[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及巨大芽孢杆菌LY114及其在奶酪制作中的应用。

[0002] 凝乳酶是奶酪制作和乳品加工中的关键酶制剂。凝乳酶可以使奶液凝固并影响奶酪的产量、质地、风味等。传统凝乳酶主要来源于动物，如小牛、羔羊、骆驼等。最常用的传统凝乳酶是小牛皱胃酶，它可以从哺乳小牛的第四个皱胃中获取。然而传统凝乳酶具有生长周期长、生产成本高等劣势，寻找传统凝乳酶优质替代物引起了人们极大的兴趣。国内目前对凝乳酶的研究相对滞后，凝乳酶的供应主要依靠国外生产，国内仅有一些科研机构对其进行了较为系统的研究。我国的原制干酪生产工业尚未形成规模化生产，在国内的乳制品消费中占有较少的比重，因而对其生产与加工的研究相对较少。随着国内奶酪市场的不断扩大，以及国内食品加工业的发展，世界范围内的凝乳酶需求量将会进一步加大。因此，提高凝乳酶的产率，提高其产品品质，是推动我国奶业发展的重要因素。

[0003] 与植物源和动物源的凝乳酶相比，微生物来源的凝乳酶生产成本低，提取容易，经济效益高，生化多样性更广，可以很好地解决小牛皱胃酶供应不足的问题。目前，对细菌源凝乳酶的研究还不多，有关的研究多以枯草芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌为研究对象，且存凝乳活力低、蛋白水解活性高等问题，已成为影响其研究开发及开发利用的瓶颈。与真菌的固态发酵相比，细菌的浸入式发酵在控制发酵程度和物质利用率方面具有明显优势，同时，通过对新菌种进行筛选，优化其发酵工艺，可以有效地解决细菌源凝乳酶的MCA/PA比值较低的问题。因此，关于细菌凝乳酶的研究也越来越多。

[0004] 从优质原料中筛选出高产凝乳酶的细菌菌株，确定最佳发酵工艺，并对此菌源凝乳酶的凝乳特性进行分析，以确定其凝乳特性能否达到后期干酪生产的要求，对丰富产凝乳酶菌株库及扩大其开发生产具有重要意义。从天然原料中分离得到的凝乳酶活力不高，发酵周期长，在纯化过程中酶活有较大损失，其特性不能很好满足干酪生产的需要。

[0034] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0035] 实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均视为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。

[0036] 实施例中测凝乳酶活力(MCA)的步骤如下：

[0037] 取Vs体积的未稀释或用0.05 mol/L、pH 7.0 PBS稀释一定倍数的巨大芽孢杆菌发酵上清液在35℃水浴中孵育10 min，加入到VE体积的含有10 mM CaCl2的10％(w/v)脱脂乳溶液中，每15 s将样品取出并倾斜45°观察样品状态，若无变化则快速放回水浴，形成不连续颗粒时停止计时，并记为时间T。

[0038] MCA＝(2400×VS×N)/(T×VE)。式中：MCA为凝乳酶活力(SU/mL)；Vs为脱脂乳底物体积(mL)，VE为酶液体积(mL)，T为凝乳时间(s)，N为MCE稀释倍数。

[0039] 实施例中用考马斯亮蓝法和凯氏定氮仪测定样品蛋白含量，其中考马斯亮蓝法步骤如下：

[0040] Bradford工作液配置方法为：100 mg考马斯亮蓝G250，40 mL 95％乙醇，100 mL 85％磷酸，去离子水定容至1 L；绘制蛋白质样品标准曲线；加入20μL的样品稀释液，以及
200μL Bradford工作液迅速混匀，室温25～30℃，反应5 min后，在酶标仪上测各孔的A595值。

[0041] 实施例1：巨大芽孢杆菌LY114的获得

[0042] 根据宁夏、云南、黑龙江、山东等地奶牛场中筛选得到的90余株菌中通过分析各菌株在酪蛋白平板上形成的沉淀圈和水解圈情况，确定具有产凝乳酶能力的菌株，其中部分优选菌株的形态和凝乳潜力见表1。进一步分析具有产凝乳酶能力的菌株单菌落在酪蛋白平板上不同时间点菌落直径、沉淀圈与水解圈直径的比值情况，挑选比值较大的菌株。对挑选的若干菌株进行发酵培养，测定分析不同发酵时间蛋白酶水解活力，所产凝乳酶的凝乳活力、蛋白水解活力及凝乳后的脱脂乳pH值，选择具有凝乳活力大、蛋白水解活力小的非产酸特性菌株。通过16S rDNA测序、绘制同源性系统发育树(见图1)、API 20E理化实验、API 50 CHB鉴定和产酶情况复筛，获得一株高产凝乳酶的巨大芽孢杆菌LY114并获得登陆号ON714523，并且保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26730。

[0043] 表1部分优选菌株的形态和凝乳潜力

[0044]

[0045]

