以产生最大序列同一性时进行比较。这样的比对可通过使用已公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于Clustal Ω、MAFFT、Probcons、T‑Coffee、Probalign、BLAST，本领域的普通技术人员可合理选择使用。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数，例如包括对所比较序列全长实现较优比对或最佳对比所需要的任何算法，以及对所比较序列的局部实现较优比对或最佳对比所需要的任何算法。
[0107] 蛋白结构域
[0108] 在一些实施方案中，所述Cas蛋白或Cas蛋白失活变体与同源或异源蛋白结构域共价连接或融合。
[0109] 在一些实施方案中，所述蛋白结构域任选自以下的一种或更多种：亚细胞定位信号、DNA结合域、蛋白酶结构域、转录激活域、转录抑制域、核酸酶结构域、脱氨酶结构域、尿嘧啶DNA糖基化酶结构域(UDG)、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制结构域(UGI)、甲基化酶、去甲基化酶、转录释放因子、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰化酶结构域、DNA连接酶、表位标签和报告域。
[0110] 在本发明的一些实施方案中，脱氨酶结构域任选自：APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)、来自七鳃鳗的CDA、经工程改造以作用于DNA的腺苷脱氨酶(TadA)的突变体。
[0111] 在一些实施方案中，所述转录激活结构域任选自：P65、VPR、VP16、VP64、VTR1、VTR2、VTR3、p65、MyoD1、HSF1、RTA、SET7/9和组蛋白乙酰转移酶。
[0112] 在一些实施方案中，所述转录抑制结构域任选自：KOX1、KAP‑1、MAD、FKHR、EGR‑1、ERD、SID、SID的串联体（例如SID4X）、TIEG、v‑ERB‑A、MBD2、MBD3、TRa、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、核激素受体(例如，雌激素受体或甲状腺激素受体)、DNMT家族成员(例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、MeCP2的KRAB结构域、ROM2和AtHD2A。
[0113] 在一些实施方案中，所述转录抑制结构域为来自KOX1蛋白的KRAB结构域。
[0114] 在一些实施方案中，所述核酸酶结构域任选自FokI、具有ssDNA切割活性的多肽、具有dsDNA切割活性的多肽。
[0115] 在一些实施方案中，所述甲基化酶结构域选自DNA甲基化酶，包括但不限于DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。
[0116] 在一些实施方案中，所述脱甲基酶选自TET1CD、TET1、ROS1、DME、DML2和DML3。
[0117] 甲基化和脱甲基化在本领域中公认为表观遗传性基因调节的重要方式。
[0118] 在一些实施方案中，所述同源或异源蛋白结构域为对于所述融合蛋白或缀合物的溶解、纯化或检测有用的序列标签。本文提供了适合的蛋白标签序列，这些序列包括但不限于生物素羧化酶载体蛋白(BCCP)标签、myc标签、钙调素标签、FLAG标签、血凝素(HA)标签、多组氨酸标签(也被称为His标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、nus标签、谷胱甘肽‑S‑转移酶(GST)标签、绿色荧光蛋白(GFP)标签、硫氧还蛋白标签、S‑标签、Softag(例如，Softag 1、Softag 3)、strep‑标签、生物素连接酶标签、FlAsH标签、V5标签和SBP标签。另外的适合的序列对本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。
[0119] 治疗应用
[0120] 本披露的另一方面涉及一种药物组合物，其包含如本发明所述的Cas蛋白、如本发明所述的指导RNA、如本发明所述的Cas蛋白失活变体、如本发明所述的融合蛋白或缀合物、如本发明所述的核酸、如本发明所述的CRISPR‑Cas系统、如本发明所述的载体系统、如本发明所述的递送系统或如本发明所述的细胞。所述药物组合物可以包含例如编码本文所述的Cas蛋白或Cas蛋白失活变体和指导RNA的AAV载体。所述药物组合物可以包含例如脂质纳米粒，该脂质纳米粒包含本文所述的指导RNA和编码Cas蛋白的mRNA。所述药物组合物可以包含例如包含本文所述的指导RNA和编码Cas蛋白的mRNA的慢病毒载体。所述药物组合物可以包含例如包含本文所述的指导RNA和Cas蛋白的病毒样颗粒或由所述指导RNA和Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物。
[0121] 本披露的另一方面涉及如本发明所述的Cas蛋白、如本发明所述的指导RNA、如本发明所述的融合蛋白或缀合物、如本发明所述的核酸、如本发明所述的CRISPR‑Cas系统或如本发明所述的载体系统在切割或编辑哺乳动物细胞中的靶核酸中的用途。
