技术领域
[0001] 本发明属于分析化学检测领域，尤其涉及石斛中甘露糖含量的检测方法。
相关背景技术
[0002] 石斛作为兰科植物的一大属，随着近年来各种研究的开展，表现出不俗的养生保健及药用价值。石斛多糖作为其重要的生物活性物质，主要由甘露糖及葡萄糖通过糖苷键结合形成。甘露糖是石斛多糖的重要组成成分及质量评价指标，具有调解免疫系统，抑制肿瘤生长及转移等生理效应。因此，通过测定石斛中甘露糖含量可以进一步提升对石斛价值的开发。
[0003] 由于石斛中的甘露糖通常以葡甘露聚糖的形式存在于样品中，因此要将样品中的葡甘露聚糖先提取纯化后，再将葡甘露聚糖中的甘露糖解离为游离态后再进行测定。目前，石斛中多糖的提取方法有水提取醇沉淀法，此外还有超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法等。多糖水解方法有盐酸水解、三氟乙酸水解、硫酸水解，水解后生成的单糖经PMP(1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮)衍生试剂衍生后，注入配备了紫外检测器的高效液相色谱仪测定，内标法定量。
[0004] 目前测定石斛中甘露糖最广泛的方法多是参考《中国药典(2020版)》，采用水提醇沉提取，盐酸水解多糖，柱前衍生化高效液相色谱法测定。虽然这种方法能够检测石斛中甘露糖的含量，但是这种方法在实际测定过程中，操作繁琐、耗时较长、时效性不强，需投入较大的人工及时间成本，且衍生试剂PMP(1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮)及三氯甲烷萃取试剂的使用增加了对人体健康的负担以及对周围环境的压力。另外，内标试剂的使用，进一步增大了检测过程中的经济成本。因此，寻求一种快速、准确、经济、环保的石斛中甘露糖检测方法是石斛行业亟待解决的问题。
[0005] 申请人通过大量创造性的劳动，发现利用蒸发光散射高效液相色谱(HPLC‑ELSD)技术，经过设置合适的分离和测量条件，可以有效解决甘露糖在测定过程中无紫外吸收及杂质干扰的问题，省去了测定过程中PMP(1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮)衍生试剂衍生的步骤，极大地提高了实验的检测效率。另外，通过对石斛中多糖提取纯化以及多糖水解过程的探究优化，建立一种基于蒸发光高效液相色谱(HPLC‑ELSD)技术，非衍生化、直接、高效测定石斛中甘露糖含量的方法。
具体实施方式
[0038] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
[0039] 实施例
[0040] 本实施例采用的实验条件如下：
[0041] 检测仪器：高效液相色谱仪(日本岛津公司LC‑20AD)，蒸发光散射检测器(美国奥泰公司3300ELSD)。
[0042] 甘露糖标准品(CAS:3458‑28‑4)由坛墨质检科技股份有限公司生产。
[0043] 色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱(250mm×4.6mm，3.5μm)；
[0044] 柱温：35℃；
[0045] 进样量：20μL；
[0046] 流速：1.0mL/min；
[0047] 流动相A：0.1％体积分数的氨水‑乙腈溶液；
[0048] 流动相B：0.1％体积分数的氨水‑水溶液；
[0049] 流动相A与流动相B等度洗脱，体积比例为80：20。
[0050] 蒸发光散射检测器条件：漂移管温度为50℃；氮气流速为1.5L/min；增益为2。
[0051] 本实施例采用的检测方法具体如下：
[0052] 步骤1)标准曲线的绘制：
[0053] 称量0.1000g甘露糖，用水定容至10mL，得到甘露糖标准储备液，于2～8℃保存。准确移取一定量甘露糖标准储备液，用水稀释定容，配制成20.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L、500.0mg/L、1000.0mg/L标准系列溶液。
[0054] 将标准系列溶液中不同浓度的子溶液分别注入液相色谱仪中，进样量为20μL，蒸发光散射检测器测定相应的峰面积；随后以标准系列溶液的质量浓度的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示；标准溶液的色谱图如图2所示。从图中可以看出，标准溶液线性关系较好，色谱峰形较对称，无前延后拖现象。
[0055] 步骤2)石斛中甘露糖的含量测定：
[0056] 称取粉末试样(过三号筛，即50目筛)约0.2g，于50mL离心管中，加入25mL体积浓度为80％的乙醇水溶液，涡旋混匀，超声15min，‑18℃冰箱放置20min，取出，6000r/min离心5min，弃去上清液，重复操作1次，残渣于110℃烘箱中烘干。
[0057] 于上述烘干的沉淀物中精密加入20mL水，涡旋混匀，在100℃水浴中提取2h，放冷，6000r/min离心5min。准确取10mL上清液于25mL比色管中，加入3mL 3mol/L盐酸溶液，盖塞，涡旋混匀，于100℃水浴中水解60min，放冷，用5mol/L氢氧化钠调节pH至7，用水定容至
25mL，混匀，过0.22μm滤膜，待HPLC‑ELSD检测。
[0058] 取20μL试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，如图3所示。根据标准曲线方程计算得到待测液中甘露糖的质量浓度，通过以下公式计算得到样品中甘露糖含量：
[0059]
[0060] 式中：
[0061] X—试样中待测组分含量，单位为克每100克(g/100g)。
[0062] A—由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L)。
[0063] V—样品提取液定容体积，单位为毫升(mL)。
[0064] m—试样质量，单位为克(g)。
[0065] 待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当稀释后，重新测定。测得结果如表1和图3所示。
[0066] 结果表明，通过本发明方法对石斛样品中甘露糖的含量测定具有较好的可行性。
[0067] 表1石斛样品中甘露糖的含量
[0068]
[0069] 本发明的检测方法利用高浓度乙醇溶液冷冻沉降进行除杂，用水提取多糖，经盐酸水解为甘露糖后，进高效液相色谱蒸发光检测器进行含量测定，与传统方法相比，无需回流装置，无需衍生及萃取步骤，试剂用量少，空气污染小，大大缩短了前处理时间，操作方便，减轻了分析人员的劳动强度，提高了工作效率。简便易行，适用于大批量石斛样品中甘露糖的含量测定。实验结果表明，本方法与传统方法比较，测定结果基本一致，方法精密度小于5％，重现性好。
[0070] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
