[0001] 本发明属于生物检验检测技术领域，具体涉及一种快速SPR检测系统。

[0002] 现有技术中的用于SPR检测的生物传感芯片，采用的是整块的金属膜，仅仅允许待测物与SPR芯片表面自然结合，其花费时间长，通常要为2小时以上，检测期间由于气温等外界环境影响对实验结果影响很大，同时时间过长会让溶液蒸发导致实验失败。

[0023] 本实施例中的用于SPR检测的生物传感芯片，应用于一快速SPR检测系统，该系统基本如图1所示，基于典型的棱镜耦合型SPR检测基础平台结构，包括光源、R1宏观角分辨光谱测量仪、耦合有用于SPR检测的生物传感芯片的棱镜、光纤光谱仪和电脑，除此之外还增加了阻抗分析仪。

[0024] 光源，用于产生不同频率、不同功率的入射光。

[0025] R1宏观角分辨光谱测量仪，是本实施例中SPR检测基础平台中的光学平台，用于搭载耦合有生物传感芯片的棱镜；光源通过光纤连接到R1宏观角分辨光谱测量仪的入射端上。

[0026] 光纤光谱仪，通过光纤连接到R1宏观角分辨光谱测量仪的出射端上，用于接收光信号并进行数据测量；

[0027] 电脑与光纤光谱仪连接，用于从光纤光谱仪获取数据并进行处理。

[0028] 光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种光学物理现象，当一束P偏振光在一定的角度范围内入射至透光介质与金属膜的交界面时，该交界面上会产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，会引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。利用SPR检测方法进行检测分析时，先在SPR生物传感芯片的金属膜上固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过金属膜表面，若样品中有能够与金属膜表面的生物分子识别膜相互作用的分子，则会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过检测SPR角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息。

[0029] 本实施例中所建立的用于SPR检测的透光介质‑金属膜交界面为棱镜‑金属膜交界面(Kretschmann结构)，根据现有的SPR检测技术以及SPR检测的原理可知，本发明的另一些实施例中，允许建立各种可以产生SPR效应的透光介质‑金属膜交界面进而被用于SPR检测，例如棱镜‑间隙‑金属膜交界面(Otto结构)、光纤‑金属膜交界面(光纤型衰减全反射耦合)、光波导‑金属膜交界面(光波导型衰减全反射耦合)等，这些交界面设置所对应的基础检测系统较为现有，在此不按，而这些实施例中的用于承载待测物质的金属膜均为电极阵列形式的金属膜，因此皆不被排除在本发明所要保护的范围之外。

[0030] 本实施例中，生物传感芯片上用于承载待测物质的金属膜为电极阵列形式的金属膜，并且，本实施例中采用一阻抗分析仪与金属膜电性连接，用于向电极阵列施加能产生交流电动效应的交流电信号，同时测量生物传感芯片的电容变化。

[0031] 在另一些实施例中，还可以采用阻抗分析仪等电学仪器测量生物传感芯片的阻抗、相位、电阻、电容、电感等一种或几种参数的变化。

[0032] 图2中示出了一种示例性的电极阵列形式的金属膜，包括了接触电极部分和叉指电极部分，金属膜的材质为金(Au)，厚度为50nm‑100nm，从图中可以看到，左右两侧各设有一组接触电极部分和叉指电极部分，其中叉指电极部分为多条平行的条状电极，这些条状电极的一端连接在接触电极部分，而接触电极部分则用于连接交流电信号源，左右两侧接触电极部分各自连接的叉指电极相互间交错设置，进而形成了叉指电极对。

[0033] 在一些实施例中相邻叉指之间的间隙为5um、条状电极长度400um、条状电极宽度5um；

[0034] 在另外一些实施例中相邻叉指之间的间隙为5um、条状电极长度400um、条状电极宽度10um。

[0035] 生物传感芯片上的金属膜在用于检测前，需要根据待测物质的不同，进行不同的表面修饰，即对生物传感芯片进行功能化，具体过程本领域技术人员较为熟知，在此不做赘述。

[0036] 如图3中(a)部分所示，生物传感芯片与棱镜的耦合方式可以是但不限于，将金属膜直接镀在棱镜的底部上，依托棱镜直接产生棱镜‑金属膜交界面，该方式灵敏度高，稳定性好，但回收利用性较差，不宜多次使用。

