[0001] 本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。

[0002] 烟草真菌性病害是烟草在一定环境条件下受到病原菌寄生而引起的，在烟草种植的苗期、大田期以及采收期均有出现，并对其根茎叶各部分都造成不同程度的损害。常见的烟草真菌性病害包括：立枯病、根腐病、蛙眼病、炭疽病、黑胫病等；病害发生的原因在于：首先，多数烟草病害的病原菌能在土壤中或病残体中越冬，成为第二年的初侵染源，烟草生长期又借助风雨、昆虫、流水、土杂肥及农事操作传播，引起再侵染。其次，苗床及大田期高温多雨、重茬高湿的烟地以及种植过密，偏施氮肥和管理粗放等原因也会导致烟草真菌性病害的频发。且又由于目前我国种植的烤烟品种较为单一，耕地复种指数高，难以休闲轮换以及长期的大量施用化肥农药，导致土壤板结及土壤理化性状发生改变，土壤中有益微生物种群和数量骤减，自身修复能力降低，从而导致土传病菌和真菌的数量加剧，烟株抗逆性下降，严重影响和制约了烟草生产。

[0003] 预防烟草真菌类病害的发生，一方面，要合理施肥，科学轮作换茬，选育优良抗病品种以及加强植株栽培管理，避免或减少烟草真菌性病害的侵染；另一方面，通过对多种烟草真菌性病害的发病特点和规律进行研究，从而得到一种具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂及其配套使用方法，用于烟草种植的绿色防控，有效替代化学农药的使用，减少环境污染，增加植株安全性，从而提高经济效益。

[0004] 目前，市售的各类菌剂产品存在功效较差，防控对象单一，但价格昂贵，且对生态环境不友好等诸多问题。

[0005] 目前，缺乏一种绿色环保的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。

[0043] 通过以下试验例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些试验例的任何限制。

[0044] 实施例1

[0045] 本发明的一种具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌株(Bacillus velezensis)，所述的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌株的保藏名称为Bacillus velezensis YC2177，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏日期：2021年12月17日；保藏编号：CCTCCNO：M 20211635。

[0046] 所述的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌株的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

[0047] 本发明所述的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂。其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

[0048] (a)所述的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂的发酵培养物；

[0049] (b)所得具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂的孢子悬液；

[0050] (c)所得具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂细胞的超声裂解沉淀。

[0051] 本发明所述的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化，将‑85℃下保存的贝莱斯芽孢杆菌在LB固体培养基上进行活化，采用划线培养的方式，于35℃条件下培养24h，挑取单菌落在固体培养基上继续进行划线培养，在35℃‑37℃条件下培养24‑48h，得到活化的菌株；所述的LB固体培养基由如下组分组成：细菌学蛋白胨20g，酵母提取粉10g，琼脂粉10g，水2L。

[0052] (2)种子液制备，用无菌接种环刮取第一步中已活化的菌株接种到50ml的LB液体培养基中，在温度35℃、转速150rpm条件下培养24h，得到该菌株的种子液；

[0053] (3)发酵液制备，将活化培养的种子液按照35‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为35℃，转速为130rpm/min条件下培养48h，得到发酵液；所述的发酵液的有9
效活菌数大于2.0×10cfu/mL；

[0054] 所述的LB液体培养基由如下组分组成：细菌学蛋白胨20g，酵母提取粉10g，琼脂粉10g，水2L。

[0055] 所述的发酵培养液包括按重量份计的如下组分组成：牛肉膏3份、黄豆粉2份、蔗糖0.8份、蛋白胨3份、玉米粉2份、碳酸钙1.5份、硫酸铵0.8份、硫酸镁0.5份、鱼粉1.5份、磷酸二氢钾0.05份、磷酸氢二钾0.1份、氯化钠4份、消泡剂0.1份，水1000份，采用盐酸、氢氧化钠调节pH至7.3。

[0056] (4)菌粉制备，将发酵液导入离心机中，离心后排除上层清液，得到菌种浓缩液，并10
使菌种浓缩液中的贝莱斯芽孢杆菌YC2177的有效活菌数不小于1×10 cfu/mL；将菌种浓缩液进行喷雾干燥制得芽孢杆菌菌粉，包括如下过程：将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入10％的辅料，通过0.9Pa的压力将所述的菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为
3
20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m/h的热风进行干燥，得到有效活菌
11
数不小于1×10 cfu/g菌粉。

