[0001] 本发明属于生物制品领域，特别涉及可以用于人或其他动物体内的稳定乳液及其制备方法和用途。

[0002] 新型疫苗(如：裂解疫苗、重组亚单位疫苗、抗独特型抗体疫苗、核酸疫苗及合成肽疫苗等)结构简单，仅将病毒中可以表达特异性抗体的蛋白序列通过基因工程的方式重组表达出来，无传染性且不携带病原体炎症或引发其他副作用的成分，具有良好的生物安全性，但是这些抗原的免疫原性和免疫保护性普遍较弱，所以需要加入佐剂提升抗原保护效果，强化免疫应答。特别是应对突发疫情以及肿瘤等慢性疾病，急需合理化设计稳定、安全、高效的疫苗佐剂以强化疫苗的免疫效果。

[0003] 基于氢氧化铝或铝盐的铝微凝胶因其较大的比表面积、较高的抗原负载量以及较长的抗原储库效应，使其在疫苗佐剂中得到了广泛的应用。

[0004] 其中，以氢氧化铝和磷酸铝凝胶为主的铝微凝胶仍是我国唯一批准使用的疫苗佐剂。自1926年Glenny首先应用铝盐吸附白喉类毒素开始，至今铝微凝胶佐剂已经广泛应用于多种疫苗。虽然在百日咳、乙肝等疫苗中可以有效激活抗原特异性抗体分泌，但其佐剂的作用机制仍然不清晰，同时其细胞免疫效果较差，难以引发有效的细胞免疫对机体产生综合性的保护，在H5N1等疫苗中的响应效果十分有限，难以满足日益增加的疫苗佐剂需求。

[0005] 因此，为应对突发传染病以及肿瘤等慢性疾病，如何合理化改造铝微凝胶佐剂，以构建安全高效的疫苗佐剂，并深入探究其免疫活化机制是急需解决的关键科学问题。

[0006] 目前，对基于氢氧化铝和铝盐的铝微凝胶佐剂的改造主要集中在优化基于氢氧化铝和铝盐的铝微凝胶佐剂的形貌。如：纳米级氢氧化铝凝胶(CN103948921A)、棒状的铝佐剂(CN108324939A)以及微针阵列(CN110680916A)等；或在铝佐剂中加入免疫活化物质，如：单磷脂酰A(GSK公司的AS04)、表皮生长因子受体EGFR(CN105385658A)、双链聚核苷‑ε‑聚赖氨酸‑硫酸聚糖复合物(CN109701011A)、吲哚胺‑2,3双加氧酶的非竞争性抑制剂(CN106474468B)等。

[0007] 背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0037] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0038] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0039] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0040] 本发明的第一方面，提供一种稳定乳液，其包括油相、水相和吸附在油水界面或分散在水相中的复合稳定剂。

[0041] 复合稳定剂

[0042] 本发明的复合稳定剂包含氢氧化铝微凝胶或另加入与铝微凝胶相互作用的带电颗粒。可选地，进一步包含其他成分。

[0043] 铝微凝胶

[0044] 复合稳定剂中，氢氧化铝微凝胶是必需的组分。若采用带电颗粒，特别是带负电颗粒或非阳离子型颗粒作为第二稳定成分，两者之间相互协同作用，可以进一步实现优异的稳定效果。

[0045] 本发明中，作为必要成分的氢氧化铝铝微凝胶不特别限定，只要其氢氧化铝含量超过15％(w/w)。并且能够与带电颗粒具有生物相容性，优选能够相互作用如桥联作用即可。

[0046] 氢氧化铝微凝胶应作广义理解，只要氢氧化铝微凝胶含量(在铝源原料的质量比)超过15％均在本发明保护范围之内，其是指铝源通过酸液、碱液等调控其pH后，使得其氢氧化铝含量超过15％，通过高剪切力作用方式一步法形成氢氧化铝稳定的乳液。铝源的实例包括但不限于磷酸铝凝胶、氢氧化铝微凝胶和硫酸铝钾凝胶、蒙脱石、含有钙、锰、铝的水合盐等中的至少一种，碱液包括但不限于氨水、氢氧化钠等方式。通过碱液调控pH在6.8‑14.0范围之内，使其中氢氧化铝质量比超过15％的含有铝元素的胶体或混悬液。

[0047] 本发明可使用上述物质中的一种，也可使用多种物质的组合。在使用多种物质的组合时各种物质的混合比不特别限定，可以是任何比例。优选地，使用氢氧化铝凝胶作为铝微凝胶。

[0048] 将组分通过高剪切力作用，自发形成乳液。所述自发形成是指通过自组装形成，无需添加额外成分即可形成50nm至200μm的乳液，且乳液尺寸可控。高剪切力作用可以通过例如高压均质、超声、剧烈摇晃、加热等实现。