[0037] 如图3中(b)部分所示，生物传感芯片与透镜的耦合方式还可以是但不限于，将金属膜镀在与棱镜折射率基本一致的玻璃基片上，形成一具有基底的生物传感芯片，再通过折射率匹配液将玻璃基片粘连在棱镜底部，玻璃基片被视棱镜的延长，玻璃基片‑金属膜交界面即为棱镜‑金属膜交界面，该方式灵敏性和稳定性将有所下降，但芯片可重复利用，大大降低了成本。

[0038] 在一些实施例中，透镜和玻璃基片采用但不限于折射率为1.514的K9，相应的折射率匹配液则选用折射率为1.5148—1.5152的香泊油。

[0039] 在利用本实施例中的系统实施SPR检测时，向电极阵列施加能产生交流电动效应的交流电信号，在其表面激发交流动电效应(ACEK)，从而加速电极表面对待测物质的富集，加快待测物质在功能化了的电极表面的固定速度，进而达到缩短SPR检测整体耗时的效果。

[0040] 实验例

[0041] 本实验例基于实施例中给出的SPR检测系统，实施ACEK与SPR联用的乳腺癌ctDNA分子检测，整体系统设计如图4所示，所用的光学系统的主体是R1宏观角分辨光谱测量仪，它提供测试平台，并用于入射光角度调制以及反射光的接收。它的一端接有卤素灯光源，光源通过入射臂照射到测试平台上，R1宏观角分辨光谱测量仪的另一端通过光纤接入光谱仪，通过光谱仪接收反射光信息并在计算机上显示出来。

[0042] 在测试前，需要通过R1宏观角分辨光谱测量仪的调节旋钮对测试平台进行水平调整，并用水平仪校准，保证平台平面与入射臂保持平行。然后将定制的K9直角棱镜与经过功能化的传感芯片通过折射率匹配液粘在一起，放入测试装置内，置于测试平台上，调节测试台高度以及衰减器，通过观察光谱强度，找到测试台的最佳入射高度，使得从入射臂入射的光通过棱镜反射后尽可能多地被反射臂接收到，以保证后续测量能够产生足够的光谱响应。至此，光学系统已经搭建完成。在电学系统中，阻抗分析仪是核心部件，用于产生ACEK效应所需的交流电激励，同时采集传感电极表面因探针与ctDNA结合而产生的交界面电容变化，并在计算机上显示。

[0043] 在本实验中，以PIK3CA基因的E542K位点突变合成乳腺癌ctDNA分子(序列:5'‑AACAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAG AAAGATTTTCTATGGAGTC‑3'，)，以与上述ctDNA具有互补序列并在5'端修饰有巯基(‑HS)的单链DNA(序列：5'‑AGTGATTTCAGAGAG‑3')作为探针；用超纯水将1×PBS(PH7.2‑7.4)缓冲液稀释至0.05×PBS，以0.05×PBS缓冲液作为探针的背景溶液，把100μM的探针原液稀释为20μM；用超纯水将20×SSC(PH7.4)缓冲液稀释至1×SSC，以1×SSC缓冲液作为ctDNA的背景溶液，把100μM的ctDNA原液稀释为0.01pM、0.1pM、1pM和10pM四个浓度梯度；使用6‑巯基己‑1‑醇(6‑mercapto‑1‑hexanol，6‑MH)作为封闭液用0.05×PBS稀释至1mM；另以香柏油作为棱镜折射率匹配液，其折射率为1.5148—1.5152，酸值<60。

[0044] 在棱镜耦合的SPR激发过程中，光从棱镜的侧面入射，从另一侧面出射，其光路如图5所示。首先，入射光经过棱镜侧面折射进入棱镜，然后，在棱镜‑金属膜交界面发生全反射并激发表面等离子体效应，最后再经过棱镜另一侧面折射出射，并被光电探测器接收。现有技术中，对棱镜耦合中激发SPR的全反射入射角进行仿真实验，发现当入射角为70°时，光谱吸收最为明显，这个角度可以拟定为产生表面等离子体共振的最佳入射角。以此为基础，可以计算出光进入棱镜的入射角，以及R1宏观角分辨光谱测量仪光源的入射角度。本实验例中使用K9等腰直角棱镜作为耦合棱镜，已知K9棱镜的折射率n＝1.514。根据光的折射定律，棱镜侧边入射角θin，全反射入射角θc与R1宏观角分辨光谱测量仪光源入射角θR1之间的关系如下：

