[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体是狭叶落地梅中抗炎活性化合物的提取及分离方法与应用。

[0002] 追风伞Lysimachiaparidiformis var.stenophyllaFranch.系报春花科(Primulaceae)珍珠菜属(Lysimachia L.)植物，学名狭叶落地梅，全株均可入药，主分布于我国西南地区，是贵州苗族等少数民族的常用药。具有袪风活络，活血止痛的功效，常用于治疗风湿痹痛、半身不遂、四肢拘挛、小儿惊风、跌打损伤等疾病。

[0003] 但目前追风伞化学成分研究还不够深入，尤其是对于追风伞化学成分的研究较少，而化学成分是中药发挥其传统功效的物质基础。由于中药具有“多成分、多靶点、多途径协同作用”的特点，其基础研究仍有许多难点。因此，为进一步探究追风伞中的药效物质，后期对该药材的化学成分研究还需继续，同时还需结合代谢组学、网络药理学等学科进行体内外药效研究，争取进一步从追风伞中分离出各种化学成分并确认其药效、落实其应用方向。

[0045] 下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

[0046] 实施例1

[0047] 追风伞化学成分的研究

[0048] 1仪器和材料

[0049] 1.1药材来源

[0050] 药材采购于贵州省余庆县关兴镇，经贵州中医药大学吴之坤副教授鉴定为报春花科(Primulaceae)珍珠菜属(Lysimachia L.)植物狭叶落地梅(Lysimachiaparidiformis var.stenophylla Franch.)的全草。样品经自然阴干后，将其粉碎后备用。目前原植物留样存放于贵州中医药大学中药民族药重点实验室。

[0051] 1.2仪器

[0052] 本实验所用仪器详见表1‑1所示。

[0053] 表1‑1实验仪器

[0054]

[0055] 1.3试剂与填料

[0056] 本实验所用试剂与填料详见表1‑2所示。

[0057] 表1‑2实验试剂与填料

[0058]

[0059]

[0060] 注：本实验所用显色剂：10％硫酸乙醇溶液、碘单质。

[0061] 2实验方法与结果

[0062] 2.1追风伞药材的提取与分离

[0063] 取狭叶落地梅全草粗粉(60～80目)35.58kg，依次采用100、90、70％的甲醇水溶剂进行常温浸渍提取，每种溶剂各提两次，每次5天(甲醇水用量与狭叶落地梅全草的体积比为1∶1.5)，合并多次提取液，减压浓缩至无醇味即得狭叶落地梅总浸膏(6.96kg，出膏率为19.56％)。将总浸膏加适量热水分散后，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压回收得到石油醚部位993g、乙酸乙酯部位328g、正丁醇部位4.04kg。

[0064] 乙酸乙酯部位经MCI柱层析进行脱色处理，采用甲醇‑水系统(50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0)梯度洗脱，所得流分经TLC检测后合并得到7个部分(Fr.A～Fr.F)。

[0065] Fr.A部分(71g)通过硅胶柱层析进行分离纯化，以二氯甲烷‑甲醇系统(100∶1、50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1)梯度洗脱，经TLC检识合并分为6个组分(Fr.A1～Fr.A6)。

[0066] Fr.A2经硅胶柱色谱，二氯甲烷‑甲醇系统(50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1)梯度洗脱，经TLC检识合并分为3个组分(Fr.A2‑1～Fr.A2‑3)。Fr.A2‑1经硅胶柱层析进行分离纯化，以石油醚‑乙酸乙酯系统(50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1)梯度洗脱，通过TLC检测合并得到含化合物1浓度较高的粗品，后再通过重结晶手段纯化得到化合物1。

[0067] Fr.A4经硅胶柱色谱，二氯甲烷‑甲醇系统(50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)梯度洗脱得到化合物2。

[0068] Fr.B部分(25g)通过硅胶柱层析进行分离纯化，以二氯甲烷‑甲醇系统(50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)梯度洗脱，经TLC检识合并分为7个组分(Fr.B1～Fr.B7)。Fr.B1经硅胶柱色谱，石油醚‑乙酸乙酯系统(50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1)梯度洗脱，所得流分经TLC检测后合并得到3个组分(Fr.B1‑1～Fr.B1‑3)。Fr.B1‑1经硅胶柱色谱，石油醚‑乙酸乙酯系统(30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1)梯度洗脱得到化合物3。

[0069] Fr.B1‑2经Sephadex LH‑20凝胶柱色谱，二氯甲烷‑甲醇(1∶1)洗脱，纯化得到化合物4。

[0070] Fr.C部分(11.3g)通过硅胶柱层析进行分离纯化，以石油醚‑乙酸乙酯系统(30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)梯度洗脱得到化合物5。

