技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及病毒的制备方法和应用
相关背景技术
[0002] CAR‑T细胞在复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的早期临床试验中取得了巨大成功，目前全球范围内已有7种CAR‑T疗法得到了商业化应用，靶向CD19阳性白血病和淋巴瘤(Relmacabtagene )或B细胞成熟抗原(BCMA)阳性多发性骨髓瘤 但是，为了避免同种异
体移植物抗宿主病(GvHD)，CAR‑T细胞的制备需要通过患者自体的外周血T细胞体外改造，这导致了非常昂贵且漫长的工艺流程。此外，大量临床试验提示现有的CAR‑T细胞疗法可诱发严重的不良事件，例如危及生命的细因子释放综合征(CRS)或神经毒性。
[0003] 自然杀伤细胞(NK细胞)是先天免疫系统的效应细胞，可以以非抗原特异性的方式识别和裂解靶细胞，从而使它们可以有效地监测以及清除肿瘤细胞。值得注意的是，NK细胞不会引起急性或慢性GvHD。NK细胞的来源较为丰富，包括健康人的外周血、脐带血、CD34+造血前体细胞和诱导性多能干细胞等，并且允许制备成“现货型”的预制产品，可大幅缩减成本和工艺周期。重要的是，使用脐带血来源的靶向CD19的CAR‑NK细胞治疗复发或难治性B细胞肿瘤的I/II期临床试验(注册号NCT03056339)报告了令人鼓舞的结果，11例患者中有7例获得完全缓解，并且没有发生与治疗相关的CRS、神经毒性以及GvHD。因此，使用异体来源的针对特定抗原的CAR‑NK细胞具备较好的安全性和有效性，并且有可能用作“现货型”的产品，有望补充甚至替代现有的CAR‑T疗法。
[0004] 与现有CAR‑T细胞疗法的大量临床研究相比，CAR‑NK细胞疗法的发展明显滞后。其中的一个重要原因是针对原代NK细胞缺乏简单有效的基因递送方法。利用电转染或脂质转染等转染方法可将外源基因递送至NK细胞，然而在这些情况下外源DNA通常不整合到NK细胞的基因组中，因此转基因的表达是瞬时的，转染后约3‑5天会大幅下降。基于PiggyBac转座子系统可以将外源DNA整合至细胞基因组，但是近期有两个独立的临床试验均报道使用该技术制备的CAR‑T细胞有转化成T细胞肿瘤的安全性风险(Bishop DC,et al.Blood 2021,138(16):1504‑1509、Micklethwaite KP,et al.Blood 2021,138(16):1391‑1405)。
相对而言，慢病毒载体具有较低的遗传毒性和插入突变，是更为安全的基因转导方法。但是，常规的慢病毒技术将CAR基因转导至原代人NK细胞遇到了技术瓶颈，即：CAR‑T细胞的CAR基因主要递送工具为使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV‑G)为包膜糖蛋白的假型化慢病毒载体，其可以高效得转导人T细胞，但是应用于NK细胞却几乎没有效果。
[0005] 现有慢病毒生产方法获得的病毒颗粒的感染效率和滴度均较低，严重限制了慢病毒技术在转染免疫细胞中的应用。
具体实施方式
[0082] 除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；PCR：The
Polymerase Chain Reaction(Mullis等编辑，1994)；A Practical Guide to Molecular Cloning(Perbal Bernard V.，1988)；Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas等，
2001)。
[0083] BaEV或RD114包膜蛋白假型化的慢病毒载体颗粒在制备过程中，包装细胞HEK‑293细胞会形成巨大的合胞体(相邻的293细胞发生细胞融合，形成的一个大型细胞并具有多个细胞核)，以BaEV‑RLess最为明显。这样导致HEK‑293细胞的大量死亡，严重影响了慢病毒载体颗粒的生产效能。此外，细胞死亡形成的碎片也进一步加大了后续慢病毒载体颗粒的纯化难度。这个特性严重限制了该假型化慢病毒载体的使用潜力，尤其不适用于GMP级别的规模化慢病毒产品的工艺开发，无法满足目前CAR‑NK细胞疗法研发的迫切需求。
[0084] 发明人发现，使用ASCT2表达或活性下调的细胞制备的慢病毒感染效率和活性滴度显著高于使用野生型细胞制备的慢病毒。因此，本发明提供ASCT2的表达或活性受到抑制的细胞、其制备方法、制备病毒以及由此制备免疫效应细胞的方法。
[0085] 术语“包膜蛋白”或“包膜糖蛋白”是自然界中一些病毒含有的一层包膜，其包裹在蛋白质衣壳外，往往来自于宿主细胞膜，上面含有病毒自身特有的糖蛋白。这些糖蛋白用于识别并结合宿主细胞的表面受体，接着病毒包膜与宿主细胞膜结合，最后病毒衣壳和基因组进入宿主，完成感染过程。
[0086] 细胞
