[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合征的miRNAs及其应用。

[0002] miRNAs是一类长约19‑25nt的非编码RNA，是一类多功能的小分子，广泛参与调控细胞基因表达；miRNAs通过靶向基因3'UTR区域发挥调控作用。在细胞核中，miRNAs通过自身的启动子或共享其宿主基因的启动子转录为pri‑miRNA，Drosha RNase III核酸内切酶在初级茎环基部附近的位点切割茎环下端的双链，释放出约60～70nt的茎环中间体，称为miRNA前体(pre‑miRNA)，转移蛋白Exportin5将Pre‑miRNA转运至细胞质，Pre‑miRNA被RNase III酶Dicer切割形成大约18～25nt的双链RNA，一条链在细胞质中被降解，而另一条链则为成熟的miRNA；成熟miRNA则与宿主中蛋白形成RISC诱导沉默复合体，发挥miRNA抑制基因表达的功能。miRNA通过靶向特定mRNA的3'非翻译区(3'Untranslated Region，3'UTR)和编码区来控制基因表达。具体机制是，miRNA往往通过靶向宿主基因mRNA的3'UTR，miRNA将Argonaute(AGO)蛋白复合物募集到互补的靶mRNA上，从而导致mRNA的翻译抑制或降解。动物miRNA常常是部分匹配基因3'UTR抑制翻译，若miRNA与靶基因3'UTR匹配碱基较高会诱导mRNA降解。

[0003] 最新的研究表明，宿主miRNAs不但调控宿主基因的表达，而且miRNAs可以直接靶向病毒基因发挥调控作用。例如，在正粘病毒科传染性鲑鱼贫血症病毒(Infectious salmon anemiavirus，ISAV)感染中，鲑鱼miR‑148a/b和miR‑152通过直接靶向ISAV的HA、P3和NP基因发挥抗病毒作用；宿主miR‑138通过靶向单纯疱疹病毒HSV‑1早期蛋白ICP0的RNA抑制病毒复制；据报道，宿主miR‑1207‑5p在SARS‑CoV‑2的S基因具有潜在的靶点。值得注意的，猪源miR‑221‑5p通过靶向PEDV基因组和激活NF‑κB通路抑制病毒的复制；因此，宿主miRNAs不但可以调节宿主基因表达，而且miRNAs可以直接靶向病毒RNA调控病毒的复制。

[0004] 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉病毒科的Betaarterivirus suid属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。PRRSV基因组长约15kb，包含一个5’UTR、至少11个开放阅读框(ORF)、一个3'‑UTR和一个3'poly(A)尾。PRRSV具有以下两种基因型：欧洲起源的PRRSV‑1(Betaarterivirus suid 1)和北美起源的PRRSV‑2(Betaarterivirus suid 2)。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)于1987年在美国首次被发现；2006年，HP‑PRRSV毒株在我国多个省份暴发，导致大批猪只死亡；2012年后，中国出现了NADC30‑like变异毒株；2015年之后，NADC30 like病毒开始流行；NADC30‑like毒株的出现可能是由于北美NADC30毒株和中国HP‑PRRSV毒株的重组。尽管不会到导致高的死亡率，但NADC30‑like毒株与其他病毒毒株的高重组率，从而导致毒力改变，主要引起母猪流产，使得接种疫苗的猪可能会因感染NADC30‑like毒株而发病，在猪群中流行。研究表明，由不同毒株或基因型共同感染引起的重组使猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的流行病学更加复杂和多样化。

[0005] 由于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株不断变异，已有的疫苗不能完全保护野毒株的侵袭，每年存在一定范围的流行，造成严重的经济损失。当前有效预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的方法主要依靠黄芪、鱼腥草、金银花等中草药提猪只免疫活性，从而达到抗病毒效果。然而，由于PRRSV感染会造成猪只免疫抑制，增强免疫相关治疗药物疗效欠佳。因此，尚没有理想的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染药物用于预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。考虑到miRNAs在靶向病毒基因发挥抗病毒作用明显，因此，通过抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制来预防和治疗猪繁殖与呼吸综合征是一个亟需研究的方向。目前，尚未有直接抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪源miRNAs。

[0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0025] 本发明实施例中所需要使用到的商品试剂及细胞