[0071] Fr.D部分(13.5g)通过硅胶柱色谱，石油醚‑乙酸乙酯系统(50∶1、30∶1、15∶1、10∶1、5∶1、3∶1)梯度洗脱得到化合物6。

[0072] Fr.E部分(50g)通过硅胶柱色谱，石油醚‑乙酸乙酯系统(30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)梯度洗脱得到化合物7。

[0073] 2.2化合物结构鉴定

[0074] 化合物分离纯化后通过理化性质和核磁共振(NMR)、单晶衍射(X‑Ray)等分析方法，并借助微谱数据库等进行结构鉴定。

[0075] 1、化合物1的结构鉴定

[0076] 化合物1为无色针状结晶(甲醇)。易溶于DMSO、甲醇，微溶乙酸乙酯、二氯甲烷，不溶石油醚。TLC检测：以二氯甲烷‑甲醇(20∶1)为展开剂，展开后在紫外254、365nm波长下均有荧光；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃下加热后不显斑点，熏碘后显单一黄色斑点(Rf值为1
0.53)，分子式为C11H10O4。根据H‑NMR(400MHz，CD3OD)可知δH 7.36(1H，s，H‑5)、6.71(1H，s，H‑8)显示为苯环上的氢，δH 7.83(1H，d，J＝9.4Hz，H‑4)、6.17(1H，d，J＝9.4Hz，H‑3)显示有
13
1对双键。根据 C‑NMR(100MHz，CD3OD)数据显示该化合物含有11个碳原子。δC 131.2(C‑5)、
125.3(C‑6)、161.3(C‑7)、102.9(C‑8)、155.8(C‑9)、112.2(C‑10)显示是苯环上的碳信号，δC 113.0(C‑3)、146.2(C‑4)显示有1对双键，δC 163.9(C‑2)显示有一个羰基，综上可初步推测该化合物为苯丙素类化合物。根据上述数据对其结构进行解析，并结合单晶衍射技术验
1 13
证后确定该化合物为Phellodenol‑A，该化合物的H‑NMR和 C‑NMR数据见下表所示。

[0077]

[0078] Datawere recorded in CD3OD on aBrukerAV‑400MHz spectrometer.

[0079] 化合物1的结构式如下所示：

[0080]

[0081] 化合物1的晶体结构如下所示：

[0082]

[0083] 化合物1的晶体数据：Crystal data：Pn(No.7)，M＝206.19，monoclinic，α＝90.00°，β＝96.5562
(3)°，γ＝90°， T＝273(2)K，Z＝2，Rgt(F)＝0.0512，wRref(F )＝
0.1249。

[0084] 2、化合物2的结构鉴定

[0085] 化合物2为无色的针状结晶(甲醇)。易溶于甲醇，微溶乙酸乙酯，不溶二氯甲烷、石油醚。TLC检测：以二氯甲烷‑甲醇(10∶1)为展开剂，展开后在紫外254nm波长下有荧光，而在365nm波长下无荧光；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃下加热后显单一紫色斑点(Rf值为
1
0.51)，分子式为C22H28O9。根据H‑NMR(600MHz，CD3OD)可知δH 6.76(4H，s，H‑2，2'，6，6')显示为苯环上的氢，δH 3.88(12H，s，3，3'，5，5'‑OCH3)显示为甲氧基，再根据其两个氢信号的强
13
度和积分个数提示其结构可能为对称结构。根据 C‑NMR(150MHz，CD3OD)数据显示该化合物含有22个碳原子。δC 146.3(C‑3，3'，5，5')、136.2(C‑4，4')、134.2(C‑1，1')、104.8(C‑2，
2'，6，6')显示是苯环上的碳信号，δC56.8(3，3'，5，5'‑OCH3)显示有四个甲氧基，综上可初步推测该化合物为苯丙素类化合物。根据以上数据与文献报道基本一致，故该化合物鉴定为
1 13
华中冬青素，该化合物的H‑NMR和 C‑NMR数据见下表所示。

[0086]

[0087]

[0088] Datawere recorded in CD3OD on aBrukerAV‑600MHz spectrometer.