[0087] 本发明首先提供一种ASCT2的表达或活性受到抑制的细胞及其制备方法。任何能用于生产病毒或被病毒转染的宿主细胞均可用于本发明。宿主细胞可以是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。可用作病毒生产的宿主哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、HEK293细胞等。细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞。其中，HEK293细胞包括贴壁HEK293细胞或其经过悬浮驯化后的细胞株，例如HEK293T、HEK293H、HEK293F、HEK293S、HEK293T/17、HEK293T/17SF、HEK293FT、HEK293SG、HEK293E、HEK293‑6E、HEK293FTM、HEK293SGGD细胞。
[0088] 本文中，病毒包括天然病毒或假型病毒。在示例性实施方案中，病毒是逆转录病毒或其假型病毒，例如慢病毒或其假型病毒。术语“假型病毒”、“假病毒”或“假型化病毒”指在一种重组病毒上整合另一种病毒的包膜糖蛋白所形成的病毒。相对于野生型病毒，假型病毒的表型相近但具有另一种病毒的细胞嗜性，易于生产且更加安全。以慢病毒为例，慢病毒载体衍生开发自HIV‑1病毒。假型化慢病毒包膜蛋白可以来源于多种异源病毒的糖蛋白，从而扩大靶细胞嗜性。例如，将狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与双嗜性鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域进行融合表达(BaEV‑TR)，或者BaEV包膜糖蛋白去除融合抑制性R肽(BaEV‑RLess)。基于BaEV‑TR或者BaEV‑RLess的假型化慢病毒载体可以将基因高效得递送至造血细胞干细胞以及静息T细胞和B细胞。此外，猫白血病病毒(RD114)的包膜糖蛋白胞外和跨膜结构域与双嗜性鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域进行融合表达(RD114‑TR)也是一种替代性包膜。假型化的慢病毒载体也可用于转导NK细胞。此外，源自水疱性口炎病毒的VSV‑G也是常用的包膜蛋白。
[0089] 本文中，“抑制”、“降低”或“下调”包括低至0。
[0090] 可以使用本领域已知的技术降低细胞的ASCT2的表达或活性，从而制备该细胞。这些技术包括但不限于基因编辑技术、RNA抑制技术、同源重组技术、或免疫学技术。
[0091] 在一些实施方案中，使细胞的ASCT2蛋白的编码基因SLC1A5基因具有突变，只要该突变能降低ASCT2的表达或活性即可。所述突变可位于ASCT2蛋白编码序列或非编码序列。示例性地，所述突变位于SLC1A5基因的第630至第1195位残基或其片段。所述突变包括插入、缺失或替换突变。
[0092] 本文中，基因编辑技术包括：通过基因编辑载体在细胞基因组的ASCT2的编码基因中引入导致所表达的ASCT2的表达水平降低或活性降低的突变。示例性地，基因编辑技术包括基于CRISPR、锌指蛋白、TALEN的基因编辑技术。因此，在一些实施方案中，细胞中转入有sgRNA。所述sgRNA如SEQ ID NO:4和/或5所示。所述细胞中还可转入有Cas蛋白或CRISPR/Cas复合物。
[0093] 本文中，RNA抑制技术包括：通过靶向ASCT2的编码基因或转录本的siRNA、反义RNA和/或核酶导致所表达的ASCT2的表达水平降低或活性降低。因此，在一些实施方案中，所述细胞的ASCT2蛋白的转录本的活性受抑制。
[0094] 本文中，同源重组技术包括：通过同源重组载体敲除基因组中的ASCT2的编码基因，或将编码无活性或活性降低的ASCT2变体的核酸序列同源重组到基因组中以替换野生型ASCT2编码序列。
[0095] 本文中，免疫学技术包括：通过使细胞表达、分泌或接触ASCT2的抗体或其抗原结合片段以降低ASCT2的活性。因此，在一些实施方案中，所述细胞包含ASCT2蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体抑制ASCT2蛋白的活性。
[0096] 在上述技术中，细胞包含、表达、分泌或接触下调ASCT2表达水平或活性的试剂，例如抗体、核酸或小分子。下调ASCT2活性的试剂可以为ASCT2活性的拮抗剂。下调ASCT2表达水平的试剂可以选自：(a)靶向所述ASCT2的siRNA、反义RNA和/或核酶；(b)基因编辑载体，所述基因编辑载体在对象细胞基因组的ASCT2的编码基因中引入导致所表达的ASCT2活性丧失或减弱的突变；和(c)同源重组载体，所述同源重组载体用于敲除基因组中的所述RNA的基因，或将编码无活性或活性降低的ASCT2突变体的核酸序列同源重组到基因组中以替换野生型ASCT2编码序列。