[0057] 所述的喷雾干燥的辅料包括按重量份计的如下组分组成：硅藻土55‑65份，碳酸钙15份，淀粉18份。

[0058] 本发明的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌株在生产用于防治烟草真菌病制剂中的应用。

[0059] 本发明具有兼防多种烟草真菌病害的微生物菌剂，其应用方法如下：

[0060] 1、菌剂产品直接应用于烟草种植

[0061] 菌剂产品在烟草育苗和移栽时进行灌根、蘸根处理，应用时将菌剂兑水稀释1000倍，用于蘸根和灌根，菌剂施用量为1kg/亩，可对多种烟草真菌类病害进行防治。

[0062] 菌剂产品在烟草植株移栽后的30、40、50d进行兑水喷施，应用时将菌剂兑水稀释1500倍，菌剂施用量为0.3kg/亩，通过叶面喷施的方式进行地上部分整株喷施。

[0063] 2、制成育苗基质进行应用

[0064] 菌剂与育苗基质混合后用于烟草育苗，在苗期进行功能菌种的定殖，避免各种真菌病害的发生，基质和菌剂按照质量比1000:1进行混合，用于育苗。

[0065] 烟草育苗基质的制备方法为：采用沼渣肥、蚯蚓粪、椰糠、珍珠岩和蛭石作为主要原料，各原料的重量配比为沼渣肥：蚯蚓粪：椰糠：珍珠岩：蛭石＝4：2：2：1：1。各原料按配比进行混合之后得到烟草育苗基质。生产原料要求符合有机农业生产资料的要求，符合GB 38400‑2019的相关规定。

[0066] 3、制成生物有机肥进行应用

[0067] 菌剂与有机肥料混合制成生物有机肥，用于烟草移栽时底肥的施用，在烟苗进入大田时进行功能菌种的定殖，避免各种真菌病害的发生。具体为有机肥料和菌剂按照质量比1000:1进行混合制成生物有机肥，生物有机肥每亩施用量50kg，可以采用穴施、撒施的方法进行施用。

[0068] 具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂与有机肥料混合制成生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：

[0069] (1)有机肥料的发酵：按照重量份数计称取菜籽枯750份、菊花渣50份、活化腐植酸100份、腐熟剂5份，均匀混合后，发酵物料的C/N为25‑30:1，调节物料的水份的质量百分比为45％‑55％，pH为7.0‑7.5，将物料堆码发酵，发酵温度至55℃开始翻堆，控制发酵温度为
55‑65℃，发酵时间为20天，温度逐渐下降到室温，制得发酵好的有机肥料；

[0070] (2)有机肥料的后熟。将第一步中发酵好的有机肥料转移到后熟车间，在通风静置的条件下进行10‑15天的后熟。

[0071] (3)功能菌种的添加。有机肥料发酵完成后，将功能菌种发酵液添加到肥料中，混合均匀，得到生物有机肥半成品。

[0072] (4)将第三步中的混合物筛分、包装后，制得生物有机肥成品。

[0073] 实施例2

[0074] 实施例2与实施例1的区别在于：

[0075] 本发明所述的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：在步骤(1)中，菌种活化，将‑85℃下保存的贝莱斯芽孢杆菌在LB固体培养基上进行活化，采用划线培养的方式，于37℃条件下培养48h，挑取单菌落在固体培养基上继续进行划线培养，在35℃‑37℃条件下培养24‑48h，得到活化的菌株；

[0076] 在步骤(3)中，发酵液制备，将活化培养的种子液按照5‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为38℃，转速为100rpm/min条件下培养50h，得到发酵液；所述的发9
酵液的有效活菌数大于2.0×10cfu/mL；