[0089] 化合物2的结构式如下所示：

[0090]

[0091] 3、化合物3的结构鉴定

[0092] 化合物3：无色针状结晶(甲醇)。易溶于热甲醇，微溶乙酸乙酯，不溶石油醚。TLC检测：以二氯甲烷‑甲醇(15∶1)为展开剂，展开后在紫外254nm波长下有荧光，而在365nm波长下无荧光；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃下加热后显单一黄色斑点(Rf值为0.61)，分子式1
为C19H21N3O2。根据 H‑NMR(400MHz，CD3OD)可知δH 7.44(1H，dt，J＝8.1，1.0Hz，H‑7)、7.24～
7.28(1H，m，H‑4)、7.14(1H，ddd，J＝8.1，7.0，1.4Hz，H‑6)、7.08(1H，td，J＝7.5，7.1，1.4Hz，H‑5)显示为苯环上的氢，δH 7.22(1H，s，H‑8)、6.12(1H，dd，J＝17.3，10.7Hz，H‑17)、5.12～
5.14(1H，m，H‑18a)、5.10(1H，dd，J＝9.8，1.1Hz，H‑18b)显示有2组双键，δH 4.23(1H，q，J＝
7.0Hz，H‑12)显示为连氮碳上的氢信号，δH 1.56(3H，s，H‑19)、1.55(3H，s，H‑20)、1.54(3H，
13
d，J＝7.0Hz，H‑15)显示有3个甲基。根据 C‑NMR(100MHz，CD3OD)数据显示该化合物含有19个碳原子。δC 127.3(C‑3a)、119.9(C‑4)、121.2(C‑5)、122.6(C‑6)、112.7(C‑7)、136.8(C‑
7a)显示是苯环上的碳信号，δC 162.3(C‑10)、168.7(C‑13)显示有2个羰基，综上可初步推测该化合物为生物碱类化合物。根据以上数据与文献报道基本一致，故该化合物鉴定为新
1 13
海胆灵A，该化合物的H‑NMR和 C‑NMR数据见下表所示。

[0093]

[0094] Datawere recorded in CD3OD on aBrukerAV‑400MHz spectrometer.

[0095] 化合物3的结构式如下所示：

[0096]

[0097] 4、化合物4的结构鉴定

[0098] 化合物4为无色的针状结晶(甲醇)。易溶于甲醇，微溶氯仿和乙酸乙酯，不溶于石油醚。TLC检测：以二氯甲烷‑甲醇(10∶1)为展开剂，展开后在紫外254、365nm波长下均具有荧光；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃下加热后显单一肉桂色斑点(Rf值为0.49)，分子式为1
C11H12O4。根据 H‑NMR(400MHz，CD3OD)可知δH 7.61(1H，d，J＝8.5Hz，H‑6)、6.50(1H，d，J＝
2.4Hz，H‑3)、6.46(1H，dd，J＝8.5，2.4Hz，H‑5)显示为苯环上的氢，δH 7.06(1H，d，J＝
12.6Hz，H‑7)、5.80(1H，d，J＝12.6Hz，H‑8)显示有一对双键，δH 3.81(1H，s，2‑OCH3)、3.80
13
(1H，s，4‑OCH3)显示有2个甲氧基。根据 C‑NMR(100MHz，CD3OD)数据显示该化合物含有11个碳原子。δC 163.6(C‑4)、160.3(C‑2)、132.9(C‑6)、118.5(C‑5)、105.5(C‑5)、98.6(C‑3)显示是苯环上的碳信号，δC 170.6(‑COOH)显示有一个羧基，综上可初步推测该化合物为苯丙素类化合物。根据上述数据对其结构进行解析，并结合单晶衍射技术验证后确定该化合物
1 13
为2,4‑二甲氧基肉桂酸，该化合物的H‑NMR和 C‑NMR数据见下表所示。

[0099]

[0100] Datawere recorded in CD3OD on aBrukerAV‑600MHz spectrometer.

[0101] 化合物4的结构式如下所示：

[0102]

[0103] 化合物4的晶体结构如下所示：

[0104]

[0105] 化合物4的晶体数据：Crystal data：P‑1(No.2)，M＝208.21，triclinic，α＝79.855(2)°，β＝86.800(2)°，γ＝80.295(2)°， T＝273(2)K，Z＝2，Rgt(F)＝0.0483，
2
wRref(F)＝0.1204。