[0097] 制备病毒的方法
[0098] 基于上述细胞，本发明提供一种制备病毒的方法，包括使用ASCT2的表达或活性受到抑制的细胞生产病毒的步骤。本发明还提供一种提高病毒感染效率和/或滴度的方法。
[0099] 在一个或多个实施方案中，所述方法包括步骤：(1)使用病毒载体或病毒转染所述细胞，和(2)由所述细胞产生的病毒。由细胞生产的病毒可位于细胞培养上清中或位于细胞中。本发明还包括由所述方法获得的病毒。
[0100] 在示例性实施方案中，所述病毒载体包含本文所述的包膜蛋白或其变体的编码序列，所述病毒包含本文所述的包膜蛋白或其变体，例如VSV‑G、BaEV、RD114、RD114‑TR、BaEV‑TR、BaEV‑LV或者BaEV‑RLess包膜蛋白。
[0101] 当生产慢病毒或其假性病毒时，所述病毒载体是慢病毒包装质粒，例如三质粒系统或四质粒系统慢病毒包装质粒。示例性的四质粒细胞包含pLP1、pLP2、pENV和plenti。pLP1质粒含有制备慢病毒载体颗粒所必需的gag基因和pol基因，而pLP2质粒用以表达的Rev蛋白能与pLP1上的反应元件共同作用诱导gag和pol表达，并指导病毒RNA的核运输。
pENV包含所述包膜蛋白的编码序列。pLenti是慢病毒表达质粒，其中可以插入代表达的感兴趣的核苷酸序列或标记基因序列。在用生产的慢病毒转染免疫效应细胞后，可以通过流式细胞术等本领域常规技术检测标记基因的表达产物。
[0102] 表达质粒上可含有表达框，表达框通常含有用于克隆或表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。参见例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193。
[0103] 合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子‑1α(EF‑1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0104] 表达质粒还可以是整合表达质粒，例如转座载体或基于基因编辑技术的重组载体，其上包含由整合元件(例如转座酶或CRISPR相关转座酶)识别并介导整合的序列(例如转座子5’和3’反向末端重复序列、供体DNA)。
[0105] 构建含有感兴趣核酸序列的质粒的方法本领域周知。通常，感兴趣核酸序列的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。用于生产核酸或蛋白的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
[0106] 在示例性实施方案中，感兴趣的核酸序列编码嵌合抗原受体和/或细胞因子。术语“嵌合抗原受体(CAR)”是一种人工设计的蛋白片段，包括胞外片段、跨膜区和胞内片段三部分组成。胞外片段可以对肿瘤细胞特定的膜蛋白进行识别，胞内段可以提供共刺激和活化信号，增强细胞的杀伤能力。具体地，CAR含有任选的信号肽序列、胞外靶标识别区(抗原结合域)、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。所述胞外识别区包含靶向抗原(例如肿瘤抗原)的抗体，例如全长抗体、抗原结合片段、单域抗体(纳米抗体)、单链可变片段(scFv)。
[0107] 所述嵌合抗原受体的靶向抗原没有限制，包括但不限于：CD19，CD5、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138、CD319、GPC3、CD32b、CD171、CS‑1、CLL‑1、BCMA、GD2、GD3、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、IL‑13Ra2、Mesothelin、Her2、MUC1、EGFR、CLDN6、CLDN18.2、DLL3、NY‑ESO‑1、WT1、Nectin‑4、GPC3、PDL1、NKG2DL以及以上抗原的任意组合。
[0108] CD19单链抗体可变区(FMC63，Genebank：HM852952.1)，CD8膜外(铰链区)、跨膜段，4‑1BB胞内段和CD3zeta胞内段，再通过T2A多肽结构串联表达人IL‑15
[0109] CAR上任选的信号肽可以根据需要选择。例如CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽，其序列在本领域技术人员的知识范围内。
[0110] CAR的铰链区可选自CD8铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。在示例性实施方案中，铰链区是CD8铰链区。
[0111] CAR的跨膜区额选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。在示例性实施方案中，跨膜区是CD8跨膜区。