[0049] 本发明中，铝微凝胶的平均粒径一般在50nm‑50μm之间，例如50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、
350μm、400μm或500μm，优选100nm‑50μm之间。优选地，铝微凝胶的粒径分布系数span值低于
1.0，优选低于0.8，更优选低于0.5。

[0050] 带电颗粒

[0051] 本发明中，带电颗粒是指能够与铝微凝胶具有相互作用的带电粒子，特别是带负电颗粒，其包括非阳离子型颗粒或生物大分子。通过带电颗粒调节乳液颗粒的电位，优选将其电位调节至+10至+100mV，优选+15至+60mV，更优选+16至+50mV。

[0052] 本发明中，生物大分子的实例包括但不限于重组或天然蛋白、病毒、细菌、天然多肽、天然或人工合成短肽和核酸分子等。本发明可以使用上述物质中的一种，或者组合使用两种以上物质的混合物。在某些实施方案中，生物大分子为天然或合成白蛋白、合成或天然mRNA、DNA核酸分子、灭活病毒颗粒、重组亚蛋白及其组装体等。

[0053] 本发明中，带电颗粒的平均粒径分别在10nm～50μm之间，例如50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、
350μm、400μm或500μm，优选100nm～50μm之间。优选地，带电颗粒的粒径分布系数span值低于1.0，优选低于0.8，更优选低于0.5。

[0054] 在某些实施方案中，本发明的非阳离子型颗粒为纳微颗粒，其粒径一般为20纳米至2微米，优选20纳米至1微米，更优选40纳米至800纳米，进一步优选50‑600纳米。按成分分类，纳微颗粒包括但不限于高分子颗粒、无机颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒等。本发明可使用上述物质中的一种，或组合使用上述物质中的两种以上物质的混合物。

[0055] 在某一实施方案中，纳微颗粒为高分子颗粒，其原料包括但不限于聚乳酸/聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、海藻酸钠、壳聚糖和壳寡糖。本发明可以使用上述物质中的一种，或组合使用至少两种的组合。

[0056] 在某一实施方案中，纳微颗粒为无机颗粒，其原料包括但不限于氧化铁纳米颗粒、碳酸钙颗粒。

[0057] 在某一实施方案中，本发明的纳微颗粒为脂质体和脂质纳米颗粒，其原料包括但不限于可电离脂质、胆固醇、双亲性嵌段共聚物和阳离子脂质分子(如：DDAB、DTAB、TTAB、DOTMA、DOTAP)等。本发明可使用上述物质中的一种，或使用至少两种的组合。

[0058] 本发明的氢氧化铝微凝胶优选纳微粒径的氢氧化铝微凝胶，其可发挥免疫佐剂的作用，其佐剂作用机制可主要归因于以下几个方面：1)氢氧化铝微凝胶具有抗原储库效应，可在注射部位缓慢释放抗原；2)氢氧化铝微凝胶由于在生理条件下带正电，具有良好的亲膜性，可以促进所携带抗原的吞噬和T细胞分化，从而促进体液免疫应答；3)部分氢氧化铝微凝胶还可募集炎症细胞，从而增强抗原与抗原呈递细胞之间的作用；4)诱导注射部位细胞死亡，释放宿主双链DNA作为内源危险信号激活先天性免疫应答。

[0059] 表面性质

[0060] 本发明中，复合稳定剂一般具有油水两亲性，从而稳定地分散于油水两相界面，起到稳定乳液的作用。针对不同的油水体系，可选择具有不同亲疏水性的铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子以稳定乳液。为了增强、降低或改变复合稳定剂的特定性质，可对作为复合稳定剂的铝微凝胶和带电颗粒的表面进行修饰，如亲水修饰、疏水修饰、覆层或接枝改性。通常修饰可获得例如适宜的亲疏水性，或铝微凝胶和带电颗粒的可润湿性等。

[0061] 本发明中，复合稳定剂的表面或内部还可吸附、偶联或包埋功能物质，其实例包括但不限于例如靶向物质、荧光标记物、同位素标记物、环境响应物质、细胞因子、抗体或免疫调节剂。

[0062] 在某些实施方案中，功能物质为环境响应物质，其带有pH敏感、热敏感或生物活性物质敏感等的基团。

[0063] 在某些实施方案中，功能物质为抗原，从而可提高抗原稳定性，促进抗原提呈细胞对抗原的摄取，增强免疫应答。

[0064] 含量

[0065] 氢氧化铝微凝胶及复合稳定剂在稳定乳液中的含量(或称为质量浓度)不特定限定，复合稳定剂在水相中的质量浓度为复合稳定剂中铝微凝胶和带电颗粒的总质量除以复合稳定剂和水相质量之和的比值。该质量浓度一般为0.02～20wt％，优选为1～10wt％，进一步优选为1.5～8wt％。