[0106] 5、化合物5的结构鉴定

[0107] 化合物5为黄色粉末。易溶于DMSO，难溶甲醇、不溶乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚。TLC检测：以二氯甲烷‑甲醇(10∶1)为展开剂，展开后在紫外254、365nm波长下均有荧光；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃下加热后显单一肉桂色斑点(Rf值为0.53)，分子式为C14H10O5。
1
根据H‑NMR(600MHz，DMSO‑d6)可知δH 7.23(1H，d，J＝2.1Hz，H‑10)、6.71(1H，d，J＝2.6Hz，H‑2)、6.63(1H，d，J＝2.5Hz，H‑4)、6.36(1H，d，J＝2.0Hz，H‑8)显示为苯环上的氢，δH 2.69
13
(3H，s，‑CH3)显示有一个甲基。根据 C‑NMR(150MHz，DMSO‑d6)数据显示该化合物含有14个碳原子。δC 138.3(C‑1)、117.5(C‑2)、158.4(C‑3)、101.6(C‑4)、152.6(C‑4a)、97.4(C‑6a)、
164.1(C‑7)、100.9(C‑8)、165.4(C‑9)、104.3(C‑10)、138.1(C‑10a)、109.0(C‑10b)显示是苯环上的碳信号，δC 164.7(C‑6)显示有1个羰基，δC25.2(‑CH3)显示有1个甲基，综上可初步推测该化合物为苯丙素类化合物。根据以上数据与文献报道基本一致，故该化合物鉴定为
1 13
交链孢酚，该化合物的H‑NMR和 C‑NMR数据见下表所示。

[0108]

[0109] Datawere recorded inDMSO‑d6on aBrukerAV‑600MHz spectrometer.

[0110] 化合物5的结构式如下所示：

[0111]

[0112] 6、化合物6的结构鉴定

[0113] 化合物6为白色粉末。易溶于DMSO，能溶二氯甲烷‑甲醇(1∶1)，难溶甲醇、不溶乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚。TLC检测：以二氯甲烷‑甲醇(30∶1)为展开剂，展开后在紫外254、365nm波长下均有荧光；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃下加热后显单一肉桂色斑点(Rf值为
1
0.41)，分子式为C15H12O5。根据H‑NMR(400MHz，DMSO‑d6)可知δH 7.25(1H，s，H‑10)、6.85(2H，s，H‑2，4)、6.38(1H，s，H‑8)显示为苯环上的氢，δH 3.83(3H，s，‑OCH3)显示有一个甲氧基，δH 
13
2.72(3H，s，‑CH3)显示有一个甲基。根据 C‑NMR(100MHz，DMSO‑d6)数据显示该化合物含有
15个碳原子。δC 138.2(C‑1)、116.6(C‑2)、159.7(C‑3)、101.2(C‑4)、152.6(C‑4a)、97.6(C‑
6a)、164.1(C‑7)、99.9(C‑8)、165.4(C‑9)、104.6(C‑10)、137.8(C‑10a)、110.2(C‑10b)显示是苯环上的碳信号，δC 164.6(C‑6)显示有1个羰基，δC55.6(‑OCH3)显示有1个甲氧基，δC25.2(‑CH3)显示有1个甲基，综上可初步推测该化合物为苯丙素类化合物。根据以上数据
1 13
与文献报道基本一致，故该化合物鉴定为交链孢酚单甲醚，该化合物的H‑NMR和 C‑NMR数据见下表所示。

[0114]

[0115] Datawere recorded inDMSO‑d6on aBrukerAV‑400MHz spectrometer.

[0116] 化合物6的结构式如下所示：

[0117]

[0118] 7、化合物7的结构鉴定

[0119] 化合物7为白色粉末。易溶于二氯甲烷，微溶甲醇、石油醚。TLC检测：以石油醚‑乙酸乙酯(5∶1)为展开剂，展开后在紫外254、365nm波长下均有荧光；喷以10％硫酸乙醇溶液，1
105℃下加热后显单一橙色斑点(Rf值为0.47)，分子式为C16H14O5。根据 H‑NMR(600MHz，CDCl3)可知δH 7.29(1H，d，J＝6.7Hz，H‑10)、6.73(2H，d，J＝4.4Hz，H‑2，4)、6.53(1H，d，J＝
2.5Hz，H‑8)显示为苯环上的氢，δH 3.91(3H，s，9‑OCH3)、3.85(3H，s，3‑OCH3)显示有2个甲氧
13
基，δH 2.79(3H，s，‑CH3)显示有1个甲基。根据 C‑NMR(150MHz，CDCl3)数据显示该化合物含有15个碳原子。δC 138.3(C‑1)、117.0(C‑2)、160.1(C‑3)、100.1(C‑4)、153.3(C‑4a)、99.5(C‑6a)、165.5(C‑7)、99.1(C‑8)、166.6(C‑9)、104.7(C‑10)、138.1(C‑10a)、111.0(C‑10b)显示是苯环上的碳信号，δC 165.3(C‑6)显示有1个羰基，δC55.7(3‑OCH3)、55.8(9‑OCH3)显示有2个甲氧基，δC25.9(‑CH3)显示有1个甲基，综上可初步推测该化合物为苯丙素类化合物。根据以上数据与文献报道基本一致，故该化合物鉴定为交链孢酚‑3,9‑二甲醚，该化合
1 13
物的H‑NMR和 C‑NMR数据见下表所示。

[0120]

[0121] Datawere recorded in CDCl3 on aBrukerAV‑600MHz spectrometer.