[0077] 所述的LB液体培养基由如下组分组成：细菌学蛋白胨20g，酵母提取粉10g，琼脂粉10g，水2L。

[0078] 所述的发酵培养液包括按重量份计的如下组分组成：牛肉膏1份、黄豆粉4份、蔗糖1份、蛋白胨2份、玉米粉3份、碳酸钙0.8份、硫酸铵1份、硫酸镁1份、鱼粉2份、磷酸二氢钾0.1份、磷酸氢二钾0.07份、氯化钠1份、消泡剂0.3份，水1000份，采用盐酸、氢氧化钠调节pH至
7.0。

[0079] 在步骤(4)中，所述的喷雾干燥的辅料包括按重量份计的如下组分组成：硅藻土55份，碳酸钙20份，淀粉15份。

[0080] 实施例3

[0081] 实施例3与实施例1的区别在于：

[0082] 本发明所述的具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：在步骤(1)中，菌种活化，将‑85℃下保存的贝莱斯芽孢杆菌在LB固体培养基上进行活化，采用划线培养的方式，于36℃条件下培养40h，挑取单菌落在固体培养基上继续进行划线培养，在35℃‑37℃条件下培养24‑48h，得到活化的菌株；

[0083] 在步骤(3)中，发酵液制备，将活化培养的种子液按照1‰的比例接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为36℃，转速为150rpm/min条件下培养60h，得到发酵液；所述的发9
酵液的有效活菌数大于2.0×10cfu/mL；

[0084] 所述的LB液体培养基由如下组分组成：细菌学蛋白胨20g，酵母提取粉10g，琼脂粉10g，水2L。

[0085] 所述的发酵培养液包括按重量份计的如下组分组成：牛肉膏2份、黄豆粉3份、蔗糖0.5份、蛋白胨2.5份、玉米粉2.5份、碳酸钙1.2份、硫酸铵0.5份、硫酸镁0.8份、鱼粉1份、磷酸二氢钾0.08份、磷酸氢二钾0.05份、氯化钠5份、消泡剂0.2份，水1000份，采用盐酸、氢氧化钠调节pH至7.5。

[0086] 在步骤(4)中，所述的喷雾干燥的辅料包括按重量份计的如下组分组成：硅藻土65份，碳酸钙25份，淀粉25份。

[0087] 试验例1

[0088] 采用本试验例产品进行蘸根、灌根验证其效果

[0089] 本试验例菌剂可以在烟草育苗期和移栽后进行蘸根、灌根处理，用于多种烟草真菌性病害的综合防治，通过菌剂兑水稀释1000倍，用于烟苗蘸根、灌根处理，1kg/亩。

[0090] 1 试验材料及方法

[0091] 1.1 试验时间及地点

[0092] 试验安排于2021年3‑9月，在马龙县大庄乡湾子村，试验地为常年连作的地块，海拔为1894.5m，坐标为(103.477205°E，25.224440°N)；选择有代表性的因为连作和环境问题所导致的多种烟草真菌性病害频发的烟地。

[0093] 1.2试验地土壤、地势等基本情况

[0094] 1.2.1试验地情况

[0095] 试验安排在马龙县大庄乡湾子村，海拔为1894.5m，坐标为(103.477205°E，25.224440°N)，土壤肥力中等、均匀；地势低洼，长年连作和管理粗放等原因导致多种烟草真菌性病害频发的烟区。

[0096] 1.2.2试验品种：云烟87

[0097] 1.3试验设计

[0098] 试验采用随机区组试验的方式，设置3个处理、3次重复，共计9个小区。具体如下：处理A(常规施肥)：烟草专用复合肥40kg/亩+硝酸钾5kg/亩+硫酸钾15kg/亩；处理B：在常规施肥的基础上进行当地常规真菌病害防治；处理C：在常规施肥的基础上，在烟草育苗期和移栽后通过菌剂兑水稀释1000倍，用于蘸根、灌根，1kg/亩。

[0099] 蘸根、灌根处理方式：烤烟漂浮苗移栽到穴前，其根部浸泡于稀释了1000倍的贝莱斯芽孢杆菌YC2177所制菌剂溶液中，3‑5分钟后将其移栽穴中，用土覆盖烟苗根系进行育苗；移栽完成后，第25d对烟苗进行菌剂溶液的灌根，在烟苗根部周围半径5cm范围内均匀灌入稀释了1000倍的贝莱斯芽孢杆菌YC2177所制菌剂溶液。所有育苗措施与常规烟苗日常管理一致。试验处理模式如下表1所示：