[0112] 可以根据需要选择适合的胞内共刺激域，包括具有共刺激信号分子的胞内结构域，例如CD28、CD134/OX40、CD137/4‑1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域。在示例性实施方案中，胞内共刺激域是4‑1BB共刺激域。
[0113] 类似地，CAR的胞内信号域可以根据需要选择，包括但不限于CD3zeta胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域。在示例性实施方案中，胞内信号域是CD3zeta胞内信号域。
[0114] 形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，接头序列为(GGGGS)n连接，其中n为1～5的整数。
[0115] 应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N‑末端、C‑末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c‑Myc，Poly‑His，Poly‑Arg，Strep‑TagII，AU1，EE，T7，4A6，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
[0116] 本发明也包括任一实施方案所述的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
[0117] 感兴趣的核酸序列可以包含细胞因子的编码序列，所述细胞因子包括介素类因子和趋化因子。所述介素类因子包括IL‑1、IL‑2、IL‑7、IL‑9、IL‑10、IL‑12、IL‑15、IL‑18和IL‑21中的一种或多种。所述趋化因子包括CCL1、CCL2、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL4L1、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1中的一种或多种。
[0118] 嵌合抗原受体和细胞因子的编码序列可以处于同一表达框。此时，嵌合抗原受体的编码序列和细胞因子的编码序列通过源自2A的编码序列(P2A、T2A或F2A)或IRES序列连接。或者，嵌合抗原受体和细胞因子的编码序列处于两表达框中。
[0119] 病毒或病毒载体转染宿主细胞(例如本文所述的宿主细胞)的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。
[0120] 免疫效应细胞
[0121] 本发明还提供制备免疫效应细胞的方法，包括：1)使用本发明所述制备病毒的方法制备病毒，2)使用1)获得的病毒转染免疫效应细胞，和3)收获转染的免疫效应细胞。步骤2)中转染免疫效应细胞的病毒是步骤1)的方法中在ASCT2的表达或活性受到抑制的细胞转染48小时或以上(例如至少72、至少96、至少120小时)后收获的病毒。步骤1)中获得病毒可经稀释以用于步骤2)，例如1:50、1:100、1:200或1:500稀释。
[0122] 本文所述“免疫效应细胞”包括T细胞、肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞、自然杀伤(NK)细胞、或自然杀伤T(NKT)细胞。适用于本发明的NK细胞可以是各种来源的各种类型的NL细胞。例如，NK细胞可来源于人脐带血或外周血。
[0123] 本发明还包括所述制备免疫效应细胞的方法获得的免疫效应细胞。该效应细胞表达本文所述的感兴趣的核酸序列，例如嵌合抗原受体(CAR)的编码序列和/或细胞因子的编码序列。
[0124] 药物组合物
[0125] 本发明还提供药物组合物，包含由本文所述制备免疫效应细胞的方法获得的免疫效应细胞，和药学上可接受的辅料。本发明还提供本文所述的免疫效应细胞或包含其的药物组合物在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。本发明还提供一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本文所述免疫效应细胞或药物组合物。所述疾病是适用于细胞免疫治疗的疾病，例如自身免疫疾病或癌症。本领域技术人员可以根据CAR的胞外区所识别的抗原以及免疫效应细胞的种类确定适合的疾病。
[0126] 本发明的免疫效应细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本文的药物组合物含有本文所述免疫细胞，以及药学上可接受的辅料，包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。这类辅料包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
