[0001] 本发明属于水产动物疾病防治技术领域，更具体地说，本发明涉及一种复方免疫增强剂及其在水产养殖中的应用。

[0002] 在目前集约化养殖模式下，水产养殖动物病害严重，特别是爆发性的疾病给养殖户带来巨大的经济损失。水产养殖病害防治以化学药物为主，特别是使用抗菌、抑菌类及其它化学药物作为预防药物长期使用，不但会引起病原菌耐药性增强问题，也给养殖水产品的质量安全带来隐患，同时对环境微生态造成破坏，并威胁人类健康与生存。因此，通过提高养殖水生动物机体免疫能力来预防疾病就显得格外重要。但是现有的疫苗虽然特异性强，但制备复杂，而且存在病原体经常变异、免疫途径和免疫效果不足等问题，无法满足生产需要。

[0003] 免疫增强剂又称免疫调节剂，是一类通过促进或诱导机体防御反应，提高机体自身性免疫能力，增强机体对病原微生物或病原体产生特异反应的物质。从广义上讲，免疫增强剂是指可以提高动物免疫能力的试剂，按其功能可以分为两大类：一类是增强动物的非特异性免疫功能；另一类是增强由免疫诱导的特异性免疫功能。对水产动物而言，多是指通过提高非特异性免疫机能来增强水产动物的抗病、防病能力的免疫增强剂。目前已被证实有100多种物质具有免疫增强作用，但在水产养殖方面开展的应用研究还不多。由于植物源免疫增强剂具有无药残、不会产生耐药性，安全、无毒、高效、低成本、不污染环境等诸多优点而越来越受到重视，利用植物源免疫增强剂提高鱼、虾等水产养殖动物的非特异性免疫抗病能力已成为水产养殖病害防治领域的研究重点。因此，植物源免疫增强剂对水产健康养殖发展具有重要意义。

[0004] 基于上述理由，提出本申请。

[0026] 下面通过实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。

[0027] 根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。

[0028] 为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

[0029] 本发明中所采用的设备和原料等均可从市场购得，或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

[0030] 本发明涉及的大蒜素购自上海源叶生物科技有限公司，货号S25256。

[0031] 实施例1(药物筛选)

[0032] 1材料和方法

[0033] 1.1试验药物

[0034] 垂盆草、杜仲、黄芪、穿心莲。

[0035] 1.2提取物制备

[0036] 将垂盆草、杜仲、黄芪、穿心莲置于烘箱中，50℃烘烤16～24h，用中草药粉碎机粉碎，过40目筛，装入自封袋中，室温干燥保存备用。

[0037] 水提物制备：分别称取50g中药材，加入10倍量水，加热煎煮3次，每次1h，合并提取液，浓缩定容至1g生药/mL。

[0038] 醇提物制备：分别称取50g中药材，加入10倍量80％乙醇，80℃回流提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩定容至1g生药/mL。

[0039] 1.3白细胞准备

[0040] 加州鲈5尾，尾静脉取血，制备抗凝血，加入等体积的细胞培养基(L‑15)(购自biosharp，货号BL313A)中。另取10mL的离心管，加入1.5mL密度梯度分离液(购自biosharp，货号BL590)，沿管壁缓慢加入3mL稀释后的血液，800g离心20min；取中间白细胞层于新离心管中，加入1mL L‑15，轻轻混合均匀；取20μL细胞，加入等体积的w＝0.2％的台盼蓝染液，显7
微镜下计数得到细胞悬液的初始浓度。用L‑15将其稀释成2×10 /mL，作氧负离子检测；稀
6
释成每毫升含5×10个细胞的溶液，作吞噬活性检测。

[0041] 1.4白细胞产生氧负离子能力的检测(NBT还原法)

[0042] 取1块干净的96孔板，每孔加入100μL白细胞悬液(每毫升含2×107个细胞)；每9孔为1组，共8组，分别加入相同质量浓度的同一萃取物100μL，空白对照组加入等体积的萃取物稀释液PBS，室温孵育2h。每孔弃上清100μL，再加入100μL的L‑15溶液洗涤，重复3次。每组分为L亚组，N亚组和Z亚组，共3个亚组，第1～3孔添加L‑15(L亚组)，第4～6孔添加L‑15+NBT(购自默克，货号N6876)(N亚组)，第7～9孔添加L‑15+NBT+酵母聚糖(购自北京索莱宝，货号Z8070)(Z亚组)；室温孵育1h。每孔吸去100μL上清，加入100μL甲醇固定3min；吸去100μL上清，加入100μL 70％甲醇洗涤，重复3次，最后一次吸去所有液体，室温风干后，每孔加入140μL 2mol/L的KOH和120μL的DMSO；用酶标仪测定各管中的OD620值，分别按以下公式计算出SPO，STI，Z/N和NBT。