[0026] 1.细胞和质粒

[0027] DH5α感受态细胞、萤火虫荧光素酶报告基因载体购自生工生物公司。

[0028] HEK293t细胞为石河子大学盛金良教授馈赠。

[0029] MARC‑145细胞为中国农业科学院上海兽医研究所邱亚峰研究员馈赠。

[0030] miR‑361‑3p同系物由上海生工生物公司化学合成。

[0031] 荧光素酶报告基因载体质粒pGL‑promoter‑PRRSV为上海生工生物有限公司合成。

[0032] pRL‑TK质粒购自上海生工生物有限公司。

[0033] 2.主要试剂

[0034] DMEM培养基、胎牛血清、双抗购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒、荧光定量检测试剂盒购自Takara公司。

[0035] 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自诺维赞生物科技有限公司。

[0036] 3.主要仪器

[0037] 微量移液器：上海佰博康仪器有限公司。

[0038] 台式高速离心机：力辰科技公司产品。

[0039] PCR扩增仪：雅睿科技(中国)有限公司产品。

[0040] 凝胶成像仪：北京六一公司产品。

[0041] 核酸电泳仪：济南爱来宝仪器设备有限公司。

[0042] 纯水仪：中国上海仪硕有限公司。

[0043] ‑80℃低温冰箱：三洋科学仪器有限公司。

[0044] 恒温振荡培养箱：上海帝博思有限公司。

[0045] 超净工作台：江苏讯迪仪器科技有限公司。

[0046] 恒温水浴锅：中国济南欧莱博生物科技有限公司。

[0047] 电热恒温培养箱：中研立华仪器科技有限公司。

[0048] 电子天平：(中国)瑞士梅特勒托利多。

[0049] 实施例1

[0050] 1、miR‑361‑3p的筛选

[0051] 根据已经报道的miRNAs相关文献，挑选出共27个PRRSV感染差异表达的miRNAs，通过对PRRSV流行毒株序列比对分析，选择目前流行的nadc‑30like毒株序列为靶标，选择上述PRRSV感染差异表达的miRNAs为靶标分子，利用miRanda软件分别分析miRNAs靶向PRRSV基因序列及其区域，根据得分高低排序；筛选到能够靶向抑制PRRSV复制的miR‑361‑3p，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：CCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUUGC。

[0052] miR‑361‑3p一共靶向PPRSV基因的2个区域，靶向区域分别为PRRSV nsp1211870‑11893，PRRSV nsp1111337‑11365，其具体情况如图1所示。

[0053] 2、双荧光素酶活性检测

[0054] 将较高转染效率的HEK293t细胞接种6孔板，过夜(≥12h)培养后，将300ng荧光素酶报告基因载体质粒pGL‑promoter‑PRRSV、6ng的pRL‑TK质粒，以及miR‑361‑3p 10μL共转染HEK293t细胞，同时共转染300ng的荧光素酶报告基因载体质粒pGL‑promoter‑PRRSV、6ng的pRL‑TK质粒，以及miRNANC 10μL作为miRNANC组(对照组)，转染24h后利用诺维赞生物公司双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性。并利用GraphPadVersion 5.01软件进行数据差异分析，结果如图2所示。

[0055] 由图2可知，相比于miRNANC组，转染miR‑361‑3p显著抑制荧光素酶活性。

[0056] 3、荧光定量检测和TCID50

[0057] 将MARC‑145细胞接种6孔板，过夜(≥12h)培养后，将miR‑361‑3p 10μL转染细胞，同时转染miRNANC 10μL作为miRNANC组(对照组)，转染12h后，感染PRRSV 24h后，收取细胞上清和细胞样品，提取RNA进行荧光定量PCR检测PRRSV orf7，利用细胞上清测定病毒滴度。结果如图3和4所示。

[0058] 其中，荧光定量PCR检测的步骤为：利用Trizol方法提取MARC‑145细胞总RNA，按照表1制备cDNA组分，轻混匀反应体系后进行反转录反应。cDNA反应程序(荧光定量PCR仪上反应)：37℃20min(逆转录反应)，85℃30sec(逆转录酶失活)，反应产物4℃保存。

[0059] 表1cDNA反转录反应体系

[0060] 组份 体系5×PrimeScriptRT预混液 2μL
总RNA(500ng) XμL
无RNasedH2O 8‑XμL

[0061] 按照表2表配制荧光定量反应体系，总计20μL。轻轻混合后进行PCR反应。.反应程序(Bio‑Rad CFX96Touch)：95℃30s后，进入40个循环，95℃5s，62℃30s；添加熔解曲线程序。简而言之，将β‑actin的表达量作为内参对照。目的基因相对表达量以β‑actin为内参计算。引物序列如表3。