[0066] 在某些实施方案中，复合稳定剂在水相中的质量浓度例如为0.5wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、
14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％或19wt％。

[0067] 本发明中，复合稳定剂的铝微凝胶和带电颗粒的用量比不特别限定，基于质量一般为99:1‑1:2。

[0068] 油相

[0069] 本发明中，油相不特别限定，可使用本领域已知的任何油相物质，优选使用生物可降解油相或可体内代谢的油。体内可代谢油可以是任何对受体无毒并可通过代谢作用转化为其他物质，其包括植物油、鱼油、动物油或合成油等，具体实例包括但不限于大豆油、米格列醇(Miglyol 812)、中链油、鱼油、维生素E、维生素E琥珀酸酯、维生素E醋酸酯、红花油、玉米油、沙棘油、亚麻子油、花生油、茶油、葵花籽油、杏仁油、薏仁油、月见草油、芝麻油、棉籽油、蓖麻油、低芥酸菜子油、油酸乙酯、油酸、亚油酸乙酯、月桂酸异丙酯、内豆蔻酸异丙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸甘油三酯或癸酸甘油三酯中的任意一种或者至少两种的组合。坚果、种子和谷物是常见的植物油来源。

[0070] 在某些实施方案中，本发明的油相优选角鲨烯和生育酚中的一种或两种的混合物。角鲨烯是一种三萜类化合物，可来源于动物、植物提取或化学合成。角鲨烯是一种可代谢的油。这是一种所有高等生物，包括在人类身上(皮脂中可以找到)自然分泌的油脂。含有角鲨烯的乳液(含表面活性剂)在动物实验和临床实验上表现出优异的免疫增强作用。

[0071] 本发明中，生育酚是α‑生育酚或其衍生物如α‑生育酚琥珀酸酯(也称作维生素E琥珀酸酯)。α‑生育酚在针对老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中，可以起到增强免疫应答的作用。存在的生育酚包括α、β、γ、δ、ε、ζ等多种生育酚，优选α‑生育酚，尤其是DL‑α‑生育酚。优选地，所述油相与水相互不相溶，还可以包括其他可代谢的油。

[0072] 水相

[0073] 本发明中，水相是指与油相不相容的第二相溶液，优选为纯化水、注射用水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液。本发明可使用上述水相中的一种，或者使用两种以上的组合。作为组合的示例，包括例如注射用水和磷酸盐缓冲液的组合，柠檬酸缓冲液和Tris缓冲液的组合，注射用水、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液的组合，Tris缓冲液、注射用水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液和Tris缓冲液的组合等。

[0074] 本发明中，磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液的pH值各自分别为5.0‑8.1，例如5.2、5.4、5.6、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8或8，优选为6.0‑8.0。

[0075] 本发明的水相中可选地含有单价或多价抗原，所述抗原包括但不限于人类抗原、非人类动物抗原、植物抗原、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原或肿瘤抗原中的任意一种或者至少两种的组合。所述组合例如人类抗原和非人类动物抗原的组合，植物抗原和细菌抗原的混合物，真菌抗原、病毒抗原和寄生虫抗原的组合，肿瘤抗原、人类抗原、非人类动物抗原、植物抗原、细菌抗原和真菌抗原的组合，病毒抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原、人类抗原、非人类动物抗原和植物抗原的组合，细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原和肿瘤抗原的组合。

[0076] 在某些实施方案中，本发明的抗原包括但不限于鸡胚培养、细胞培养、携带者体液、器官或组织中纯化分离所得、重组基因表达或化学合成所得，优选所述抗原包括但不限于减毒疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗、多糖结合疫苗、重组疫苗或DNA疫苗等中的任意一种或者至少两种的组合。所述组合例如减毒疫苗和灭活疫苗的组合，裂解疫苗和亚单位疫苗的组合，多糖结合疫苗、重组疫苗的组合，DNA疫苗和减毒疫苗的组合，灭活疫苗和裂解疫苗的组合，亚单位疫苗、多糖结合疫苗、重组疫苗和DNA疫苗的组合。

[0077] 在某些实施方案中，本发明的抗原为病毒重组蛋白或者肿瘤新生抗原的短肽疫苗。其中，病毒重组蛋白选自：人类流感病毒中A、B、C型，包含H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N3、H10N7；猪型流感病毒H1N1、H1N2、H3N1、H3N2；狗或马型流感病毒H7N7、H3N8；或禽流感病毒H5N1、H7N2、H1N7、H7N3、H13N6、H5N9、H11N6、H3N8、H9N2、H5N2、H4N8、H10N7、H2N2、H8N4、H14N5、H6N5和H12N5中的一种或一种以上的流感病毒组合。肿瘤新生抗原的短肽疫苗为针对个体化肿瘤的基因测序所得到的肿瘤特异性变异形成的短肽抗原。