[0043] SPO＝ODN－ODL，

[0044] STI＝ODZ－ODN，

[0045] Z/N＝ODZ/ODN，

[0046] NBT＝(试验组ODZ－对照组ODZ)/对照组ODZ×100％，

[0047] 其中，SPO间接反映白细胞自发产生O2－能力的强弱，STI间接反映经酵母聚糖刺激－后白细胞产生O2 能力的强弱，ODL，ODN，ODZ分别代表L亚组、N亚组、Z亚组的OD620值。

[0048] 其中：(1)Z/N＞1，说明在不剔除L‑15的作用下，该组在酵母聚糖诱导后白细胞产生氧负离子的能力增加；(2)STI＞SPO＞0，说明在剔除L‑15作用下，该组在酵母聚糖诱导后白细胞产生氧负离子的能力增加；(3)NBT％＞100％，说明酵母聚糖诱导后试验组白细胞产生氧负离子的能力高于对照组。(1)，(2)，(3)3个条件均满足的情况下，表明该组提取物对实验动物具有较强的免疫促进作用，其中值越大，说明效果越明显。若不能同时满足以上3个条件，即使实验组各值与对照组的值达到显著或极显著差异，也不能说明免疫效果明显。

[0049] 1.5吞噬活性的检测

[0050] 取干净的2mL离心管，每管加入200μL白细胞悬液(每毫升含5×106个细胞)和提取物，空白对照组加入等体积的蒸馏水，室温孵育1h；每管加入100μL乳胶微球(每毫升含1×8
10个乳胶微球)，轻轻混匀，制成混合液；准备若干干净玻片(每块玻片含2个凹槽)，每块玻片的2个凹槽分别加入上述同种混合液200μL(即每种提取物设2个重复)，室温孵育1h；吸去凹槽中的液体，加入戊二醛200μL，室温孵育5min；吸去液体，加入Giemsa染色0.5～1h，然后蒸馏水冲洗，自然晾干；取一个视野，在油镜下察并记录结果，并按以下公式计算吞噬活性率(P)和吞噬指数(PI)。

[0051] PA＝吞噬乳胶球的白细胞数/总白细胞数×100％，

[0052] PI＝被吞噬的乳胶球总数/吞噬乳胶球的白细胞总数。

[0053] 1.6数据统计

[0054] 采用软件spass对数据进行统计分析，采用T检验进行组间显著性分析，显水平为P＜0.05，极显著水平为P＜0.01。

[0055] 2结果分析

[0056] 2.1白细胞产生氧负离子能力的检测(NBT还原法)

[0057] 由表1可以看出各实验组SPO、STI同对照组相比均具显著性差异(P<0.05)，其中垂盆草水提物、杜仲水提物、黄芪水提物、穿心莲醇提物满足Z/N＞1、STI＞SPO＞0、NBT％＞100％三个条件，说明这四种提取物对加州鲈白细胞具有较好的免疫促进作用，其中黄芪水提物＞垂盆草水提物＞穿心莲醇提物＞杜仲水提物。

[0058] 表1白细胞产生氧负离子能力的检测

[0059]

[0060] 注：*代表与对照组具有显著性差异(P<0.05)。

[0061] 2.2吞噬活性检测

[0062] 由表2可以看出，四种提取物PA和PI值均与对照组具显著性差异(P<0.05)，其中垂盆草水提物处理组吞噬活性略高于黄芪水提物，但差异不显著(P>0.05)。

[0063] 表2吞噬活性结果

[0064] PA/％ PI* *
垂盆草水提物 39.62±0.18 1.72±0.11
* *
杜仲水提物 15.87±0.23 1.51±0.13
* *
黄芪水提物 37.34±1.41 1.73±0.08
* *
穿心莲醇提物 28.35±2.04 1.64±0.10
对照组 9.22±0.48 1.32±0.07

[0065] 注：*代表与对照组具有显著性差异(P<0.05)。

[0066] 3结论

[0067] 由以上结果可以看出，垂盆草水提取物、杜仲水提物、黄芪水提物、穿心莲醇提物对加州鲈白细胞产生氧负离子能力和吞噬活性均具有促进作用，其中垂盆草水提物和黄芪水提物作用最佳，因垂盆草水提物尚未应用于水产免疫增强剂，后续将着重对垂盆草水提物进行下一步研究。