[0127] 用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗体的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
[0128] 药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式(例如，冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
[0129] 本文中，术语“疾病和/或状况”是指与本文所述疾病和/或状况相关联的受试者的身体状态。术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，可指接受本发明药物组合物以治疗、预防、改善和/或缓解本发明疾病或状况的任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物，例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔、猴子、牛、马、人等。“预防”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到防止或降低疾病或病症的负面影响的效果。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方案可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重及疗法激发受试者的抗癌反应的能力)而变。
[0130] 当指出“治疗有效量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，将部分取决于治疗程度、目标、所递送的分子、适应症、施用途径、患者年龄、体重、体表或器官大小、一般健康状况、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。可通常指出：包括本文描4 9 5 6
述的免疫细胞的药物组合物可以以10至10 个细胞/kg体重的剂量，优选10 至10 个细胞/kg体重的剂量。免疫细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0131] 给药频率将取决于所用配制物中结合分子的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
[0132] 对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物施用途径是已知方法，例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。在一个实施方案中，本发明的免疫细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的免疫细胞组合物优选通过静脉注射施用。免疫细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
[0133] 在本发明的一些实施方案中，本发明的免疫效应细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗间皮素介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
[0134] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
[0135] 实施例
[0136] 实施例1：基于CRISPR/Cas9敲除慢病毒载体颗粒生产细胞HEK‑293中的ASCT2[0137] 一、设计和获取sgRNA
[0138] 通过加州大学圣克鲁斯分校的基因组浏览器查询(https://genome‑asia.ucsc.edu)，人ASCT2由SLC1A5基因编码，定位于第19号染色体q臂13.3区，转录单位全长13712bp，蛋白编码的第1段序列为630..1195(SEQ ID No.1)。
[0139] 设计两条sgRNA向导序列，如下：
[0140] sgRNA1 guide DNA：5’‑CGCGCCTTGGTCCTCGATGG‑3’(SEQ ID No.2)
[0141] sgRNA2 guide DNA：5’‑GCGAGCCCCTTGGAGTCTCG‑3’(SEQ ID NO.3)
[0142] 委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成sgRNA，5'端和3'端各有3个硫代和氧甲基修饰，序列如SEQ ID NO:4(sgRNA1)和SEQ ID NO:5(sgRNA2)所示。