[0078] 本发明的水相中还包括可选的药用辅助物质。如pH调节剂或/和缓冲剂等，优选选自乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、人血清清蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸、L‑精氨酸盐酸盐、蔗糖、无水D‑海藻糖、甘露醇、甘露糖、淀粉和明胶中的任意一种或者至少两种的组合。所述组合例如乙酸钠和乳酸钠的组合，氯化钠和氯化钾的组合，氯化钙、人血清清蛋白和必需氨基酸的组合，非必需氨基酸、L‑精氨酸盐酸盐、蔗糖和无水D‑海藻糖的组合，甘露醇、甘露糖、淀粉和明胶的组合，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和人血清清蛋白的组合，必需氨基酸、非必需氨基酸、L‑精氨酸盐酸盐、蔗糖、无水D‑海藻糖、甘露醇、甘露糖、淀粉和明胶的组合。

[0079] 在某些实施方案中，本发明的稳定乳液为水包油乳液，其包括可选的佐剂，其实例包括但不限于：模式识别受体(例如Toll样受体、RIG‑1和NOD样受体(NLR)的刺激剂，如含CpG基序的寡核苷酸或双链RNA或含回文系列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸)、矿物盐(例如明矾，与肠细菌(例如大肠杆菌、明尼苏达沙门菌、鼠伤寒沙门菌、或弗氏志贺菌)的单磷酰脂质(monphosphoryllipid,MPL)A结合的明矾或分别与 (AS04)、以上提到TM
的细菌MPLA特异性结合的明矾)、MPL、皂苷(如QS‑21、Quil‑A,iscoMs,iscomatrix )、脂质体和脂质体配制品(如AS01)、合成的或特别制备的微颗粒和微载体(如淋病奈瑟球菌
(N.gonorrheae)、沙眼衣原体和其他细菌的源于细菌的外膜泡(OMV))、多糖(如壳聚糖)、特异性修饰或制备的肽(例如胞壁酰二肽)、氨基烷基氨基葡糖苷4‑磷酸酯(如RC529)、或蛋白质(如细菌类毒素或毒素片段)、可选择的病原相关分子模式(PAMPS)、小分子免疫增强剂(SMIP)、细胞因子和趋化因子。细胞因子包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、干扰素(如干扰素‑α(IFN‑α)、干扰素‑β(IFN‑β)、干扰素‑γ(IFN‑γ等)、白细胞介素(如白细胞介素‑1α(IL‑1α)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)、白细胞介素‑2(IL‑2)、白细胞介素‑4(IL‑4)、白细胞介素‑7(IL‑7)、白细胞介素‑12(IL‑12)、白细胞介素‑15(IL‑15)、白细胞介素‑18(IL‑18))、胎儿肝酪氨酸激酶3配体(FIt3L)或肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)等。

[0080] 油水相体积比

[0081] 本发明的稳定乳液中，油相和水相两相的体积比一般为1：100～9：1，例如1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1，优选为
1：50～1：2。

[0082] 油乳佐剂

[0083] 本发明的稳定乳液可用作油乳佐剂，例如疫苗佐剂或疫苗递送系统。本发明的稳定乳液作为油乳佐剂具有优异效果。

[0084] 本发明的油乳佐剂包含佐剂组合物，所述佐剂组合物可包含本发明的稳定乳液，或由其组成。可选地，油乳佐剂进一步包含抗原或抗原组合物。当油乳佐剂中含有抗原时，所述油乳佐剂可以和抗原独立包装，在免疫接种前临时混合或在较短的时间间隔内(通常为1小时以内，包含1小时)接种到同一部位，也可预先根据前述制备方法先混合后包装，在免疫接种时可以直接应用。

[0085] 本发明的油乳佐剂中乳滴的平均粒径在100nm～800μm之间，例如100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、800nm、1μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、
600μm、700μm、750μm或800μm，优选在300nm～500μm之间。

[0086] 本发明中所述油乳佐剂可采用已知方法制备。例如，对于聚(丙交酯‑共‑乙交酯)固体颗粒，可以采用溶剂蒸发法、溶剂萃取法、沉淀法等多种方法制备。对于壳聚糖固体颗粒，可以采用单乳法(形成油包水乳液)结合化学交联法(如采用溶解在油相中的戊二醛交联)制备，也可以采用喷雾干燥或沉淀法制备。具体地，本发明中所述油乳佐剂可采用下述方法制备，但不受下述制备方法的限制。

