[0001] 本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种PRRSV M蛋白SLA‑1*04:01:01限制性T细胞表位多肽及其应用。

[0002] 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种重要病毒性疾病，对中国养猪业造成了巨大的经济损失(Zhou and Yang，2010)。PRRSV侵入机体后，可引发机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，研究表明，细胞免疫对清除机体病毒可能起着更重要的作用(Mateu and Diaz,2008)。PRRSV包含3个重要的结构蛋白：GP5蛋白、M蛋白和N蛋白。其中，M蛋白是PRRSV的膜基质蛋白，无糖基化位点，是欧洲型和北美洲型分离毒株中最为保守的结构蛋白。它在病毒的组装及出芽时担任重要角色(Mardassi et al.,1996)，与病毒的感染性密切相关(Wissink et al.,2005)。M蛋白具有较强的免疫原性，不仅可以诱导机体产生中和抗体，还能诱发较强的特异性细胞免疫应答，与免疫保护相关，在细胞免疫中可能起主要作用(Jeong et al.,2010)。因此，研究M蛋白可为深入研究PRRS的细胞免疫机制提供理论依据。从1991年首次分离到PRRSV毒株以来，毒株不断遗传进化和重组发生变异(Gao et al.,2017)，形成致病性不同的多样野毒株，严重阻碍了安全有效的疫苗开发(Nilubol et al.,2004)。目前商业改良的减毒活疫苗并不能对所有的异源PRRSV毒株提供广泛的交叉保护作用，因此亟待研发新型疫苗进行防控。

[0003] 串联重复多肽合成法是筛选病毒CTL表位最常用的方法。即在已知抗原一级结构的条件下，根据抗原蛋白的氨基酸序列随机合成或连续合成一个或几个重叠氨基酸的一系列肽段，通过淋巴细胞功能试验确定可以被T细胞识别的肽段。Wang等曾采用该方法对HP‑PRRSV M蛋白T细胞表位的位置进行了初步鉴定，发现了4个短肽(各包含15个氨基酸残基)可能存在能够诱导细胞免疫的特异性T细胞表位(Wang et al.,2011)，但并未筛选到具备CTL表位特征的九聚肽，也未鉴定其MHC限制性，而且由于MHC分子的高度多态性也可能造成漏检。因此在合成肽段之前，对其与MHC分子结合的可能性进行预测，先筛选出最有可能的抗原片段，再通过体内、体外一系列的免疫学试验对预测的结果进行验证，不仅可减少工作量、节省花费，而且能提高试验的成功率。Zhang等利用生物信息学方法预测合成了PRRSV M蛋白的一些CTL肽段，然后分离Balb/c小鼠脾淋巴细胞，通过体外免疫学试验最终鉴定出2个H‑2Kd和H‑2Dd限制性的CTL表位(Zhang et al.,2011b)。宋艳华同样利用生物信息学方法结合体外免疫学试验鉴定了M蛋白的2个CTL表位(宋艳华，2012)。然而，这些研究并未进行体内免疫学试验验证因而不能确定为真正的表位。也未鉴定表位的猪MHC(SLA)限制性，从而降低了表位的应用范围，筛选具有SLA限制性的表位多肽才具有更大的应用价值。1、以前鉴定SLA限制性表位的方法有缺陷，本申请提供的方法更可靠有效。2、目前商业改良的减毒活疫苗并不能对所有的异源PRRSV毒株提供广泛的交叉保护作用，需要开发新型疫苗。

[0030] 实施例1.抗原表位的预测和合成

[0031] 1、软件预测PRRSV M蛋白SLA‑1*04:01:01限制性T细胞九聚肽表位

[0032] PRRSV(病毒株HuN4)M蛋白由174个氨基酸残基组成，可以由NCBI网站的蛋白质数据库获得具体的M氨基酸序列(Access No.ABR26254)，结合在线预测软件ICES(http://sb.nhri.org.tw/ICES)、IEDB Analysis Resoure(http://tools.immuneepitope.org/main/)和NetMHCpan 4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)软件，对PRRSV HuN4株M蛋白SLA‑1*04:01:01限制性T细胞表位进行预测。预测得到由不同品种猪常见分子SLA‑1*04:01:01限制的PRRSV M蛋白的九聚肽T细胞表位肽段。综合软件预测结果，依次选择与SLA‑1*04:01:01亲和力较高的27条九聚肽(表1)。

[0033] 表1 PRRSV M蛋白SLA‑1*04:01:01限制性T细胞九聚肽表位的预测

[0034]

[0035]