[0100] 表1

[0101]

[0102] 1.4整地播种及田间管理措施

[0103] 按曲靖市马龙县优质烟生产技术进行管理。

[0104] 1.5调查项目及方法

[0105] 1.5.1主要生育期记载

[0106] 记录各处理的移栽期、团棵期、旺长期、现蕾期、封顶期、脚叶成熟期、顶叶成熟期以及全生育期的时间。

[0107] 1.5.2农艺性状调查

[0108] 分别在旺长期和封顶后，每个小区随机选25株有代表性的烟株，观察测定株高、茎围、叶片数、节距以及各部位烟叶的叶长和叶宽。

[0109] 1.5.3真菌类病害抑制效果调查

[0110] 按照GB/T 23222‑2008烟草病虫害分级及调查方法，进行常见病害系统调查。

[0111] 1.6数据整理与分析

[0112] 采用Microsoft Excel 2003软件和SPSS22.0软件进行数据整理和统计分析；

[0113] 2结果与分析

[0114] 2.1不同处理对烤烟生育期影响

[0115] 经调查，由烤烟生育期进展记载表可知，3个处理的生育期调查状况基本一致，说明各处理模式对烤烟生育期影响不大。不同处理烤烟生育期进展记载表如表2所示：

[0116] 表2

[0117]

[0118] 2.2不同处理对烤烟农艺性状影响

[0119] 不同处理田间农艺性状对比分析表如表3所示：

[0120] 表3

[0121]

[0122] 由表3可知，处理B、C在株高、茎围、有效叶片数、最大叶长和最大叶宽上均优于处理A，其中，处理C>处理B>处理A；且处理C在株高、茎围、最大叶长上均显著优于处理A；在节距上，处理B>A>C，而三者间的差异性不显著；综上所述的，处理C在烤烟农艺性状上表现最佳，处理B次之。

[0123] 2.3不同处理对烤烟主要病原菌抑制效果的影响

[0124] 主要病原菌发病率调查结果如表4所示：

[0125] 表4

[0126]

[0127] 由表4可知，处理B、C对烟草主要病原菌发病率的抑制效果均优于未进行病害防治处理的对照组A，其中，处理B对蛙眼病的抑制效果最好，即处理B>处理C>处理A，但其防治对象单一，对其它病害抑制效果远低于处理C；而经过YC2177蘸根和灌根的处理C对多种烟草主要病原菌均有抑制效果，除了蛙眼病抑制效果略低于处理B外，对其余多种病害均处于最佳抑制水平。综上所述的，处理C可以兼防多种烟草真菌病害，促进烟叶健康生长，提高烟叶品质。

[0128] 3讨论与结论

[0129] 试验结果表明，在生育期方面，各处理模式对烤烟生育期影响不大。在农艺性状方面，处理C总体表现最佳，可以达到促进烟株生长，提升烟叶质量的效果，处理B次之。在病害防控方面，整体来看，处理C(常规施肥+YC2177所制菌剂1kg/亩，兑水稀释1000倍，用于蘸根、灌根)对烟草主要病原菌的抑制效果最佳；多数病原菌在烟草育苗期就对其产生寄生并侵染，而使用苗期蘸根，移栽后灌根的方式可以对病原菌进行全程防控，达到兼防多种烟草真菌病害，减少发病率的效果。

[0130] 试验例2

[0131] 采用本试验例产品进行叶面喷施对效果进行验证

[0132] 1 试验材料及方法

[0133] 1.1 试验时间及地点

[0134] 试验于2021年2月至10月在云南省昆明市石林县大可乡中龙潭村进行。前茬作物为大蒜。土壤类型为红壤，pH值6.71，有机质含量25.6g/kg，碱解氮122mg/kg，有效磷(P)51.7mg/kg，速效钾(K)152mg/kg。