[0143] 二、电转CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(Cas9 RNP)
[0144] 培养HEK‑293细胞(ATCC，货号CRL‑1573)，铺板到DMEM高糖型培养基中(目Thermo Fisher，货号11965118)，该培养基含有10％ FBS，2mM L‑谷氨酰胺，10mM HEPES和1.0mM丙酮酸钠并置于37℃培养箱中。
[0145] 取CRISPR/Cas9蛋白TrueCutTMCas9 Protein v2(Thermo Fisher，货号A36499)60pmol各加入两种sgRNA(150pmol)的PBS溶液中形成Cas9 RNP混合液，共计10uL，混匀后置于室温约10分钟。
[0146] 取106个293细胞，室温下90g离心10分钟后，用100uL SF 4D‑NucleofectorTMX溶液重悬并将上述RNP混合液体加入后。转移至电转杯中，使用Lonza 4D‑Nucleofector电转，程序代码为CM‑130。
[0147] 电转后，将细胞置于37℃培养箱中继续培养
[0148] 三、基因组靶区域序列分析
[0149] 电转后第5天，取293细胞进行ASCT2抗体(Cell Signaling，货号5345)孵育，再用Alexa 647荧光标记的抗兔IgG抗体(Biolegend，货号406414)染色后，使用ACEA NovoCyte流式细胞仪进行流式细胞术分析。如图1，A所示，sgRNA1打靶后的ASCT2阴性细胞占比相对低一些，我们使用有限稀释法获得96孔进行的单克隆细胞培养。
[0150] 继续培养2周后，使用QuickExtract DNA提取试剂盒(Lucigen，货号QE09050)制备各单克隆细胞系的基因组DNA。再使用PrimSTAR GXL DNA聚合酶(Takara，货号R050A)进行靶区域的PCR扩增。
[0151] PCR引物如SEQ ID NO:8(正向)和SEQ ID NO:9(反向)所示。
[0152] PCR方案：步骤1:98℃，10s；步骤2:60℃，15s；步骤3:68℃，20s；步骤4:重复步骤1‑3，共30个循环。
[0153] 将PCR产物在1％琼脂凝胶电泳，从凝胶约400bp大小的位置切下PCR产物的条带，纯化并送Sanger测序(委托北京擎科生物科技有限公司)。
[0154] 测序引物:5’‑ACACTCCAGCTTCCAAGAGC‑3’(SEQ ID NO:6)。
[0155] 序列分析确认了在sgRNA1靶向DNA(字体加粗表示)区域具有多个克隆的插入或缺失突变，碱基替换用“下划线”表示，碱基缺失用“‑”表示，碱基插入用“删除线”表示(图1，B)。
[0156] 四、ASCT2稳定敲除HEK‑293细胞的鉴定
[0157] 进一步在蛋白表达水平对HEK‑293细胞进行ASCT2的表达分析，通过流式细胞术分析确认#30单克隆细胞成功敲除ASCT2(图1，C)。
[0158] 实施例2:ASCT2敲除的HEK‑293细胞适应无血清培养的悬浮驯化
[0159] 将HEK‑293野生型WT和敲除ASCT2的#30先用含25％无血清培养基OPM‑293CD05(品牌：奥浦迈，货号：81075‑001)+75％原培养液培养(DMEM+10％FBS)进行培养，按3M cells/10cm dish传代培养两代。细胞在48～72h内长成致密单层，细胞活率为89％～99％。然后再按此步骤依次将无血清培养基比例增加，原培养基比例减少，最后将HEK‑293完全培养在无
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血清培养基中，按照10x10 cells/20mL(2个125mL摇瓶)放在摇床进行培养(37℃，5％ CO2，
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90rpm)，密度达到2x10cells/ml时进行传代，培养3代至细胞活率≥90％，至此得到悬浮驯化的适应无血清培养的HEK‑293细胞系HEK‑293/SC。
[0160] 为了获得活率和增值速率都较高的驯化细胞，采用有限稀释法挑取单克隆，获得聚团率最低、生长速率最高的单克隆作为驯化的细胞系进行建库保存。
[0161] 实施例3：HEK‑293细胞或HEK‑293/SC细胞中敲除ASCT2对慢病毒滴度和产量的影响
[0162] 一、慢病毒载体的包装系统