[0062] 表2实时荧光定量PCR反应体系

[0063] 组份 体系TBGreenPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2X) 10μL
PCR正向引物(10μM) 0.4μL
PCR反向引物(10μM) 0.4μL
cDNA模板 0.8μL
ddH2O 8.4μL

[0064] 表3引物序列

[0065]名称 序列(5’→3’)
β‑actinqpcr‑f CGGGAAATCGTGCGTGAC
β‑actinqpcr‑r ATGCCCAGGAAGGAAGGTTG
Prrsvorf7F ATCCAGACTGCCTTCAAT
Prrsvorf7R AACTCCACAGTGTAACTTATC

[0066] TCID50：根据Reed‑Muench法计算。具体操作如下：96孔板提前接种MARC‑145细胞，过夜(≥12h)培养后，细胞培养上清10倍倍比稀释8次，每个稀释做8个重复，每个稀释度取100μL接种一个空，每个稀释度做8个重复，37℃培养48h后，观察病变，根据公式：TCID50＝高于50％病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例，计算TCID50。

[0067] 荧光定量检测结果与TCID50结果相吻合，过表达miR‑361‑3p可以显著抑制PRRSV复制，证明miR‑361‑3p可通过靶向PRRSV基因区域发挥抗病毒作用。

[0068] 本发明还提供了一种防治猪繁殖与呼吸综合征的药物，药物为口服型，其中药物的剂型包括溶液剂、胶囊剂和颗粒剂。该药物是通过将上述的miR‑361‑3p根据不同的剂型配以不同的辅料或者载体，通过相应剂型的制备工艺加工成可供动物使用的剂型。溶液剂相应的辅料包括微粉硅胶、蒸馏水中的任意一种或者多种；胶囊剂相应的辅料包括淀粉、羟甲基纤维素钠、甲基纤维素中的任意一种或者多种；颗粒剂相应的辅料包括碳酸氢钠、枸橼酸、淀粉、羟甲基纤维素钠中的任意一种或者多种、甲基纤维素中的任意一种或者多种。常用的载体包括微球、纳米粒、脂质体中的任意一种。

[0069] 下面以溶液剂为例对该溶液剂的制备方法进行说明：

[0070] 本发明将miR‑361‑3p制备并包装一种口服给药制剂，其中可提取安全有效量的式(I)所示的miRNAs,然后以溶液形式给予猪只。或者本发明公开的miRNAs可制备并包装为单位剂型,其中每个物理.上离散的单位含有安全有效量的式(I)所示的miRNAs。当以单位剂型制备时,本发明公开的上述溶液剂中所含miR‑361‑3p的有效含量为10nM/g。

[0071] 将化学合成100nM miRNAs(miR‑361‑3p)和80g淀粉、20g蔗糖和100mL灭菌水混合，分装，得到一种防治猪繁殖与呼吸综合征的溶液剂。

[0072] 为了对上述制备的溶液剂的效果进行验证，我们选取30只新疆石河子市当地猪场中患有猪繁殖与呼吸综合征的猪只，除了每日饲喂正常食物外，给它们每日饲喂上述制备的溶液剂7天，每日单只的药物量不超过5mg。7天后，对猪只进行猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，再次统计感染猪繁殖与呼吸综合征的猪只的数量。

[0073] 经统计，30只猪只中仅有13只患有猪繁殖与呼吸综合征的猪只。该结果表明，对猪只给予上述制备的溶液剂可以治疗猪繁殖与呼吸综合征，治疗有效率为56.7％。

[0074] 上述实验结果证明，本发明提供的miRNAs为miR‑361‑3p具有抑制猪繁殖与呼吸综合病毒复制的能力，可以为制备治疗和预防感染猪繁殖与呼吸综合病毒的药物提供一个物质基础，进而可推进相关药物体系的构建。

[0075] 本发明所提供的miRNAs(miR‑361‑3p)靶向PRRSVnsp11、PRRSV nsp12，靶向区域分别为：猪繁殖与呼吸综合征病毒的nsp1211870‑11893和猪繁殖与呼吸综合征病毒的nsp1111337‑11365，进而抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制，为研发抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染药物提供了新思路，并且能够推进与感染猪繁殖与呼吸综合病毒的相关药物体系的构建。

[0076] 需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

[0077] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0078] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。