[0068] 实施例2(配方筛选)

[0069] 考虑到山楂、大蒜素、陈皮均有一定诱食作用，与垂盆草复配，可以增强摄食，故以垂盆草水提物分别与之进行复配，以加州鲈白细胞吞噬活性为考察指标，具体试验方法参照实施例1，考察是否有免疫增强作用。由表3可知同垂盆草水提物比，垂盆草水提物和山楂超微粉复配，吞噬活性显著下降(P<0.05)，垂盆草水提物和陈皮超微粉复配，吞噬活性无显著性差异(P>0.05)，垂盆草水提物与大蒜素复配后，吞噬活性显著增强(P<0.05)。所以选择垂盆草水提物、大蒜素复配。

[0070] 表3复配药物吞噬活性测定

[0071]PA/％ PI
* *
垂盆草水提物：山楂超微粉(质量比1:1) 26.99±0.42 1.29±0.15
垂盆草水提物：陈皮超微粉(质量比1：1) 40.14±0.27 1.75±0.23
* *
垂盆草水提物：大蒜素(质量比1：1) 46.05±0.34 1.93±0.25
垂盆草水提物 38.08±0.36 1.82±0.16

[0072] 注：*代表与垂盆草水提物组具有显著性差异(P<0.05)。

[0073] 实施例3配方优化

[0074] 根据实施例2的结果，设计以下几组配方，见表4。拌饲投喂后，测定加州鲈血液中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶及白细胞吞噬活性，结果见表5，各比例配制的复方制剂碱性磷酸酶、酸性磷酸酶及白细胞吞噬活性显著高于对照组(p＜0.05)；当垂盆草提取物与大蒜素质量比为4：1，3：1，2：1，1：1，1：2时，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、白细胞吞噬活性均显著高于等质量单方制剂(P<0.05)；当质量比例为3:1时碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、白细胞吞噬活性均最强，且加州鲈生长速度快，故选择最佳质量配方为3:1。

[0075] 表4配方优化

[0076]

[0077]

[0078] 表5投喂不同配比药物指标测定结果

[0079]

[0080] 注：*代表与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。

[0081] 实施例4(复方制剂对加州鲈非特异免疫指标及抗病力影响试验)

[0082] 1材料和方法

[0083] 1.1试验药物

[0084] 复方制剂(垂盆草水提物与大蒜素的质量比为3:1)。将100g垂盆草，加入10倍量水，加热煎煮3次，每次1h，合并提取液，浓缩至干膏，置真空冷冻干燥仪中干燥48h，粉碎后即得黄褐色粉末30g；加入大蒜素10g，混合均匀即得。

[0085] 1.2试验分组

[0086] 试验分为4个组，1个对照组，3个实验组(饲料中复方制剂添加量分别为0.5％，1％，2％)，每组3个平行，每个平行30尾鱼。每天分别于9:00和16:00各投喂一次，连续投喂
30d。

[0087] 1.3指标测定

[0088] 试验结束时，每组取鱼5尾，尾静脉取血，待血凝后以3000r/min，离心10min，收集血清，冻存备用。同时解剖鱼，取肝脏冻存备用。

[0089] 血清测定指标：溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T‑AOC)。

[0090] 肝脏指标测定：取肝脏制备肝脏组织匀浆，测定碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T‑AOC)。

[0091] 1.4抗病力影响

[0092] 试验结束后，采用嗜水气单胞菌(2.0×108cell/mL)对各组试验鱼进行攻毒。每个平行分别取试验鱼20尾，经胸鳍基部注射0.1mL嗜水气单胞菌悬液。观察96h后，统计各组的死亡率，依下式计算死亡率(mortality rate，MR)与免疫保护率(protective rate，PR)。

[0093] 死亡率(％)＝[(试验初鱼体尾数一试验末鱼体尾数)/试验初鱼体尾数]×100；

[0094] 免疫保护率(％)＝(1一试验组死亡率/对照组死亡率)×100。

[0095] 2结果与分析

[0096] 2.1非特异性免疫指标变化情况

[0097] 由表6可以看出，各剂量组血清中LZM、ALP、ACP、SOD活性及T‑AOC均显著高于对照组(P<0.05)，说明饲料中添加复方制剂有助于提高加州鲈血清中LZM、ALP、ACP、SOD酶活性，提高总抗氧化能力。随着复方制剂剂量的增加，LZM、ALP、SOD值升高，ACP、T‑AOC先升高，在2％时略有下降，但1％组和2％组各指标差异不显著(P>0.05)，说明随着剂量增加，复方制剂的作用增强，但1％和2％作用差异不大。