[0046] 注：“+”为阳性；“–”为阴性。

[0047] 实施例2

[0048] (1)将巨大芽孢杆菌LY114涂布、划线培养12h，然后接种于改良后的TYC培养基中37℃，180r/min震荡培养10～12h得到种子液，所述菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)LY114，保藏编号为CGMCC No.26730；改良TYC培养基为：葡萄糖50g，酪蛋白胨
15g，氯化钠1g，碳酸氢钠2g，L‑胱氨酸0.2g，磷酸氢二钠2g，酵母膏5g，去离子水定容至
1000mL，115℃灭菌20min；

[0049] (2)将上述种子液以5％接种量接种于发酵培养基中于37℃，180r/min震荡培养36～48h得发酵液，将所得到的发酵液低温离心取上清液，所述百分比为体积百分比，发酵培养基为：去离子水1000mL，熟小麦细麸皮60g，可溶性淀粉10g，玉米浆3g，115℃灭菌20min；

[0050] (3)将硫酸铵与步骤(2)中所得的上清液混合，硫酸铵饱和度为60％，于4℃下沉淀2h，低温高速离心弃上清，收集沉淀，复溶于20mmol/L pH 7.0的Tris‑HCl缓冲液中，于4℃下搅拌透析12h，经冷冻干燥后得粗制凝乳酶粉末，冷冻干燥条件为：‑80℃预冻300min；‑80℃冻干800min；

[0051] (4)将粗酶溶于20mmol/L pH 7.0的Tris‑HCl缓冲液，通过0.22μm滤膜，经DEAE‑Sepharose Fast Flow阴离子交换层析分离纯化并透析、冻干后得到凝乳酶产品，冻干条件为‑80℃预冻300min；‑80℃冻干800min，DEAE‑Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，体积为5mL，起始洗脱条件为20mmol/L pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液，流速为0.5mL/min，透析条件为：
4℃下搅拌透析12h；

[0052] (5)将步骤(4)所得凝乳酶产品溶于去离子水中，探究该巨大芽孢杆菌凝乳酶在后期奶酪制作过程中所具备的优良性质。

[0053] 在实施例2的基础上，采用不同的发酵时间进行对比。

[0054] 表2巨大芽孢杆菌LY114 MCE的MCA随发酵时间的变化

[0055]

[0056] 表2的结果说明当LY114以改良TYC作为培养基，发酵时间为48h时，凝乳活力值达到最大448SU/ml。同时说明，LY114菌株的天然发酵凝乳活性较一般芽孢杆菌高，故本发明选择的发酵时间为48h。

[0057] 实施例3

[0058] 表3凝乳酶的纯化

[0059]

[0060] 如表3所示，在实施例2的发酵培养基基础上采用本实施例的一种巨大芽孢杆菌凝乳酶的制备方法后，纯化比酶活为7532SU/mg，得率为34.17％，提纯比达到4.83，凝乳酶纯化后比酶活、得率和提纯比都有提高。

[0061] 实施例4

[0062] 表4不同蛋白酶抑制剂对LY114 MCE的影响

[0063]

[0064]

[0065] 如表3所示，LY114凝乳酶可以被EDTA(1‑25mM)显著抑制，不受其他蛋白酶抑制剂的影响。不同的蛋白酶抑制剂可以决定酶的种类。Pepstatin A、EDTA、PMSF和DTT分别是天冬氨酸、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸抑制剂。结果表明LY114凝乳酶为金属蛋白酶。

[0066] 实施例5

[0067] 取凝乳酶成品，分别配置pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的脱脂乳溶液，测定不同pH条件下的凝乳酶活力。结果如图2所示，随着pH的升高，凝乳酶酶活力逐渐下降，当pH达到7.5时基本失活，在pH5.5得脱脂乳溶液中，相对酶活最大，凝乳形态如图5所示。

[0068] 实施例6

[0069] 取凝乳酶成品，分别于35、40、45、50、55和60℃水浴中分别孵育10、20、30、40和50min，以脱脂乳溶液为底物，测定凝乳酶活力。结果如图3所示，当温度增加到45℃，酶活呈明显下降趋势，在60℃下水浴30min，酶活几乎完全消失。

[0070] 实施例7

[0071] 取凝乳酶成品，分别配置含有0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100mM CaCl2的脱脂乳溶液，测定不同钙离子浓度下的凝乳酶活力。结果如图4所示，凝乳活力在含有30mM 2+
Ca 的脱脂乳溶液中达到最大，是对照组的1.8倍。

[0072] 实施例8

[0073] 将牛奶巴氏杀菌后冷却，加入活化后的发酵剂进行发酵和预酸化。当牛奶pH降至6.3时加入0.1g/L CaCl2，混匀后立即加入凝乳酶溶液，等待凝乳。凝乳结束后，将其切割成均匀的乳块并静置3‑5min。随即进行搅拌和升温，排乳清结束后，将聚集的乳块切割成小块并加入食盐搅拌均匀。最后将其入模并置于6℃中成熟14天，结果如图6所示。