[0087] 本发明中所述油乳佐剂可采用先将铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子分散在水相中，然后将油相和水相混合制备。铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子的分散方式可以选择振荡、搅拌、均质、高压微射流、超声等多种方式，以实现铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子在水相中的良好分散。只要能实现铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子在水相中的良好分散，所采用的分散方式不会对水包油乳液的性质造成明显影响，可根据所用水相及铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子性质及自身的实验设备条件选择合适的分散方式及具体操作参数。油相和水相的混合可以选择微流控、均质、超声、注射器双推乳化(Two‑syringe emulsification)、喷雾、微射流、微通道、膜乳化、搅拌、振荡、倒转或手摇混合等多种方式。根据不同的需求，混合方式可以优选微流控、微通道或膜乳化等可以获得均一粒径分布乳液的方式，也可以优选微射流、注射器双推乳化、均质、搅拌或振荡等便于规模化制备的混合方式。应该明确的是，不同的油水相混合方式必然影响所得乳液中乳滴的粒径大小、乳液稳定性等，也将影响到最终的免疫或给药效果。

[0088] 与机械搅拌相比较，采用膜乳化方式可以得到粒径分布更为均一、乳滴更小的乳液，可以获得更高的抗体水平。因此，应根据所用油水相及铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子性质、所需制备的乳滴粒径范围等影响因素确定合适的混合方式及具体操作参数。

[0089] 制备后，可将铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子保存在水溶液或缓冲溶液中，也可冻干待用。

[0090] 本发明中所述油乳佐剂的灭菌方式可以采用湿热灭菌或过滤除菌，当所用铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子的粒径小于220nm时，优选采用过滤除菌的方式。

[0091] 本发明的油乳佐剂可通过已知方法给药，免疫接种或给药方式包括静脉注射、脊椎腔注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、经呼吸道喷入或吸入、腹腔注射、经鼻给药、局部给药或透皮给药。油乳佐剂作为疫苗佐剂可用于人类、畜类、禽类及水产类。

[0092] 本发明的油乳佐剂具有优异的免疫效果。本发明的稳定乳液不仅可以避免表面活性剂对疫苗制剂的负面影响，而且相比于单一颗粒稳定的乳液，本发明得到的乳液无论是分散性还是稳定性都表现出更优的性能。

[0093] 通过将铝微凝胶和带电颗粒如非阳离子型颗粒/生物大分子颗粒佐剂与油乳佐剂结合，可协同发挥二者的免疫增强及调节作用，降低抗原用量，提高抗体水平，同时还可增加抗体类型的多样性，产生范围更为广泛的针对不同类型抗原的抗体。且这种复合型乳液性质可调控，粒径较小，比表面积大，是协同递送多抗原的较为理想的递送体系，也可作为多价抗原差异化递送载体。与此同时，铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子颗粒佐剂和油乳佐剂的免疫协同作用，获得更为全面、显著、持久的免疫保护效果。该油乳佐剂具有良好的安全性和稳定性，并可用于疫苗的不同接种途径。

[0094] 铝微凝胶和带负电颗粒的加入，不仅可以提高制剂的生物相容性，避免表面活性剂对人体、动物或疫苗带来的不良影响，并且能够更加有效地刺激免疫细胞，激发免疫调节功能；同时，铝微凝胶和带负电颗粒的性质便于调控，可以对其进行表面修饰或覆层，或者选择不同性质(如组成、形貌、结构、粒径等)的铝微凝胶和带电颗粒如非阳离子型颗粒/生物大分子，发挥不同的免疫增强机制，以及对抗原进行包埋、吸附或偶联，作为抗原的运送载体，利用其抗原控制释放的能力来调节免疫应答，还可以应用于多种免疫接种方式。

[0095] 铝微凝胶除了作为稳定成分之一外，其本身还具有免疫佐剂作用。铝微凝胶具有免疫佐剂作用的机制可能在于：1)铝微凝胶具有抗原储库效应，可在注射部位缓慢释放抗原；2)铝微凝胶由于在生理条件下带正电，具有良好的亲膜性，可以促进所携带抗原的吞噬和T细胞分化，从而促进体液免疫应答；3)部分铝微凝胶，如纳微粒径的铝微凝胶还可募集炎症细胞，从而增强抗原与抗原呈递细胞之间的作用；4)诱导注射部位细胞死亡，释放宿主双链DNA作为内源危险信号激活先天性免疫应答。

[0096] 本发明中油乳佐剂的主要免疫增强机制包括：

[0097] (1)当使用铝微凝胶和带电颗粒如非阳离子型颗粒/生物大分子对抗原进行吸附或包埋时，该油乳佐剂可起到延缓抗原释放速度，保护抗原不被水解，延长抗原在体内滞留时间，有利于高亲和力抗体的产生；