[0122] 化合物7的结构式如下所示：

[0123]

[0124] 2.3化合物的部分理化常数和波谱数据

[0125] Phellodenol‑A(1)：无色针状结晶(甲醇)。二氯甲烷‑甲醇(20∶1)展开，熏碘后显1
单一黄色斑点(Rf值为0.53)。H‑NMR(400MHz，CD3OD)δ7.83(1H，d，J＝9.4Hz，H‑4)，7.36(1H，s，H‑5)，6.71(1H，s，H‑8)，6.17(1H，d，J＝9.4Hz，H‑3)，3.78(2H，t，J＝6.8Hz，H‑2')，2.87
13
(2H，t，J＝6.8Hz，H‑1')；C‑NMR(100MHz，CD3OD)δ163.9(C‑2)，113.0(C‑3)，146.2(C‑4)，
131.2(C‑5)，125.3(C‑6)，161.3(C‑7)，102.9(C‑8)，155.8(C‑9)，112.2(C‑10)，34.3(C‑
1')，62.4(C‑2')。Crystal  data：Pn(No.7)，M＝206.19，monoclinic，
α＝90.00°，β＝96.556
2
(3)°，γ ＝90°， T＝273(2)K，Z＝2，Rgt(F)＝0.0512，wRref(F )＝
0.1249。

[0126] 华中冬青素(2)：白色的针状结晶(甲醇)。二氯甲烷‑甲醇(10∶1)展开，10％硫酸乙1
醇溶液显单一紫色斑点(Rf值为0.51)。H‑NMR(600MHz，CD3OD)δ6.76(4H，s，H‑2，2'，6，6')，
4.89(2H，d，J＝8.2Hz，H‑7，7')，3.88(12H，s，2.0Hz，3，3'，5，5'‑OCH3)，3.73(2H，dd，J＝
13
11.2，3.3Hz，H‑9')，3.65(2H，dd，J＝11.2，4.6Hz，H‑9)，2.34(2H，q，J＝4.3Hz，H‑8，8')；C‑NMR(150MHz，CD3OD)δ134.2(C‑1)，104.8(C‑2)，149.3(C‑3)，136.2(C‑4)，149.3(C‑5)，
104.8(C‑6)，84.6(C‑7)，55.2(C‑8)，61.7(C‑9)，134.2(C‑1')，104.8(C‑2')，149.3(C‑3')，
136.2(C‑4')，149.3(C‑5')，104.8(C‑6')，84.6(C‑7')，56.8(C‑8')61.7(C‑9')，56.8(3‑OCH3)，56.8(5‑OCH3)，56.8(3'‑OCH3)，56.8(5'‑OCH3)。

[0127] 新海胆灵A(3)：无色针状结晶(甲醇)。二氯甲烷‑甲醇(15∶1)展开，10％硫酸乙醇1
溶液显单一黄色斑点(Rf值为0.61)。H‑NMR(400MHz，CD3OD)δ7.44(1H，dt，J＝8.1，1.0Hz，H‑
7)，7.24～7.28(1H，m，H‑4)，7.22(1H，s，H‑8)，7.14(1H，ddd，J＝8.1，7.0，1.4Hz，H‑6)，7.08(1H，td，J＝7.5，7.1，1.4Hz，H‑5)，6.12(1H，dd，J＝17.3，10.7Hz，H‑17)，5.12～5.14(1H，m，H‑18a)，5.10(1H，dd，J＝9.8，1.1Hz，H‑18b)，4.23(1H，q，J＝7.0Hz，H‑12)，1.56(3H，s，H‑
13
19)、1.55(3H，s，H‑20)、1.54(3H，d，J＝7.0Hz，H‑15)；C‑NMR(100MHz，CD3OD)δ146.0(C‑2)，
104.3(C‑3)，127.3(C‑3a)，119.9(C‑4)，121.2(C‑5)，122.6(C‑6)，112.7(C‑7)，136.8(C‑
7a)，114.3(C‑8)，124.7(C‑9)，162.3(C‑10)，52.6(C‑12)，168.7(C‑13)，20.7(C‑15)，40.5(C‑16)，146.2(C‑17)，112.6(C‑18)，28.1(C‑19)，28.2(C‑20)。