[0045] θin＝arcsin(nsin(θc‑45°))

[0046] θR1＝θin+45°，

[0047] 计算可得θin＝39.780°，θR1＝84.780°，可近似为85°。因此，可以确定85°作为P1光源最佳入射角。

[0048] 本例中生物传感芯片采用K9玻璃基片为基底，基底上用于承载待测物质的金属膜为叉指电极对形式，厚度为50nm，相邻叉指之间的间隙为5μm、条状电极长度400um、条状电极宽度5um，其表面功能化具体过程如下：

[0049] ①清洗，取新的表面无划痕的生物传感芯片，将其上叉指电极对经过丙酮——超声——超纯水——异丙醇——超声——超纯水清洗干净，氮气吹干；用万用表测量叉指电极对两端的电阻，需达到100MΩ以上。

[0050] ②紫外——臭氧表面处理，增加叉指电极对表面的亲水性。

[0051] ③在叉指电极部分固定硅胶围栏形成测量腔室。

[0052] ④DNA探针孵育，在固定好的硅胶围栏中滴加20μL的DNA探针溶液，然后将芯片放在加湿器中，在恒温箱中5℃恒温孵育24h。

[0053] ⑤位点封闭，在探针孵育完成后，用缓冲液清洗2‑3次，再滴加20μL的6‑巯基己‑1‑醇(6‑MH)封闭液，在恒温恒湿条件下封闭1小时。

[0054] ⑥清洗，封闭之后，用缓冲液清洗2‑3次，叉指电极对表面功能化完成。

[0055] 本实验例所用光谱仪是复享紫外‑可见光谱仪PG2000‑Pro，波段为200～1100nm；R1宏观角分辨光谱测量仪转台转动步距角最小为0.0012°；TH2839阻抗分析仪，测试频率：
20Hz‑10MHz，f≤2MHz时，AC电压范围为5mVrms～2Vrms；另外还有匹配的卤素灯光源及K9玻璃等腰直角三棱镜等。

[0056] 测试前，在K9棱镜表面滴加适量的折射率匹配液，将完成表面功能化的生物传感芯片与棱镜底部粘在一起，并用测试装置固定好。

[0057] 测试中，将未滴加溶液的生物传感芯片作为参比，先测试背景溶液，然后按照样品浓度梯度依次进行测试，每个浓度重复测试3‑5次。

[0058] 测试后，用过的生物传感芯片经过异丙醇——超声——超纯水冲洗干净，氮气吹干，密封保存以备用。

[0059] 在本实验例中，除了SPR测试，还会利用阻抗分析仪测量的交界面电容数据完成ACEK测试，ACEK测试与SPR测试会同时得到光谱数据以及交界面电容数据，两种数据既独立成立又可以互相补充，阻抗分析仪得到的电容数据可以反映样品浓度，其分析处理方法现有技术中多有记载，在此不按。SPR波长调制测试可以得到样品反射率与波长的关系，滴加不同的样品，因其折射率不同，产生SPR效应的共振波长不同，此时会得到不同浓度ctDNA样品的初始共振波长；在ACEK的富集作用下，叉指电极对表面上的探针与ctDNA结合，此时的SPR共振波长也会随之改变，不同浓度ctDNA样品将得到不同的共振波长，对特异性结合之后的光谱图像进行多项式拟合，找到共振峰位置，分析SPR共振峰位置与ctDNA浓度的对应关系，可以得到两者之间的函数表达式。另外，因为光谱图像包含一定的噪声，本例中还采用最小二乘平滑滤波的方法对原始图谱进行滤波。