[0163] 慢病毒载体颗粒的制备采用第三代慢病毒载体系统，即4个慢病毒包装质粒混合物转染HEK‑293细胞或HEK‑293/SC细胞后，收集分泌的慢病毒载体颗粒，进行后续的纯化和浓缩。4个慢病毒包装质粒具体包括pLP1、pLP2、pENV和plenti。pLP1质粒含有制备慢病毒载体颗粒所必需的gag基因和pol基因，而pLP2质粒用以表达的Rev蛋白能与pLP1上的反应元件共同作用诱导gag和pol表达，并指导病毒RNA的核运输，均购自Thermo fisher(货号K497500)。使用RD114‑TR、BaEV‑TR或者BaEV‑RLess包膜假型化的慢病毒载体颗粒可以转导人NK细胞，构建pENV表达上述包膜糖蛋白的一种(以下实验以BaEV‑RLess为例)。pLenti是慢病毒表达质粒，骨架基于pLenti‑CMV‑V5‑LUC Blast(Addgene，货号21474)，将CMV启动子替换为EF1a，并设计多个酶切克隆位点便于后续的质粒构建(图2，A)。将荧光蛋白BFP的表达基因克隆至pLenti(图2，B)，构建pLenti‑BFP慢病毒载体颗粒转导NK细胞后，可以通过流式细胞术检测BFP。
[0164] 二、慢病毒载体颗粒的包装
[0165] (1)包装细胞的准备
[0166] 比较HEK‑293细胞或HEK‑293/SC细胞野生型WT和ASCT2敲除#30生产慢病毒载体颗6
粒的能力。HEK‑293细胞培养在Nunc的15mm细胞培养皿(Thermo，货号174888)，约5x10 个细胞接种在含10％FBS的DMEM高糖培养基中，并置于37℃的5％ CO2的培养箱中环境下进行培养。接种后，观察细胞汇合度在70％左右，进行质粒转染。
[0167] HEK‑293/SC细胞采用无血清培养基OPM‑293CD05稀释至终密度为1.5x106cells/mL，培养箱(37℃、5％CO2、120rpm)放置过夜生长。
[0168] (2)质粒转染
[0169] 配制磷酸钙转染体系，15mL的离心管中含有900μL的Opti‑MEM培养基(Thermo，货号11058‑021)，先加入慢病毒包装的4个质粒(pLenti:pLP1:pLp2:pENV的质粒摩尔比2:1:1:0.5)，再加入100μL的2.5MCaC12溶液,最后在搅拌振荡器上逐滴加入2mL 2x HBS(Sigma，货号H3375)。转染混合物在室温静置20分钟。HEK‑293细胞更换培养基为20mL含2％FBS的DMEM培养基，并加入氣喹至终浓度为20‑30mmol/L。将转染混合物逐滴加入培养基中，摇晃摇匀后放于培养箱中。12小时后，将细胞培养液替换成20mL含2％FBS的DMEM培养基，并继续培养。HEK‑293/SC细胞的培养基为无血清培养基OPM‑293CD05，其他操作同HEK‑293。
[0170] (3)培养上清液的收集
[0171] 分别在转染48、72、96和120小时后，显微镜下观察并记录培养细胞的镜下形态，之后收集含有慢病毒载体颗粒的细胞培养上清液，之后加入含2％FBS的DMEM培养基。如图3所示，WT的HEK‑293细胞在48小时后大量细胞从培养皿中脱落，一部分细胞呈含有多个细胞核的巨大细胞形态，而#30的HEK‑293细胞在视野内还是贴壁生长，在数量上持续扩增，形态上和转染前没有显著差别。悬浮的HEK‑293/SC细胞，WT型的细胞出现类似的多个细胞核的巨大细胞形态，而#30驯化而来的悬浮细胞透亮有光泽，细胞界限清晰。
[0172] (4)慢病毒载体颗粒的纯化和浓缩:
[0173] 首先将各时间段收集的慢病毒上清液通过孔径为0.45μm的PES滤膜(Jet Biofil，货号FPE404030)，除去细胞和细胞碎片回收的澄清液。因为WT的HEK‑293细胞有大量细胞脱落，严重干扰收集的慢病毒上清的滤膜过滤，而#30的HEK‑293组各个时间点慢病毒上清没有类似的问题。收集HEK‑293/SC细胞的培养基，在300g的转速下离心10分钟，收集上清液。
[0174] 在已预先灭菌的超速离心管(Beckman，货号344058)底部加入4mL 20％蔗糖垫液。将回收的慢病毒澄清液加至离心管中蔗糖垫液上，配平后小心放入吊桶中。使用SW 32Ti转头，放置于Optima XPN‑100超速离心机中，在4℃，125000g的条件下离心90分钟。离心结束后，使用移液器去除上清，加入PBS重悬慢病毒沉淀物并进行分装，‑80℃保存备用。
[0175] 三、慢病毒载体活性滴度的测定与比较
[0176] (1)不同时间点慢病毒载体颗粒转导效率的比较
[0177] 将NK92MI细胞(ATCC，货号CRL‑2408)以每孔0.3x106个细胞的密度接种96孔板中，使用0.2mL含12.5％ FBS的MEMα培养基(Thermo，货号12571063)进行培养。接种24小时后，分别加入不同的慢病毒载体颗粒进行转导。每组加入慢病毒的使用不同的稀释比例，具体为1:50、1:100、1:200或1:500，并设立3个重复。混匀后，置于水平转头离心机种，在32℃和1200g条件下90分钟。结束后，将96孔板置于37℃孵育4小时。之后将细胞吸出，加入PBS离心
1次后再弃去上清，用MEMα培养基重悬，铺入24孔板继续培养。48小时后，通过流式细胞术检测各组NK92MI细胞的BFP表达比例。如图4的A‑H所示，48小时收集的慢病毒载体颗粒，WT和#
30在感染效率上相近。但是，72、96和120小时收集的慢病毒，#30的慢病毒感染效率显著高于WT。