[0128] 2,4‑二甲氧基肉桂酸(4)：无色的针状结晶(甲醇)。二氯甲烷‑甲醇(10∶1)展开，1
10％硫酸乙醇溶液显单一肉桂色斑点(Rf值为0.49)。H‑NMR(400MHz，CD3OD)δ7.61(1H，d，J＝8.5Hz，H‑6)，7.06(1H，d，J＝12.6Hz，H‑7)，6.50(1H，d，J＝2.4Hz，H‑3)，6.46(1H，dd，J＝
8.5，2.4Hz，H‑5)，5.80(1H，d，J＝12.6Hz，H‑8)，3.81(1H，s，2‑OCH3)，3.80(1H，s，4‑OCH3)；
13
C‑NMR(100MHz，CD3OD)δ118.5(C‑1)，160.3(C‑2)，98.6(C‑3)，163.6(C‑4)，105.5(C‑5)，
132.9(C‑6)，139.1(C‑7)，118.0(C‑8)，170.6(‑COOH)，55.9(2‑OCH3)、55.8(4‑OCH3)。
Crystal  data：P‑1(No.2)，M＝208.21，triclinic，
α＝79.855(2)°，β＝86.800(2)°，γ＝80.295
2
(2)°， T＝273(2)K，Z＝2，Rgt(F)＝0.0483，wRref(F)＝0.1204。

[0129] 交链孢酚(5)：黄色粉末。二氯甲烷‑甲醇(10∶1)展开，10％硫酸乙醇溶液显单一肉1
桂色斑点(Rf值为0.53)。H‑NMR(600MHz，DMSO‑d6)δ11.75(1H，s，7‑OH)，10.88(1H，s，9‑OH)，
10.32(1H，s，3‑OH)，7.23(1H，d，J＝2.1Hz，H‑10)，6.71(1H，d，J＝2.6Hz，H‑2)，6.63(1H，d，J
13
＝2.5Hz，H‑4)，6.36(1H，d，J＝2.0Hz，H‑8)，2.69(3H，s，‑CH3)；C‑NMR(150MHz，DMSO‑d6)δ
138.3(C‑1)，117.5(C‑2)，158.4(C‑3)，101.6(C‑4)，152.6(C‑4a)，164.7(C‑6)，97.4(C‑
6a)，164.1(C‑7)，100.9(C‑8)，165.4(C‑9)，104.3(C‑10)，138.1(C‑10a)，109.0(C‑10b)，
25.2(‑CH3)。

[0130] 交链孢酚单甲醚(6)：白色粉末。二氯甲烷‑甲醇(30∶1)展开，10％硫酸乙醇溶液显1
单一肉桂色斑点(Rf值为0.41)。H‑NMR(400MHz，DMSO‑d6)δ11.72(1H，s，7‑OH)，10.94(1H，s，
3‑OH)，7.25(1H，s，H‑10)，6.85(2H，s，H‑2，4)，6.38(1H，s，H‑8)，3.83(3H，s，‑OCH3)，2.72
13
(3H，s，‑CH3)；C‑NMR(100MHz，DMSO‑d6)δ138.2(C‑1)，116.6(C‑2)，159.7(C‑3)，101.2(C‑
4)，152.6(C‑4a)，164.6(C‑6)，97.6(C‑6a)，164.1(C‑7)，99.9(C‑8)，165.4(C‑9)，104.6(C‑
10)，137.8(C‑10a)，110.2(C‑10b)，55.6(‑OCH3)，25.2(‑CH3)。

[0131] 交链孢酚‑3,9‑二甲醚(7)：白色粉末。石油醚‑乙酸乙酯(5∶1)展开，10％硫酸乙醇1
溶液显单一橙色斑点(Rf值为0.47)。H‑NMR(600MHz，CDCl3)δ11.94(1H，s，7‑OH)，7.29(1H，d，J＝6.7Hz，H‑10)，6.73(2H，d，J＝4.4Hz，H‑2，4)，6.53(1H，d，J＝2.5Hz，H‑8)，3.91(3H，s，
13
9‑OCH3)，3.85(3H，s，3‑OCH3)，2.79(3H，s，‑CH3)；C‑NMR(150MHz，CDCl3)δ138.3(C‑1)，
117.0(C‑2)，160.1(C‑3)，100.1(C‑4)，153.3(C‑4a)，165.3(C‑6)，99.5(C‑6a)，165.5(C‑
7)，99.1(C‑8)，166.6(C‑9)，104.7(C‑10)，138.1(C‑10a)，111.0(C‑10b)，55.7(3‑OCH3)，
55.8(9‑OCH3)，25.9(‑CH3)。