[0098] (2)铝微凝胶和带电颗粒如非阳离子型颗粒/生物大分子由于界面的疏水作用，增强了乳液与DC细胞膜得相互作用力，促进DC细胞内吞；

[0099] (3)当使用铝微凝胶和带电颗粒如非阳离子型颗粒/生物大分子对抗原进行吸附或包埋时，可增加抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；

[0100] (4)油乳佐剂还可在注射部位引起轻微的炎症反应，募集炎症细胞，刺激炎症因子的分泌，激活免疫反应；

[0101] (5)某些特殊铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子，如具有pH敏感性的氢氧化铝凝胶，吸附或包埋抗原后，可实现抗原的溶酶体逃逸，增强细胞免疫应答。

[0102] 实施例

[0103] 一、本实施例的原料信息如下：

[0104]

[0105]

[0106] 二、本实施例使用的仪器如下：

[0107]

[0108] 三、性质表征方法：

[0109] 1、铝微凝胶或非阳离子型颗粒/生物大分子或油乳佐剂乳滴的粒径分布测定：

[0110] 微米级铝微凝胶或非阳离子型颗粒/生物大分子或油乳佐剂乳滴的粒径分布采用激光粒度仪进行测定。具体测定步骤为：将5mL微米级的铝微凝胶或非阳离子型颗粒/生物大分子加入到50mL的去离子水中，超声5min使其均匀分散，或取50mL油乳佐剂乳液稀释液，将铝微凝胶或非阳离子型颗粒/生物大分子悬浮液，或油乳佐剂乳液稀释液加入到样品池中，采用激光粒度仪(Malvern Instruments,United Kingdom Coulter Co.,USA)进行测定。

[0111] 纳米级铝微凝胶或非阳离子型颗粒/生物大分子，或铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子制备的稳定乳液中乳滴的粒径分布采用Zeta电位及粒度分析仪进行测定。具体测定步骤为：将1mL纳米级铝微凝胶悬浮液，加入10mL去离子水中，超声5min使其均匀分散，或取2mL乳液稀释液，将铝微凝胶悬浮液或乳液稀释液加入到样品池中，放入Zeta电位仪(Zeta Potential Analyzer,Brookhaven Instruments Corporation)中进行测定。

[0112] 铝微凝胶或铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子制备的稳定乳液中乳滴的均一性由粒径分布系数(Span)值表示。Span计算公式如下，其值越小表明颗粒粒径越均一。

[0113] Span＝(d90‑d10)/d50               (1)

[0114] 式(1)中，d10、d50和d90分别为可电离片层结构凝胶累计体积为10％、50％、90％时的粒径。

[0115] 2、铝微凝胶的形貌观察

[0116] 取1mL铝微凝胶悬浮液，加入10mL去离子水中，超声5min使其均匀分散。吸取1mL悬浮液，将其滴在铝箔上，使其在铝箔上均匀摊开，自然晾干。将铝箔用导电胶贴于样品台上，在真空条件下喷金(根据样品性质选取合适的喷金条件)后，用扫描电子显微镜进行观察。

[0117] 3、油乳佐剂乳滴的形貌观察

[0118] 吸取少量铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的油乳佐剂乳液，滴于载玻片上，置于光学显微镜下观察。

[0119] 4、乳液的稳定性检测

[0120] 采用离心法检测：取5mL油乳佐剂乳液，加入15mL离心管中，在6000g离心力作用下离心10min后，观察分层情况。

[0121] 5、稳定乳液中乳滴上吸附抗原的吸附率及载量的测定：

[0122] 取出吸附抗原后的铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的乳液悬浮液，离心取下清(根据铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子的大小和密度选择合适的离心条件)，测量下清中抗原浓度，从而间接计算出吸附到铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的乳液表面的抗原的量。抗原或药物含量采用BCA或micro‑BCA试剂盒或荧光强度测试或其他适宜的检测方法测定。抗原或药物吸附率按以下公式计算：

[0123] 吸附率＝(吸附前抗原浓度—吸附后下清中抗原浓度)/吸附前抗原浓度×100％

[0124] 抗原在铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子的载量按以下公式计算：

[0125] 载量＝(实测铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的乳液上抗原量/所测铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定乳液的质量)

[0126] 5、动物实验测定：

[0127] 实验所采用的C57小鼠由维通利华公司提供。免疫步骤基本如下：先将小鼠随机分组，每组采用6只以上的小鼠进行实验，根据具体说明对小鼠进行分组和免疫接种。在接种前，先取血200μL，立即在12000rpm下离心5min，分离出血清，测定IgG抗体水平，以此时的IgG抗体水平作为初始值，然后对小鼠进行免疫。免疫后，定时从小鼠眼周或尾尖取血，每次取血200μL，并测定IgG抗体水平。两周后进行二次免疫，35天处死小鼠，取血，测定IgG抗体水平(对于流感疫苗，还要测定血凝滴度(HI))。取小鼠脾细胞进行培养，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠脾细胞培养液上清中的的IL‑4和IFN‑γ细胞因子的分泌情况。