[0178] (2)慢病毒载体活性滴度的比较
[0179] 慢病毒病毒颗粒的滴度计算：T＝(P*N)/(D*V)。其中，T＝滴度(TU/ml)，P＝流式阳性细胞比例(慢病毒不同稀释倍数的感染效率，选取阳性比例在10‑20％左右的那一组计算，若阳性细胞占15％，P＝1.5)，N＝转导的细胞数，D＝稀释倍数，V＝转导时的体积。图5中，#30的HEK‑293细胞生产的慢病毒载体颗粒在活性滴度总量上约是WT的HEK‑293细胞的3倍。HEK‑293/SC细胞的结果与HEK‑293细胞类似。
[0180] 实施例4：制备靶向CD19的CAR‑NK细胞治疗淋巴瘤
[0181] CAR表达慢病毒载体的设计见图6，A。具体的，CAR结构包括抗CD19单链抗体可变区(FMC63，Genebank：HM852952.1)，CD8膜外(铰链区)、跨膜段，4‑1BB胞内段和CD3zeta胞内段，再通过T2A多肽结构串联表达人IL‑15(UniProtKB:P40933‑1)。氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0182] 使用上述的ASCT2敲除HEK‑293细胞#30或驯化后的HEK‑293/SC细胞制备慢病毒载体颗粒，可以高效的转导人脐带血来源的NK细胞。通过流式细胞术检测多个供者来源NK细胞的CAR表达比例，均值在50％左右(图6，B、C)。慢病毒转导不影响NK细胞生长，14天内在体外扩增达2千倍以上(图6，D)。HEK‑293/SC细胞的结果与HEK‑293细胞类似。
[0183] 制备的CAR‑NK细胞与表达CD19的人淋巴瘤细胞系(Raji或JeKo‑1)进行共孵育培养验证体外对肿瘤的特异性杀伤研究，在梯度递进的效靶比条件下，基于荧光素酶法检测发现CAR‑NK细胞对B细胞淋巴瘤Raji和JeKo‑1的杀伤能力显著强于NK细胞(图7，A、B)。
[0184] 基于Raji细胞植入后的NSG小鼠进行动物实验，结果显示CAR‑NK019对CD19+肿瘤细胞有明显杀伤作用，能完全清除肿瘤，并显著延长小鼠生存期(图7，C‑E)。
[0185] 本文序列
[0186] SEQ ID NO:1
[0187] ATGGTGGCCGATCCTCCTCGAGACTCCAAGGGGCTCGCAGCGGCGGAGCCCACCGCCAACGGGGGCCTGGCGCTGGCCTCCATCGAGGACCAAGGCGCGGCAGCAGGCGGCTACTGCGGTTCCCGGGACCAGGTGCGCCGCTGCCTTCGAGCCAACCTGCTTGTGCTGCTGACAGTGGTGGCCGTGGTGGCCGGCGTGGCGCTGGGACTGGGGGTGTCGGGGGCCGGGGGTGCGCTGGCGTTGGGCCCGGAGCGCTTGAGCGCCTTCGTCTTCCCGGGCGAGCTGCTGCTGCGTCTGCTGCGGATGATCATCTTGCCGCTGGTGGTGTGCAGCTTGATCGGCGGCGCCGCCAGCCTGGACCCCGGCGCGCTCGGCCGTCTGGGCGCCTGGGCGCTGCTCTTTTTCCTGGTCACCACGCTGCTGGCGTCGGCGCTCGGAGTGGGCTTGGCGCTGGCTCTGCAGCCGGGCGCCGCCTCCGCCGCCATCAACGCCTCCGTGGGAGCCGCGGGCAGTGCCGAAAATGCCCCCAGCAAGGAGGTGCTCGATTCGTTCCTGGATCTTGCGAG
[0188] SEQ ID No.2:sgRNA1 guide DNA
[0189] CGCGCCTTGGTCCTCGATGG
[0190] SEQ ID NO.3:sgRNA2 guide DNA
[0191] GCGAGCCCCTTGGAGTCTCG
[0192] SEQ ID NO.4:sgRNA1
[0193] CGCGCCUUGGUCCUCGAUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
[0194] SEQ ID NO.5:sgRNA2
[0195] GCGAGCCCCUUGGAGUCUCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
[0196] SEQ ID NO.6
[0197] ACACTCCAGCTTCCAAGAGC
[0198] SEQ ID NO:7
[0199] MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRARRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
[0200] SEQ ID NO:8
[0201] CTGGGGAATTTAAACACTCCAGC
[0202] SEQ ID NO:9
[0203] ACACCCCCAGTCCCAGCG