[0132] 实施例2

[0133] 化合物的抗炎活性实验

[0134] 进行化合物phellodenol‑A(1)、华中冬青素(2)、新海胆灵A(3)、2,4‑二甲氧基肉桂酸(4)、交链孢酚(5)、交链孢酚单甲醚(6)、交链孢酚‑3,9‑二甲醚(7)对LPS诱导的RAW 264.7细胞的体外抗炎活性研究实验。

[0135] 1、实验原理

[0136] (1)CCK‑8的英文全称为Cell Counting Kit‑8。其中起主要作用的化学药品是WST‑8，化学名为2‑(2‑甲氧基‑4‑硝基苯基)‑3‑(4‑硝基苯基)‑5‑(2，4‑二磺酸苯)‑2H‑四唑单钠盐。它的核心基团和MTT是一样的，是MTT的升级版本。在电子耦合试剂(也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢)存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。

[0137] (2)NO在体内或水溶液等环境中极易氧化为NO2‑，而在酸性条件下，NO可发生一系列反应生成粉红色特殊物质，这种特殊物质在540nm处有最大吸收峰，可通过OD值推算NO浓度。

[0138] 2、实验步骤

[0139] (1)化合物1～7的细胞活性检测

[0140] 取对数生长期RAW264.7细胞，用含0.25％EDTA(1×)胰蛋白酶消化至细胞处于悬浮状态后，加入完全培养基稀释胰酶浓度，终止消化。离心，重悬后用完全培养基制备密度5
为1×10cells/mL的单细胞混悬液，以100μL/孔接种于96孔板中，外圈细胞培养孔中加入
100μLPBS缓冲液，减小边缘效应对实验结果的影响。于37℃，5％CO2培养箱中静置培养20h。
培养完成后，加入100μL含上述化合物不同浓度的培养液。其中化合物试液浓度设置分为2组，第一组：化合物1、3～7的试液浓度设置为6.25、12.5、25、50μM；第二组：化合物2的试液浓度设置为6.25、12.5、25、50、100、200μM，以上每个浓度设3个复孔。留三孔不加药作为正常组，不加药、不加细胞作为空白组。培养20h后弃去细胞上清液，加入10μL的CCK‑8工作液，继续放入培养箱培养2h后，用酶标仪于450nm波长处测定吸光度值即可。细胞相对活力＝[OD实验‑OD空白]/[OD正常‑OD空白]×100％。

[0141] (2)化合物1～7抗炎活性检测

[0142] 取对数生长期的RAW264.7细胞用完全培养基制备密度为1×105cells/mL单细胞混悬液，以100μL/孔接种于96孔板中，外圈细胞培养孔中加入100μL PBS缓冲液，减小边缘效应对实验结果的影响。于37℃，5％CO2培养箱中静置培养20h。培养结束后，加入100μL含上述化合物的培养液，其中化合物1、3～7加入的试液浓度为50μM，化合物2加入的试液浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200μM，上述化合物的给药浓度均设3个复孔。留三孔不加药作为正常组，不加药、不加细胞作为空白组。加药于37℃，5％CO2培养箱中静置培养1h后，再加入浓度为1μg/mL的LPS刺激其产生炎症，最后放入37℃，5％CO2培养箱中培养20h。

[0143] 取出Griess Reagent I和II，使恢复室温，按照试剂说明书制作标准曲线，将培养好的细胞上清液按50μL/孔，在新的96孔板中加入标准品及样品，按50μL/孔，在各孔中先加入Griess Reagent I，后加入Griess Reagent II，再于37℃，5％CO2培养箱中静置培养15min后，最后使用酶标仪于540nm处测定其吸光度，并根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮(NO)的浓度。

[0144] 3、实验结果

[0145] (1)RAW 264.7细胞在分别给予6.25、12.5、25、50μM化合物1、3～7时，20h后RAW264.7细胞的相对活力见表1；在分别给予6.25、12.5、25、50、100、200μM化合物2时，其对应的相对活力见表2。表1、表2的结果表明化合物1～7在上述浓度下对细胞均无明显的毒性作用。

[0146] 表1化合物1、3～7对RAW 264.7细胞的相对活力

[0147]

[0148] 表2化合物2对RAW 264.7细胞的相对活力

[0149]