[0135] 1.2试验材料

[0136] 供试烤烟品种:红花大金元。供试肥料:烟草专用复合肥(N‑P2O5‑K2O＝12‑10‑24)，硝酸钾(N‑P2O5‑K2O＝13.5‑0‑44.5)，农家肥(N‑P2O5‑K2O＝2.56‑0.44‑1.72)。微生物菌剂:11
贝莱斯芽孢杆菌YC2177(下文简称YC2177)，有效活菌数1×10 cfu/g。

[0137] 1.3试验设计

[0138] 采用小区试验的模式进行研究，试验设3个处理，每个处理3次重复，小区采用随机区组排列，每个小区烟株的行株距为120cm×50cm，小区面积为144m2。试验地周围设2行保护行，田间管理按当地优质烤烟生产方式进行。即：处理A：常规施肥(烟草专用复合肥600kg/hm2+硝酸钾150kg hm2+农家肥1500kg/hm2)，不喷任何农药，只喷清水；处理B：常规施肥+叶面喷施市售杀菌剂；处理C：常规施肥+叶面喷施YC2177菌剂(施用量4.5kg/hm2，兑水稀释1500倍后进行地上部分整株喷施。)

[0139] 1.4调查项目及方法

[0140] 1.4.1病害发生情况调查

[0141] 按照GB/T 23222‑2008烟草病虫害分级及调查方法，进行常见病害系统调查。

[0142] 1.4.2经济性状统计调查

[0143] 试验各处理以小区为单位单采、单收挂牌烘烤，对产量、产值、上等烟、中上等烟比例等经济性状进行统计。

[0144] 1.5数据整理与分析

[0145] 采用Microsoft Excel 2003软件和SPSS22.0软件进行数据整理和统计分析；

[0146] 2结果与分析

[0147] 2.1不同处理对烤烟主要病原菌抑制效果的影响

[0148] 随机选取处理A、处理B、处理C单位面积内烟株统计其旺长期和封顶期的病害发生情况；如表1、表2所示：在烤烟旺长期和封顶期，该烟区常见病害：灰霉病、赤星病、根腐病的发病率处理C均低于处理B和处理A，即不同处理对烤烟主要病原菌抑制效果为：处理C>处理B>处理A；未喷施任何农药或菌剂的处理A发病率最高，而喷施了市售杀菌剂的处理B其灰霉病的发病率较低，到封顶期则发病率为0，说明该处理对灰霉病具有一定抑制效果，但对病害的防治功效相对单一，对赤星病和根腐病的抑制效果较差，而处理C的赤星病、灰霉病和根腐病的发病率均处于最低水平，表明叶面喷施了贝莱斯芽孢杆菌YC2177能够兼防多种烟草真菌病害，减少病害的发病率，利于植株的健康生长。旺长期各处理烤烟主要病原菌发病率调查如表5所示，封顶期各处理烤烟主要病原菌发病率调查如表6所示：

[0149] 表5

[0150]

[0151] 表6

[0152]

[0153] 2.2不同处理对烤烟经济性状的影响

[0154] 烟叶的亩产值、亩产量、均价和上等烟比例等通过影响烟草的经济性状直接决定了烟农的经济收入；而烟草病害的发生率也从一定程度上决定了烤烟经济性状的好坏；从表3中可以看出，每亩产量按从高到低的顺序依次排序为C＞B＞A，每亩产值、均价和中上等烟和上等烟的比例从高到低的顺序依次为C＞B＞A；整体来看，经济性状以处理C的最好，处理B次之、处理A的最差。各处理亩产量和亩产值统计表如表6所示：

[0155] 表6

[0156]

[0157] 2.3结论与讨论

[0158] 小区试验的结果表明，不同处理对烤烟主要病原菌抑制效果不同，无论是在烤烟生长的旺长期还是封顶期，叶面喷施了贝莱斯芽孢杆菌YC2177的处理C对多种烟草真菌病害的防治效果均最优，能够兼防多种烟草真菌病害；而喷施了市售杀菌剂的处理B对病害的防治功效相对单一，仅对灰霉病具有明显抑制效果，而未喷施农药或菌剂的处理A则对该烟区主要真菌病害的抑制效果较差，不利于烟株健康生长。

[0159] 不同处理对烟株主要真菌病害的抑制效果也一定程度上决定了烤烟经济性状的好坏，通过分析可知，叶面喷施了YC2177的能够兼防多种烟草真菌病害的处理C其亩产值、亩产量、均价和上等烟比例为代表的经济性状也处于最高水平，其次是处理B，处理A最差。