[0122] 本披露的另一方面涉及如本发明所述的Cas蛋白、如本发明所述的指导RNA、如本发明所述的融合蛋白或缀合物、如本发明所述的核酸、如本发明所述的CRISPR‑Cas系统或如本发明所述的载体系统在以下任一项的用途：切割一种或更多种靶核酸分子或使一种或更多种靶核酸分子产生切口，激活或上调一种或更多种靶核酸分子的表达，激活或抑制一种或更多种靶核酸分子的转录，使一种或更多种靶核酸分子失活，可视化、标记或检测一种或更多种靶核酸分子，结合一种或更多种靶核酸分子，运输一种或更多种靶核酸分子，以及掩蔽一种或更多种靶核酸分子。
[0123] 本披露的另一方面涉及如本发明所述的Cas蛋白、如本发明所述的指导RNA、如本发明所述的融合蛋白或缀合物、如本发明所述的核酸、如本发明所述的CRISPR‑Cas系统或如本发明所述的载体系统修饰一种或更多种靶核酸分子的用途，所述修饰一种或更多种靶核酸分子包括以下中的一种或更多种：核酸碱基取代、核酸碱基缺失、核酸碱基插入、靶核酸的断裂、核酸甲基化和核酸去甲基化。
[0124] 本披露的另一方面涉及如本发明所述的Cas蛋白、如本发明所述的指导RNA、如本发明所述的融合蛋白或缀合物、如本发明所述的核酸、如本发明所述的CRISPR‑Cas系统或如本发明所述的载体系统在诊断、治疗或预防与靶核酸相关的疾病或病症中的用途。
[0125] 本披露的另一方面涉及涉及如本发明所述的Cas蛋白、如本发明所述的指导RNA、如本发明所述的融合蛋白或缀合物、如本发明所述的核酸、如本发明所述的CRISPR‑Cas系统或如本发明所述的载体系统在制备用于诊断、治疗或预防疾病的药物中的用途。
[0126] 本披露的另一方面涉及涉及如本发明所述的Cas蛋白、如本发明所述的指导RNA、如本发明所述的融合蛋白或缀合物、如本发明所述的核酸、如本发明所述的CRISPR‑Cas系统或如本发明所述的载体系统在制备用于诊断、治疗或预防与靶核酸相关的疾病的药物中的用途。
[0127] 在一些实施方案中，将药物组合物体内递送至人类受试者。所述药物组合物可以通过任何有效途径递送。示例性给药途径包括但不限于静脉内输注、静脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、瘤内注射、皮下注射、皮内注射、心室内注射、血管内注射、小脑内注射、眼内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、前房内注射、鼓室内注射、鼻内给药和吸入。
[0128] 实施例
[0129] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0130] 实施例1. Cas蛋白的制备与纯化
[0131] 发明人通过生物信息学分析、结合AI，发现了2个新的Cas12蛋白，命名为Cas12i‑Z1、Cas12i‑Z2。
[0132] >Cas12i‑Z1蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1）：
[0133] MTHYVDPTRVAYWDQMPPDITACPNIQFQNSVPPNLAIPCQATLTYAVATYIRTIQATYVNPQAPFITATYISPQFATNVNPQAPFITATYISPNFATNVNPQAPFITATYVSPNFATNVNPQAPFITATYISPAQVTNINPQAPFITATYVSPNFATNVNPQAPFITATYISPAQVTNINPQAPNIQFNSIQNINITNPNVSIQNATNAQFYNPVFQFNSIQFINVTYPTVLQYQTNEVKVPTQFPTNISSTYFAFAPQYFPQTQSPNIFAFAPTDTPSIQSTQYFAFVPTLFPYTQSPNFFAFAPTPTPSYQSTQYFNFVPVQFPYTQSPTDFAFVPQTFPQTQSPNPTVPVPVTGPSLDSPTNFAFVPYTFFYTPSPAPFAFAPIQFPQNTSPFYNVFIPYTFPSNQSQFTYNVVGFHCQPIEQNTLTPILAKCARQDNTYTQPIAHLQTPNYEVNYQDTVSAQFATNAQFYVPNFQFNKIQFINVTNPNLSIQNATNAQFYNPNFQFNSIQFINVTYPTVLQYQTNAVKVPTQFPVNTSSNYFAFVPQPFPSLNSPDHFATVPQTFPSTQSTNRNAFVPYINPSTNSPTLFATVPDIFPSQHSPNTFVFVPTDFPKNQSPAFTAFVPELTPQAPSITYTAFVPQLFPSIQSPFYFAFIPYTFPSNQSQFTYVAVQFTFNFIQNAATPIYAKCARQDFTYTQPIAHLQTPNTEVNYQDTVSAQFATNVNFYMPNFQMNSIQFINVTYTPILQCQNSEVKVPTQFPENTSSTYFAFVPDEFPSTQSPTFFVFVPIWFPRYQSPVQNAFIPYTFPQTQSPNPTVPVPVTGPEIDSPIPFAFVPTYFFYTPSPEPFAFAPQTFPQNTSPFYFAFVPYTFPSNTSQFTYVAVGFHCTPVNTPFTPILVKCASFPNPNTPTIKYQNPNTEVNYDPFKNLAAQHCNQCEKHIAHFGIEPCEFPAYYRPVPNVDPTYNSVEICDYAKHVFTELNVSANCVYQPNARNIQFTYATIQTLNAYPTYPELYWHAYPKRMTVEAECDKTFANAQPDPCYRWVPT