[0150] (2)如图15～17所示，LPS刺激RAW264.7细胞后，细胞NO释放量相比于没有加入LPS刺激的对照组有极其显著的升高。由图15可知，LPS刺激后没有加入化合物1、3、4、5、7的LPS组NO释放量达到14.10μM。加入化合物1、3、4、5、7继续培养的实验组和LPS组相比，除化合物3外，其余化合物均能抑制NO的释放。具体而言，当加入50μM的化合物1、4、5、7后，其细胞NO释放量分别降低到了12.75、13.66、12.53、13.73μM。由图16可知，LPS刺激后没有加入化合物2的LPS组NO释放量达到7.11μM。加入化合物2继续培养的实验组和LPS组相比，NO的产生量随加入化合物2的浓度的增加而降低，其活性呈现一定浓度依耐性。具体而言，当加入
200、100、50、25、12.5、6.25μM的化合物2后，其细胞NO释放量分别降低到了4.93、6.03、
6.57、7.31、7.19、7.55μM，当加入化合物2的浓度到达200μM时，其抑制NO释放的能力较显著。由图17可知，LPS刺激后没有加入化合物6的LPS组NO释放量达到16.52μM。加入化合物6继续培养的实验组和LPS组相比，NO的产生量也随加入化合物6的浓度的增加而降低，其活性呈现一定浓度依耐性。具体而言，当加入50、25、12.5、6.25μM的化合物6后，其细胞NO释放量分别降低到了12.70、16.03、16.38、17.31μM，当加入化合物6的浓度到达50μM时，其抑制NO释放的能力较为显著。

[0151] 以上结果说明从狭叶落地梅中分离得到的化合物1、2、4～7对LPS诱导炎症反应的RAW 264.7细胞一氧化氮的产生均具有抑制作用，反映出一定的抗炎特性。

[0152] 三、化合物的抗肿瘤活性实验

[0153] 进行化合物phellodenol‑A(1)、华中冬青素(2)、新海胆灵A

[0154] (3)、2,4‑二甲氧基肉桂酸(4)、交链孢酚(5)、交链孢酚单甲醚(6)、交链孢酚‑3,9‑二甲醚(7)对结直肠癌(SW480、HCT116)、肝癌(HepG2)、肺癌(A549)、卵巢癌(SK‑OV‑3)细胞进行细胞毒活性筛选，并通过以下实施来进一步阐明本发明。

[0155] 1、实验原理

[0156] CCK‑8法基本原理同上。

[0157] 2、实验步骤

[0158] 取对数生长期细胞，用含0.25％EDTA(1×)胰蛋白酶消化至细胞处于悬浮状态后，4
加入含血清的培养基稀释胰酶浓度，终止消化。用完全培养基制备密度为2×10 cells/mL单细胞混悬液，以100μL/孔接种于96孔板中，外圈细胞培养孔中加入100μLPBS缓冲液，减小边缘效应对实验结果的影响。于37℃，5％CO2培养箱中静置培养24h，观察细胞贴壁后。加入
100μL含待测试化合物的培养液。化合物试液浓度范围设为：50、20、10、5、2.5、1.25μM，每个浓度设3个复孔。留三孔只加细胞的培养液作为空白对照，以不加药只加DMSO的培养液孔作为阴性对照。培养48h后弃去上清液，加入100μL 10％CCK‑8的CCK‑8工作液，继续放入培养箱培养2h后，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定吸光度值，所有的吸光度值首先减去空白对照值后，通过与对照组值的比较得到实验组药物的相对细胞抑制率，药物细胞抑制率＝[OD对照‑OD实验]/[OD对照‑OD阴性]×100％。以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率可以求出该药物对细胞生长抑制率为50％的浓度即半数抑制浓度IC50。由于每个化合物同一浓度在96孔板中占3孔，即同一浓度平均作用细胞三次取平均值，而每个实验重复三次。所得数据以“均数±标准误差”(mean±SEM)表示。

[0159] 3、实验结果

[0160] 表3为上述待测化合物对SW480、HCT116、HepG2、A549、SK‑OV‑3的IC50(单位：μM)。

[0161]

[0162] 注：*为化合物的IC50优于阳性对照。

[0163] 由表3可知，化合物3对肝癌细胞(HepG2)的IC50值均优于阳性对照索拉非尼；化合物3、6、7对肺癌细胞(A549)的IC50值均优于阳性对照；化合物7对卵巢癌细胞(SK‑OV‑3)的IC50值均优于阳性对照。

[0164] 以上结果说明从狭叶落地梅中分离得到的化合物1～7均具有一定的抗肿瘤活性。

[0165] 最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。