[0098] 表6血清非特异性免疫指标变化情况

[0099]

[0100] 注：*代表与对照组具有显著性差异(P<0.05)。

[0101] 由表7可以看出，各剂量组肝脏中ALP、ACP、SOD活性及T‑AOC均显著高于对照组(P<0.05)，说明饲料中添加复方制剂有助于提高加州鲈肝脏中ALP、ACP、SOD酶活性，提高总抗氧化能力。随着复方制剂剂量的增加，ACP、SOD值升高，ALP、T‑AOC先升高，在2％时略有下降，但1％组和2％组各指标差异不显著(P>0.05)，说明随着剂量增加，复方制剂的作用增强，但1％和2％剂量作用差异不大。

[0102] 表7肝脏非特异性免疫指标变化情况

[0103]ALP(U/g) ACP(U/g) SOD(U/mg) T‑AOC(U/mg)
* * * *
0.5％ 49.85±2.58 26.41±3.41 170.56±13.64 30.46±4.57
* * * *
1％ 66.34±3.65 33.68±1.76 268.35±14.48 46.92±3.25
* * * *
2％ 63.48±2.94 35.28±2.48 270.49±10.35 48.35±4.61
对照组 35.47±2.83 18.77±2.53 152.37±11.97 27.65±3.04

[0104] 注：*代表与对照组具有显著性差异(P<0.05)。

[0105] 碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶是鱼类非特异性免疫中主要的体液免疫因子，一般情况下，这三种酶的活性升高，代表着鱼类机体的免疫状态良好，机体免疫能力也提高。

[0106] 超氧化物歧化酶(SOD)中重要的抗氧化酶，能阻断与修复机体内的氧自由基对细胞的损伤。总抗氧化能力(T‑AOC)反映了机体总抗氧化能力及自由基代谢的好坏。抗氧化能力也是机体抗病能力的一部分。

[0107] 各剂量组血清及肝脏中LZM、ALP、ACP、SOD活性及T‑AOC均显著高于对照组(P<0.05)，说明复方制剂能够增强机体非特异性免疫力及抗氧化能力。并且随剂量增加作用增强，1％添加量时达最大，随后增加添加量，并不能显著提高其增强免疫力的能力。

[0108] 2.2抗病力

[0109] 人工腹腔注射嗜水气单胞菌感染后加州鲈的死亡情况见表8，对照组死亡率为60％，各剂量组由低到高死亡率分别为31.7％，21.7％和20.0％，免疫保护率分别为
51.2％，66.6％和69.2％。随着剂量的升高，免疫保护率提高，但1％和2％剂量组死亡率差异不显著。

[0110] 说明复方制剂能够提高加州鲈机体抗病能力，并且1％和2％作用相当。

[0111] 表8人工感染后死亡情况

[0112]

[0113] 注：右肩上字母不同表示差异显著(P<0.05)。

[0114] 3结论

[0115] 复方制剂能够提高加州鲈非特异性免疫力和抗氧化能力，增强机体抗病能力。

[0116] 实施例5(复方制剂大塘应用试验)

[0117] 1材料和方法

[0118] 1.1试验药物

[0119] 复方制剂(垂盆草水提物：大蒜素质量比3:1)：100g垂盆草，加入10倍量水，加热煎煮3次，每次1h，合并提取液，浓缩至干膏，置真空冷冻干燥仪中干燥48h，粉碎后即得黄褐色粉末30g；加入大蒜素10g，混合均匀即得。

[0120] 1.2大塘试验

[0121] 分别在咸宁通山加州鲈养殖场、武汉江夏斑点叉尾鮰养殖户、潜江小龙虾养殖户，进行复方制剂的应用试验，以1％剂量拌饲投喂，每天分别于9:00和16:00各投喂一次。连续投喂1个月，记录各组水生动物的发病状况及死亡数。

[0122] 2结果

[0123] 试验期间，加州鲈养殖场未用药养殖池均出现零星死鱼情况，而用药3口池塘未出现死鱼情况。斑点叉尾鮰池塘出现细菌感染病情，未用药组每日死鱼40尾左右，而用药3口池塘平均每日死鱼4尾左右，使用抗菌药物后好转，用药组首先停止死鱼。小龙虾养殖池均未出现死虾情况，但用药组3口池塘小龙虾整体个头较大，摄食力强。

[0124] 3结论

[0125] 复方制剂在水生动物日粮中添加具有提高免疫抗病力、促生长的作用。