[0134] >Cas12i‑Z2蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2）：
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
[0136] Cas12i‑Z1蛋白对应的DR序列（SEQ ID NO: 3）：
[0137] AGAGAGTTCGCGTAGTTCTGTAGTGTGGAACTTGAGAC。
[0138] Cas12i‑Z2蛋白对应的DR序列（SEQ ID NO: 4）：
[0139] GCCGGTAGTAATCCCCGAGCTCAGCGCAGCCGGATG。
[0140] 1、载体构建
[0141] pET28a载体质粒经BamHI和XhoI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收线性化的载体。在外包服务公司合成获得含Cas蛋白（Cas12i‑Z1和Cas12i‑Z2）的编码序列的DNA核酸（SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6），经BamHI和XhoI双酶切后通过T4连接酶与上述线性化pET28a载体连接，构建得到重组载体pET28a‑Cas12i‑Z1（SEQ ID NO: 7）和pET28a‑Cas12i‑Z2（SEQ ID NO: 8）。反应液转化Stbl3感受态，涂布硫酸卡那霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养后，挑取克隆测序鉴定。
[0142] 挑取序列正确的阳性克隆过夜培养，提取质粒后转化表达菌株Rosetta(DE3)，涂布含硫酸卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。
[0143] 2、蛋白表达
[0144] 挑取单克隆接种至5mL含硫酸卡那霉素的LB培养液，37℃过夜培养。
[0145] 以1:100比例转接种500mL含硫酸卡那霉素的LB培养液中，以220rpm的转速，37℃培养至OD 0.6，加IPTG至终浓度0.2mM，16℃诱导24h。
[0146] 15mL PBS漂洗，离心收集菌体，加裂解缓冲液超声破碎，10000g离心30min获得含重组蛋白的上清液，上清经过0.45μm滤膜过滤后上柱纯化。
[0147] 3、蛋白纯化
[0148] 以N端的6个His作为纯化标签，通过ProPac™ IMAC‑10 HPLC色谱柱纯化（洗脱液A为20 mM HEPES + 0.5 M NaCl, 25 mM咪唑, pH = 7.5；洗脱液B为20 mM HEPES + 0.5 M NaCl, 500 mM咪唑, pH = 7.5。洗脱梯度为A/B 100%/0%至0%/100%；流速0.5 mL/min，UV 280 nm检测）。得到Cas12i‑Z1和Cas12i‑Z2的重组蛋白（重组蛋白结构为His tag‑NLS‑Cas‑NLS‑NLS），序列分别为SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10。纯化的重组蛋白经过SDS‑PAGE电泳检测确定，为单一条带。
[0149] 实施例2. 确定Cas蛋白识别的PAM序列
[0150] 本实施例中，将包含有特异指导序列的sgRNA（single guide RNA）以及实施例1纯化的重组蛋白混合，对体外切割底物（包含间隔序列和7nt随机序列）进行切割，37℃孵育后纯化，建库，进行NGS测序、分析确定Cas蛋白识别的PAM序列。
[0151] 设计的体外切割底物序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0152] 序列中N代表A、T、C、G任意一种。
[0153] 取切割底物至测序公司进行PCR‑Free文库构建及NGS测序。
[0154] sgRNA的制备
[0155] 在含有T7 RNA转录酶、四种三磷酸核糖核苷酸以及带T7启动子的DNA模板体系中37℃体外转录合成包含特异指导序列的sgRNA，转录产物用LiCl进行沉淀、纯化。
[0156] sgRNA序列为：
[0157] Cas12i‑Z1‑sgRNA（SEQ ID NO: 12）、Cas12i‑Z1‑sgRNA‑Rev（SEQ ID NO: 13）、[0158] Cas12i‑Z2‑sgRNA（SEQ ID NO: 14）、Cas12i‑Z2‑sgRNA‑Rev（SEQ ID NO: 15）。
[0159] PAM库切割
[0160] 配制含Cas12i‑Z1重组蛋白(约10mg/mL，0.5μL)、2.8 μg Cas12i‑Z1‑sgRNA或Cas12i‑Z1‑sgRNA‑Rev、体外切割底物(60 ng/μL，36μL)和缓冲液(200 mM HEPES, 1M NaCl, 50mM MgCl2, 1mM EDTA；5μL)的反应体系，37℃反应3h，75℃ 15 min。
[0161] 配制含Cas12i‑Z2重组蛋白(约10mg/mL，0.5μL)、2.8 μg Cas12i‑Z2‑sgRNA或Cas12i‑Z2‑sgRNA‑Rev、体外切割底物(60 ng/μL，36μL)和缓冲液(200 mM HEPES, 1M NaCl, 50mM MgCl2, 1mM EDTA；5μL)的反应体系，37℃反应3h，75℃ 15 min。