[0128] 实施例1

[0129] 本实施例为铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的稳定乳液的制备与表征。

[0130] 以表1所述的配方，将铝微凝胶加入到含有不同含量非阳离子型颗粒/生物大分子颗粒的柠檬酸‑柠檬酸盐缓冲溶液中，超声0.5‑2min使其分散均匀。其中水相pH值为7.4。用移液枪吸取油相(如：角鲨烯等，油水比为1：9)加入到上述水相悬浮液中，采用超声(50W，2min)乳化的方法，制备铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的油乳佐剂(图1)。

[0131] 表1稳定乳液的配方

[0132]

[0133]

[0134] 氢氧化铝微凝胶可以很好地稳定油水界面。对于混合稳定剂而言(蒙脱石、磷酸铝与氢氧化铝的混合稳定剂)，当稳定剂中氢氧化铝微凝胶质量比超过15％可以形成稳定的乳液(第1、3、4号)，而当氢氧化铝含量较低时(2号)，则难以得到稳定的乳液。对于复合稳定剂而言，随着非阳离子型颗粒/生物大分子浓度的增加，乳液粒径减小，但当非阳离子型颗粒/生物大分子大于0.5％时，乳液粒径不再减小，反而电位降低，导致乳液不稳定。选择0.5％非阳离子型颗粒/生物大分子浓度下获得的乳液，其乳滴分散性良好，球形规整。乳滴的平均粒径为800nm，Span为0.696。所制备油乳佐剂的外观与未离心乳液无差异，且离心后，上层无油相析出，说明乳液稳定性较好(图2)。

[0135] 实施例2

[0136] 本实施例为稳定乳液储存稳定性的测试例。

[0137] 将表面活性剂稳定的乳液、氢氧化铝微凝胶稳定的乳液以及实施例1所制备的乳液(铝微凝胶/PLGA纳米颗粒(粒径：100nm)稳定的乳液、铝微凝胶/白蛋白(人血清来源)稳定的乳液)，放置于37℃恒温恒湿培养箱，观察所制备油乳佐剂得稳定性。间隔不同时间利用粒度仪测量所放置油乳佐剂的粒径和电位，肉眼观察乳液是否有油析出，是否出现乳液的油水分层现象，并用光镜观察所制备油乳佐剂的形态。

[0138] 实验结果表明，表面活性剂稳定的乳液出现明显的乳滴聚集，变大的现象。而所制备氢氧化铝微凝胶稳定的乳液，以及氢氧化铝微凝胶与非阳离子型颗粒/生物大分子复合稳定剂稳定的乳液，在室温下放置超过60天均能保持乳液的形态且具有良好分散性。但是，复合稳定剂稳定的乳液粒径明显较小(图3)。并且，从光镜图和动态光散射数据分析，两者乳液经过长期储存，粒径和形貌并无明显变化(图4)，显著优于表面活性剂稳定的乳液以及单独非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的乳液，说明氢氧化铝微凝胶对于油水界面的稳定具有十分重要的作用。更重要的是，加入非阳离子型颗粒/生物大分子形成的复合稳定剂，可以进一步降低乳液粒径，提升乳液的储存稳定性。

[0139] 实施例3

[0140] 本实施例为稳定合乳液安全性评价例。

[0141] 注射部位以及组织毒性试验。将表面活性剂稳定的乳液、铝微凝胶稳定的乳液以及实施例1所制备的乳液(铝微凝胶/PLGA纳米颗粒(粒径：100nm)稳定的乳液、铝微凝胶/白蛋白(人血清来源)稳定的乳液)，肌肉注射小鼠。免疫后14天后，眼眶取血，通过生化分析仪表征血清指标。如表2所示，表面活性剂稳定的乳液在肝功能(ALT)出现明显升高，而铝佐剂稳定的乳液，以及实施例2所制备的铝微凝胶和非阳离子型颗粒/生物大分子稳定的复合乳液在肝功能(碱性磷酸酶，alkaline phosphatase，ALP；丙氨酸转氨酶，Alanine aminotransferase，ALT；天冬氨酸转氨酶，Aspartate aminotransferase，AST)、肾功能(尿素氮，blood urea nitrogen，BUN)、心肌功能(乳酸脱氢酶，lactate dehydrogenase，LDH)等指标均与无处理组无明显变化，表明所制备得油乳佐剂具有更好的生物安全性。

[0142] 表2

[0143]