[0160] 试验例3

[0161] 采用本试验例产品制成功能育苗基质对效果进行验证

[0162] 1 试验材料及方法

[0163] 1.1 试验时间及地点

[0164] 试验时间为2021年2月19日，安排在云南省昭通市昭阳区布嘎乡有代表性的烟区进行。

[0165] 1.2试验材料

[0166] 供试品种：当地主栽品种云烟87，种子由云南省烟草公司昭通市公司提供。

[0167] 供试基质：沼渣肥：蚯蚓粪：椰糠：珍珠岩：蛭石＝4：2：2：1：1混合配比得到。

[0168] 供试菌液：枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌YC2177

[0169] 1.3试验设计

[0170] 本试验以菌剂与育苗基质混合的方式，在32孔(4×8孔)塑料穴盘进行育苗，试验设置3个不同配方处理A、B、C，每个处理重复三次。肥料配制于2月18日下午进行并使其发酵24h，19日则通过添加不同菌剂混合后于2021年2月19日，安排在云南省昭通市昭阳区布嘎乡有代表性的烟区进行育苗。其中，处理A：沼渣肥+蚯蚓粪+椰糠+珍珠岩+蛭石＝4:2:2:1:
1；处理B：沼渣肥+蚯蚓粪+椰糠+珍珠岩+蛭石+枯草芽孢杆菌；处理C：沼渣肥+蚯蚓粪+椰糠+珍珠岩+蛭石+贝莱斯芽孢杆菌YC2177；且育苗基质与两种菌剂的混合比例均为1000:1；各处理模式如表7所示：

[0171] 表7

[0172]

[0173] 1.4调查项目及方法

[0174] 1.4.1农艺性状调查

[0175] 分别在团棵期、旺长期和封顶期对烟草农艺性状进行调查，每个小区随机选取25株有代表性的烟株，观察测定株高、茎围、叶片数、节距以及各部位烟叶的叶长和叶宽。

[0176] 1.4.2真菌类病害抑制效果调查

[0177] 按照GB/T 23222‑2008烟草病虫害分级及调查方法，进行常见病害系统调查。

[0178] 1.4.3数据整理与分析

[0179] 采用Microsoft Excel 2003软件和SPSS22.0软件进行数据整理和统计分析；

[0180] 2结果与分析

[0181] 2.1烤烟农艺性状调查

[0182] 表8烤烟农艺性状调查记录表

[0183]

[0184] 随机选取处理A、B、C的烟株各25株烟在不同时期测定其农艺性状，结果表明：在烟草生长的各个时期，不论是在团棵期还是旺长期还是封顶期，在茎围和节距上，处理B的农艺性状表现优于处理处理C和处理A，而在株高、有效叶片数、最大叶长和最大叶宽上处理C表现最佳，其次是处理B，处理A最差；即C＞B＞A；总体来看，处理C的表现更好。

[0185] 2.2烤烟主要真菌类病害抑制效果调查

[0186] 各处理对烤烟主要真菌类病害抑制效果如表9所示：

[0187] 表9

[0188]

[0189] 由表9可知，各处理对烤烟主要真菌类病害的抑制效果不同，添加了枯草芽孢杆菌的处理B对立枯病的抑制效果最好，高达88.88％，处理C略低为73.47％；但处理A对其他真菌类病害的抑制效果不明显。而添加了贝莱斯芽孢杆菌YC2177的处理C则对茎点霉、棒孢霉以及炭疽病的抑制效果均处于最优水平，说明该处理可以兼防烟草多种真菌病害。

[0190] 2.3讨论与结论

[0191] 通过基质拌菌剂的方式，探究不同微生物菌剂早期根际定殖对烟草真菌类病害的防控效果及对烟株农艺性状的影响；结果表明：在育苗基质中加入微生物菌剂可以优化烟草团棵期、旺长期、封顶期的农艺性状，提高烟草对真菌类病害的抗病性，其中以育苗基质中加入贝莱斯芽孢杆菌YC2177的处理C(有效活菌数为1×1011cfu/g)效果最好，处理B次之；在病害抑制效果方面，施加了枯草芽孢杆菌的处理B对立枯病的抑制效果最好，但对其余病害的抑制效果远低于处理C，说明贝莱斯芽孢杆菌可以兼防烟草多种真菌病害，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，生长快，稳定性较好，很适合作为生防菌大量生产和应用。