[0162] T4 DNA Polymerase处理、将切割产物补平
[0163] 向完成切割的产物中添加T4 DNA Polymerase(Thermo Scientific)，37℃反应20min，85℃ 10min。
[0164] 3’末端加A以及添加生物素标记接头
[0165] a.向T4 DNA Polymerase反应产物中添加78μL SPRISelect Beads(Beckman COULTER)混匀，室温放置5min，将产物移至磁力架吸附5min，移取上清至新的1.5mL管；再添加39μL SPRISelect Beads(Beckman COULTER)混匀，室温放置5min，将产物移至磁力架吸附5min，弃去上清，利用85%乙醇洗涤2次，室温放置10min风干，添加50μL ddH2O洗脱。
[0166] b.利用SynplSeq DNA Library Prep Kit for Illumina建库Kit对a中产物进行3’加A，37℃ 10min，65℃ 20min，4℃ ∞。
[0167] c.由上游引物5’Biosg/gttgacatgctggattgagacttcctacactctttccctacacgacgctcttccgatc*t（SEQ ID NO: 16），*代表t碱基上有硫代磷酸酯修饰[phosphorothioate]，和下游引物gatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtgtaggaagtctcaatccagcatgtcaac（SEQ ID NO: 17）退火获得Adapter 1。添加Adapter 1，20℃ 30min，16℃过夜反应。反应产物利用SPRISelect Beads进行纯化。
[0168] d.利用链霉亲和素标记的磁珠Dynabeads® M‑280 Streptavidin(Invitrogen)对反应产物进行纯化。
[0169] e.Recover PCR
[0170] 设计引物，利用Q5® Hot Start High‑Fidelty 2x Master Mix (NEB)进行Recover PCR反应。
[0171] Recover PCR引物F：ggagttcagacgtgtgctc(SEQ ID NO: 18)
[0172] Recover PCR引物R：gttgacatgctggattgagacttc(SEQ ID NO: 19)
[0173] f.Recover PCR产物移至磁力架，吸附5min，将上清移至新的1.5mL离心管，取3μL Recovery PCR产物，添加148.5μL ddH2O稀释。
[0174] g.Index PCR
[0175] 选用引物，进行Index PCR。
[0176] Index PCR引物IF501：
[0177] aatgatacggcgaccaccgagatctacactatagcctacactctttccctacacgacg(SEQ ID NO: 20)
[0178] Index PCR引物IR701：
[0179] caagcagaagacggcatacgagatcgagtaatgtgactggagttcagacgtgtgctc(SEQ ID NO: 21).
[0180] h.Index PCR 产物添加0.7x SPRISelect Beads进行产物纯化，添加38μL ddH2O进行洗脱，利用Qubit进行浓度测定，送NGS测序。
[0181] NGS结果分析：参考文献（A compact Cas9 ortholog from Staphylococcus Auricularis (SauriCas9) expands the DNA targeting scope. PLoS biology, 2020,18(3), e3000686.）方法用WebLogo软件分析，得到所抓取的7nt随机序列。由此鉴定出PAM序列：Cas12i‑Z1识别的PAM序列为5’‑TTN‑3’，Cas12i‑Z2识别的PAM序列为5’‑TTN‑3’。
[0182] 实施例3.
[0183] 在外包服务公司构建得到Cas12i‑Z1‑N2‑Target质粒（SEQ ID NO: 23），并合成得到可靶向该质粒的sgRNA（SEQ ID NO: 22，N2‑sgRNA）。利用XmnI(NEB，R0194)酶对Cas12i‑Z1‑N2‑Target质粒进行酶切线性化，37℃反应完成后，利用Wizard® SV Gel and PCR Clean‑Up System(Progema，A9282)进行产物纯化，并用Nanodrop测定浓度。
[0184] 使用如实施例1方法制备得到的Cas12i‑Z1重组蛋白(10mg/mL 0.5μL)、上述线性化质粒(140 ng/μL，18μL)、N2‑sgRNA(180ng/μL，15μL)、10xCut Buffer (200 mM HEPES/1M NaCl/50mM MgCl2/1mM EDTA，5μL)，混合后加超纯水至50μL。37℃反应1h。75℃水浴10min。
[0185] 向反应产物添加6μL上样缓冲液，取30μL电泳检测，在1000‑2000bp处观察到了切割片段的存在，证明了Cas12i‑Z1蛋白切割了靶核酸。