[0060] 根据前述的实施例可知，在本实验的SPR测试过程中，需要给叉指电极对施加交流电信号，本实验例中，将完成表面功能化的生物传感芯片放置在测试腔中，将测试腔关闭扣好，测试腔外壳的金属接触柱可与阻抗分析仪的测试夹相接，阻抗分析仪产生的交流电信号通过接触柱加到叉指电极对两端，同时与棱镜通过折射率匹配液粘在一起的生物传感芯片基于光学系统工作。

[0061] 为了验证过ACEK效应对ctDNA分子的富集效果，证明它确实可以加速电极对表面探针与待测分子的结合，缩短反应时间，本实验中在时序测量模式下进行SPR对比测试；其中，以1pM浓度的ctDNA作为测试样品，采用在相同的条件下进行表面功能化的生物传感芯片，一枚用于单独的SPR传感测试只连接光学系统，无交流电激励；另一枚同时连接光学系统和电学系统，并在传感电极上施加20kHz，100mV的交流电，除此之外的其他实验条件相同，测试结果如图6所示。

[0062] 图6(a)中展示了未加交流电压激励，单独进行SPR传感测试的时序光谱图，图6(b)表示施加交流电压激励，利用ACEK效应进行SPR测试的时序光谱图。两个图中从滴加样品开始反应，到结合接近饱和，即曲线趋于平缓时，光谱响应的差值相同。在这个过程中，单独的SPR测试时间为2500s，而加了交流激励后，反应仅用了660s。这表明ACEK效应对ctDNA分子起到了富集作用，将反应时间缩短了73.6％，有效提高了分子间结合效率。其次，两图中虽然都表现出前期反应速度较快，后面逐渐变慢并最终趋于平缓的趋势，但是图6(a)中从1500s以后反应速率已经很小，开始缓慢爬升，表明此时的分子间结合已经非常缓慢；而图6(b)中直到最后100s曲线才趋于平缓，并且在之后的一段时间内还会以小速率上升，说明后者在整个反应过程中，不仅结合速率提高了，最终的分子结合量也会增加。但是由于ctDNA分子的半衰期较短，且在自然环境中受到污染而降解的风险较大，所以不宜进行长时间测试，否则测试结果将存在较大误差，可见缩短测试时间对于提高测试的精度意义重大。

[0063] 现有技术中，基于ACEK效应检测方法只能基于后期数据分析进行判断，并且，由于无法实时监测反应过程，在实验室研究中，如果某次实验失败，不能及时发现问题所在，无法判断是所施加的交流电出现问题，还是电极接触的问题，或者是电极功能化过程中出现问题，即探针没有成功孵育到电极表面。而单一的SPR生物传感只能依靠ctDNA分子的自由扩散，与金属膜表面的探针结合，这个过程是非常缓慢的，这意味着每一次检测都要花费较长时间，并且在这个过程中ctDNA分子可能受到环境污染而失效。本实验例中将ACEK效应与SPR技术联用的方式不仅可以实现快速检测，而且能够实时监测分子结合状态；两种方法还可以相互验证，对于同一样品检测，可以通过光学系统测得的SPR共振波长与样品浓度关系和电学系统测得的交界面电容变化率与样品浓度关系共同进行分析，使得检测结果更加可靠；另外，在实验中出现问题时可以互相对照，更容易找出问题所在。例如，如果不确定某一次实验失败原因是否是由于电极表面探针孵育失败而造成的，可以对功能化前后的电极分别作反射光谱分析，如果前后共振波长相同或者相差甚微，那么就说明探针孵育失败或者探针孵育量过小，不足以获得可测量的信号。ACEK与SPR联用的测试结果，根据各自的标准方程计算出的浓度应在某一确定的数值区间内，若二者数值不等，可取其中灵敏度较高的数据作为最终结果；若二者计算结果相差较大，且经过反复实验验证，数值仍相差较远，则说明其中一个或者两个标准方程需要进行进一步修正，这样可以实现对系统的自查，减少样品检测中的误判。

[0064] 本实施例中的SPR检测的生物传感芯片，除了如上的应用于肿瘤相关的检测外，还可以但不限于应用在食品或药品残留等不同的检测中。检测中的待测物质则可以是但不限于抗原抗体、DNA/RNA、酶、脂类、多肽、小分子化合物或微生物中的一种或多种。

[0065] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。