[0192] 试验例4

[0193] 采用本试验例产品制成生物有机肥进行验证

[0194] 1 试验材料及方法

[0195] 1.1 试验时间及地点

[0196] 试验时间为2021年3月10日，地点安排在昭通市鲁甸县龙树镇新乐村，海拔2149.8m，N27.3626450，E103.439865。

[0197] 1.2试验材料

[0198] 供试品种：云烟99

[0199] 供试肥料：烟草专用复合肥(N‑P20‑K20＝11‑15‑22)、硫酸钾(K20≥50％)由当地烟草公司提供，生物有机肥(含溶磷、解钾、促生长和抗病害功能微生物，通过贝莱斯芽孢杆菌YC2177和有机肥料发酵后混合所制)，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司负责提供。

[0200] 1.3试验设计

[0201] 采用小区试验的模式进行研究，试验设两个处理，每个处理三次重复，且采用随机区组排列；处理A为对照组，进行当地烟草常规施肥：烟草专用复合肥(N‑P20‑K20＝11‑15‑22)、硫酸钾(K20≥50％)；处理B为示范组：烟草专用复合肥(N‑P20‑K20＝11‑15‑22)、硫酸钾(K20≥50％)、含贝莱斯芽孢杆菌YC2177的生物有机肥。所述的生物有机肥施用量为
50kg/亩，并采用穴施、撒施的方法作为底肥、定根肥、追肥进行施用。

[0202] 试验除肥料施用不同外，其他生产管理措施等都按照当地优质烟叶生产标准执行。具体试验处理各处理肥料用量表如下表10：

[0203] 表10

[0204]

[0205] 1.4调查项目及方法

[0206] 1.4.1农艺性状调查

[0207] 分别在团棵期、旺长期和封顶期对烟草农艺性状进行调查，每个小区随机选取30株有代表性的烟株，观察测定株高、茎围、叶片数、节距以及各部位烟叶的叶长和叶宽。

[0208] 1.4.2经济性状调查

[0209] 调查统计各处理产量、产值、均价、上等烟比例、中上等烟比例等经济性状。

[0210] 1.4.3真菌类病害抑制效果调查

[0211] 按照GB/T 23222‑2008烟草病虫害分级及调查方法，进行常见病害系统调查。

[0212] 1.4.4烟叶化学成分调查

[0213] 各处理选取有代表性的烟株定位挂牌标记留取中部叶和上部叶，采烤后收集整理，按照部位各留5kg的烟叶，进行烟叶常规化学成分分析。

[0214] 1.4.5数据整理与分析

[0215] 采用Microsoft Excel 2003软件和SPSS22.0软件进行数据整理和统计分析；

[0216] 2 结果与分析

[0217] 2.1 烤烟农艺性状调查

[0218] 随机选取处理A和处理B各30株，进行农艺性状测定，结果表明：处理B的烟株整体农艺性状指标在烟草生长的团棵期、旺长期和封顶后均优于常规处理A。烤烟农艺性状调查记录表如表11所示：

[0219] 表11

[0220]

[0221] 2.2经济性状调查

[0222] 烟叶的亩产值、亩产量、均价和上等烟比例等，一方面，受烟株健康状况的影响，另一方面，通过影响烟草的经济性状直接决定了烟农的经济收入；由表3可知：施加了生物有机肥(含贝莱斯芽孢杆菌YC2177)的处理B烟株亩产量高达256.6kg，较未施加生物有机肥的常规处理A高出55.8kg/亩，亩产值达8262.52元；上等烟比例和中上等烟比例较对照组A分别高出28.9％和16.7％。烤烟产值产量统计表如表12所示：

[0223] 表12

[0224]