[0144] 实施例4

[0145] 本实施例研究稳定乳液剂量对免疫效果的影响。

[0146] 按照实施例1中方法制备氢氧化铝微凝胶/白蛋白(人血清来源)稳定的乳液。随后，将制备得到的乳液与OVA抗原稀释液以2:1、1:1、1:2、1:4(v/v)(对乳液进行稀释，比如加入乳液50微升，抗原稀释液就是25微升；50微升；100微升；200微升)等不同比例混合组成疫苗佐剂组合物，其中抗原终浓度均为0.02mg/mL，每剂疫苗佐剂组合物体积均为0.1mL。以上述疫苗佐剂组合物对小鼠进行肌肉注射接种，两周后进行二次免疫。一免28天后取血清，检测血清中抗原特异性抗体IgG的滴度(以GB/T 18936‑2003方法表征)。

[0147] 如表3所示，提高疫苗佐剂组合物中乳液的剂量，当每剂疫苗的抗原含量相同时，可增加同等浓度抗原产生的体液免疫应答水平(血清IgG滴度)。且乳液剂量与免疫活化效果正相关。更重要的是，与表面活性剂稳定的乳液相比，氢氧化铝微凝胶稳定的乳液引发了更有效的抗原特异性血清IgG抗体的分泌。而在一定复配比例下(氢氧化铝/白蛋白混合比例>1:1)，复合稳定剂稳定的乳液可以引发更强的血清抗体滴度水平，且显著优于氢氧化铝微凝胶稳定的乳液以及白蛋白稳定的乳液，具备更好的免疫活化效果。

[0148] 表3

[0149]佐剂种类 氢氧化铝/白蛋白混合比例 血清IgG滴度
铝微凝胶/白蛋白复合乳液 4:1 409600
铝微凝胶/白蛋白复合乳液 2:1 409600
铝微凝胶/白蛋白复合乳液 1:2 204800
铝微凝胶/白蛋白复合乳液 1:4 25600
表面活性剂稳定的乳液 ‑ 51200
铝微凝胶稳定的乳液 ‑ 204800
白蛋白稳定的乳液 ‑ 12800

[0150] 实施例5

[0151] 本实施例研究不同抗原浓度的疫苗对免疫效果的影响。

[0152] 按照实施例1的方法制备氢氧化铝微凝胶/PLGA纳米颗粒(粒径：100nm)稳定的乳液。随后，将其与SARS‑CoV‑2重组蛋白抗原复配，构建不同抗原浓度的复合物(抗原浓度分别为：0.025mg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL)。以每剂0.1mL经肌肉接种免疫Balb/c小鼠，两周后二次免疫，分别于一免28天和35天收集血清，以GB/T 18936‑2003方法检测血清中抗原特异性抗体IgG的滴度。

[0153] 结果如表4所示，本发明所构建的复合乳液可以显著提升SARS‑CoV‑2重组蛋白抗原的抗体分泌效果，具有良好的佐剂作用，佐剂疫苗能够明显提高小鼠体内免疫应答强度。

[0154] 表4

[0155] 佐剂种类 抗原浓度 28天血清IgG水平 35天血清IgG水平铝微凝胶/PLGA颗粒复合乳液 0.025μg/mL 514200 543800
铝微凝胶/PLGA颗粒复合乳液 0.05μg/mL 620000 640200
铝微凝胶/PLGA颗粒复合乳液 0.1μg/mL 624800 640200
无 0.025μg/mL 72240 80480
无 0.5μg/mL 78560 84600
无 0.1μg/mL 78600 85000

[0156] 实施例6

[0157] 本实施例研究不同铝微凝胶与非正电荷颗粒比例对免疫效果的影响。

[0158] 调节白蛋白/铝微凝胶的质量比分别为1/2、1/4、1/16、1/32，按照实施例1中方法制备铝微凝胶/白蛋白(人血清来源)稳定的乳液。随后将其与OVA混合，制备的剂型抗原终浓度均为0.02mg/mL，每剂疫苗组合物体积均为0.1mL。以上述疫苗佐剂组合物对C57小鼠进行肌肉注射接种，两周后进行二次免疫，于一免28天后取血清，检测抗体。

[0159] 如表5所示，提高疫苗复合乳液配方中白蛋白的浓度，可以显著增强抗原产生的免疫应答水平，BSA浓度与佐剂作用强度正相关。

[0160] 表5

[0161] 乳液稳定剂 血清IgG水平白蛋白/铝微凝胶(1/2) 102400
白蛋白/铝微凝胶(1/4) 204800
白蛋白/铝微凝胶(1/16) 204800
白蛋白/铝微凝胶(1/32) 102400
氢氧化铝微凝胶 102400
白蛋白 25600

[0162] 尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。