[0225] 2.3烤烟病害抑制效果调查

[0226] 病害的发生会严重影响烟草的生长，导致烟草产量、质量降低，减少烟草的经济价值；试验地主要病害发生情况如表13所示。从表中可以看出，试验地发生的主要病害有立枯病、根腐病、赤星病、黑胫病、炭疽病和蛙眼病，其中立枯病、根腐病和蛙眼病发病情况较为严重。整体来看，各处理病害的发生情况以处理B的最轻，处理A的发病率较高，说明在常规施肥的基础上增施生物有机肥(含贝莱斯芽孢杆菌YC2177)能提高烟株的抗病性，对病害防控具有一定意义。主要病害发病率调查结果如表13所示：

[0227] 表13

[0228]

[0229] 2.4烟叶化学成分分析

[0230] 总糖、总氮、烟碱和还原糖是决定烟叶品质的主要成分；云南烟叶属于清香型，总糖和还原糖含量较高，而烟碱、总氮含量与之呈负相关，故烟碱、总氮含量相对较低。由表14可以看出，各处理中部叶和上部叶的总氮和烟碱含量偏低，化学成分协调性均较差，整体来看，处理B的总糖、总氮、烟碱含量较高，化学成分协调性略好于处理A。化学成分分析如表14所示：

[0231] 表14

[0232]

[0233] 3结论与讨论

[0234] 2021年安排在昭通市新乐村的小区试验结果表明：在农艺性状方面，施用了生物有机肥(含贝莱斯芽孢杆菌YC2177)的处理B的整体表现优于了未施加生物有机肥的处理A，说明生物有机肥的施加能够提高烟株对养分的吸收，从而促进烟株生长，改善烤烟农艺性状。

[0235] 在经济状况方面，添加了生物有机肥的处理B能够提高烤烟的亩产量、亩产值、均价和中上等烟比例，改善烤烟的经济性状，从而决定烟农的经济收入，实现烟农的增产、增收致富。

[0236] 在烤烟病害抑制效果方面，添加了生物有机肥的处理B能够提高烟株的抗病性，减少病害的发生，且对比未添加生物有机肥的处理A来看，该处理对试验地多种主要真菌类病害均具有明显抑制效果，可以兼防多种病害；而处理B烟株的发病率都处于较高水平，不具备兼防烟草多种真菌类病害的特殊效果。

[0237] 在烟叶化学成分分析方面，各处理中、上部烟叶化学成分的协调性距离优质烟叶均有一定的差距，但施用了生物有机肥的处理B能够提高中部烟叶的总氮和烟碱含量、提高上部烟叶还原糖的含量，在一定程度上能够改善烟叶化学成分的协调性，使植株生长良好，有利于品质的提高。

[0238] 本试验例中的生物有机肥主要由微生物菌剂：贝莱斯芽孢杆菌YC2177所构成，从一定程度上说明该菌剂能够促进烟叶生长，提高烟叶品质，且兼防多种烟草真菌病害，实现烟叶的高产、优质、集约化生产。

[0239] 本发明所涉及的四个试验例都是对贝莱斯芽孢杆菌YC2177的效果验证，从而得到一种具有兼防多种烟草真菌病害的贝莱斯芽孢杆菌菌剂及其制备和应用；通过对烤烟农艺性状、经济性状、病害发生状况以及烟叶化学成分分析，可得知该微生物菌剂的施用可以明显改善烟草的农艺性状、经济性状，提高烟叶品质，而上述性状和烟叶品质又受烟株健康状况影响，与烟株的病害防治效果呈正相关性，因此，对烟叶病害的防治，促进植株健康生长，研制一种具有兼防多种烟草真菌病害的功能微生物菌剂至关重要。

[0240] 本发明所研究的贝莱斯芽孢杆菌YC2177对各试验例所涉及的多种烟草的主要病原菌：立枯、灰霉、蛙眼、茎点病、根腐病、黑胫、炭疽、赤星、棒孢霉等均具有较好的抑制效果，与市售各类型菌剂最区别特征在于：该菌剂可抑制烟草多种真菌、细菌类病害，其抗菌谱广，能够达到兼防多种烟草真菌类病害的效果，可作为生防菌进行集约化生产并应用于烟草病害的防治。

[0241] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述试验例的限制，上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。