[0036] 2、预测获得的PRRSV M蛋白九聚肽的合成

[0037] 根据软件预测的PRRSV M蛋白SLA‑1*04:01:01限制性T细胞表位结果，委托北京六合华大基因科技有限公司合成九聚肽27条，每条九聚肽合成4mg，经RP HPLC测定纯度均>90％。将合成的肽段干粉用1％无菌二甲基亚砜(DMSO‑water)溶解至终浓度为500ug/ml保存于‑80℃超低温冰箱备用，使用时用含10％FBS RPMI‑1640进一步稀释。

[0038] 实施例2.筛选多肽

[0039] 1.体外构建SLA‑I复合体检测和筛选与SLA‑1*04:01:01分子特异性结合的候选九聚肽

[0040] 1.1体外构建SLA‑I复合体

[0041] SLA I类分子的多态性主要集中第2和第3外显子，两个外显子分别编码α1和α2结构域，二者共同构成抗原肽结合槽，该结合槽可再被分成六个不同的口袋(A‑F)，决定着T细胞表位结合的特异性，不同等位基因结合不同类型的T细胞表位是由适合SLA‑I抗原肽结合槽中口袋的氨基酸以及肽段的锚定残基共同决定。当结合槽结合特异的多肽表位后，空间构象发生变化从而形成一个异三聚体，包括SLA I类重链，单一形态的轻链(β2m)以及特异+性结合的多肽表位，这种异聚体蛋白几乎组成型表达于各种有核细胞表面，对CD8T淋巴细+
胞的正常发育至关重要，它主要递呈抗原表位给CD8CTLs，CTLs通过识别细胞表面与SLA I类分子结合的抗原表位(内源性抗原T细胞表位)而杀伤靶细胞。模拟体内SLA I类分子的作用方式，在体外构建SLA I类分子复合体分析肽结合槽内氨基酸残基与多肽之间的相互作用，筛选出与SLA I类分子具有高亲和力的多肽并鉴定潜在的表位，避免了仅以蛋白序列信息预测表位的片面性，提高了表位鉴定的准确性，是一个良好的切实可行的抗原多肽筛选系统。

[0042] 具体构建过程如下：首先PCR扩增SLA‑1*04:01:01胞外区和β2m成熟肽区，引物见表2。再采用SOE‑PCR技术，将SLA‑1*04:01:01胞外区与β2m成熟肽区连接，中间加一富含甘氨酸和丝氨酸的Linker：(G4S)3，(加柔性Linker是为了表达的蛋白复性时，可以更好的形成空间构象，更容易与肽段特异性结合。是与SLA‑1*04:01:01胞外区与β2m成熟肽区一起连接到30a载体上的，表达的蛋白包含这一段)利用限制性内切酶位点pET‑30a载体连接，构建pET‑SLA‑1*040101‑β2m重组表达质粒，然后将预测的27个PRRSV M蛋白候选表位(epitope)的核苷酸序列分别插入到SLA‑1*04:01:01胞外区前面，构建成27个pET‑epitope‑SLA‑1*040101‑β2m复合体(多肽‑SLA‑1胞外区‑β2m)重组表达质粒(“epitope”指候选表位，具体表示时可换成M1、M2、M3等)(示意图见图1)，将pET‑SLA‑1*040101‑β2m(将SLA‑1*04:01:01胞外区与β2m成熟肽区连接，中间加一富含甘氨酸和丝氨酸的Linker与pET‑30a载体连接)和
27个pET‑epitope‑SLA‑1*040101‑β2m重组质粒原核表达，SDS‑PAGE结果显示分别在
45.5kDa和47.4kDa处出现目的条带，与预期大小一致，表达蛋白为包涵体，利用蛋白重折叠试剂盒将蛋白重折叠复性后，目的蛋白条带较为单一。Western blot检测His标签蛋白，结果28个重组蛋白中均检测到单一条带，与表达条带大小一致，以pET‑M1‑SLA‑1*040101‑β2m重组质粒的结果为例，图2中的泳道1、4、6是选取了27个带表位重组质粒中的一个做了示例，分别表示了诱导表达、复性、WB结果。其余26个和这个完全相同。(图2)。

[0043] SLA‑1*04:01:01胞外区序列：(SEQ ID NO.7)

[0044] GGTCCCCACTCCCTGAGCTATTTCTACACCGCCGTGTCCCGGCCCGACCGCGGGGACT

[0045] CTCGCTTCATCGCCGTCGGCTACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAACTA

[0046] CGCCCCGAATCCGCGGATGGAGCCTCGGGTGCCGTGGATACAGCAGGAGGGGCAGGA

[0047] GTATTGGGATCGGGAGACGCGGAATGTCAAGGAAACCGCACAGACTTACGGAGTGGG

[0048] CCTGAACACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCGGGTCTCACACCCTCCA

[0049] GAGCATGTACGGCTGCTACTTGGGACCAGACGGGCTCCTCCTCCACGGGTACAGACA

[0050] GGACGCCTACGACGGCGCCGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGAC

[0051] CGCGGCGGACATGGCGGCTCAGATCACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCGATGAGGC

[0052] GGAGCGTAGGAGGAGCTACCTGCAGGGACTGTGTGTGGAGTCGCTCCGCAGATACCT

[0053] GGAGATGGGGAAGGACACGCTGCAGCGCGCAGAGCCTCCAAAGACACATGTGACCCG

[0054] CCACCCCAGCTCTGACCTCGGGGTCACCTTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCT

[0055] AAGGAGATCTCCCTGACCTGGCAGCGGGAGGGCCAGGACCAGAGCCAGGACATGGA

[0056] GCTGGTGGAGACCAGGCCCTCAGGGGATGGGACCTTCCAGAAGTGGGCGGCCCTGGT

[0057] GGTGCCTCCTGGAGAGGAGCAGAGCTACACCTGCCATGTGCAGCACGAGGGCCTGCAGGAGCCCCTCACCCTGAGATGG。

[0058] β2m成熟肽区序列：(SEQ ID NO.8)

[0059] GTCGCGCGTCCCCCGAAGGTTCAGGTTTACTCACGCCACCCAGCGGAAAACGGAAAG

[0060] CCAAATTACCTGAACTGCTATGTATCTGGGTTCCATCCGCCCCAGATTGAAATTGATTT

[0061] GCTGAAAAACGGGGAGAAGATGAACGCGGAGCAGTCAGACCTGTCTTTCAGCAAGGA

[0062] CTGGTCTTTCTACCTTCTGGTCCACACTGAGTTCACTCCTAACGCTGTGGATCAGTATA

[0063] GCTGCCGCGTGAAGCACGTGACTCTCGATAAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACCAC。

[0064] Linker：(G4S)3序列：(SEQ ID NO.9)

[0065] GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG。

[0066] 表2SLA‑I复合体构建的相关引物

[0067]

[0068] 加粗字母表示限制性内切酶位点，划线部分代表Linker(G4S)3序列。

[0069] 2.利用SLA‑I复合体体外检测和筛选与SLA‑1*04:01:01分子特异性结合的候选九聚肽

[0070] 当SLA I类分子抗原肽结合槽结合特异的多肽表位后，空间构象会发生变化从而形成一个异三聚体，单克隆抗体PT85A正好可以识别这种构象表位。PT85A单抗(Monoclonal Antibody Center,Washington State University,United States)研制于华盛顿大学，可识别迄今发现的所有的SLA  I类分子，包括近交和远交猪群(Mosaad  et  al.,Identification of monoclonal antibody reagents for use in the study of the immune response to infectious agents in camel and water buffalo,2006)。利用该单抗建立一种ELISA方法检测复性蛋白，分析候选T细胞表位与SLA‑1*04:01:01分子结合的特异性，

[0071] 具体如下：采用2D‑Quant Kit蛋白定量试剂盒对复性的蛋白进行浓度测定。取Nickel包被的ELISA板，每孔加7.2μg的复性蛋白，用PBS补足100μl/孔，室温孵育过夜，使携带His标签的pET‑SLA‑1*040101‑β2m和27个pET‑epitope‑SLA‑1*040101‑β2m重组蛋白分别与Nickel充分结合，然后用PBST(200μl/孔)洗涤3次，加100μl单抗PT85A(1％ BSA 1:200稀释)，37℃孵育1h，PBST(200μl/孔)洗涤3次，加100μl辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(1％ BSA 1:10000稀释)，37℃孵育1h，充分洗涤后，加入TMB底物溶液，100μl/孔，避光孵育15min，每孔加入100μl的终止液(2mol/L硫酸)，然后将酶标板置于酶标仪，测OD值(波长
450nm)。

[0072] 将pET‑SLA‑1*040101‑β2m和pET‑epitope‑SLA‑1*040101‑β2m所有的重组蛋白进行ELISA检测，每个样品重复检测3次，以不连接表位的复合体蛋白pET‑SLA‑1*040101‑β2m的OD值作为阴性对照，将OD值(pET‑epitope‑SLA‑1*040101‑β2m复合体)/OD值(pET‑SLA‑1*040101‑β2m复合体)≥2.0判定为阳性，以此筛选与SLA‑1*04:01:01分子特异性结合的表位多肽。

[0073] 结果显示待检测27条候选PRRSV M蛋白九聚肽中，M27(TWKFITSRC)、M39(NHAFVVRRP)和M49(GRKAVKQGV)多肽与SLA‑1*04:01:01分子形成的复合体，ELISA检测后的相对OD值>2.0，表明这3条多肽可判定为SLA‑1*04:01:01高亲和力结合肽(图3)。

[0074] 2.利用细胞计数试剂盒‑8(Cell Counting Kit‑8，CCK‑8)鉴定SLA‑1*04:01:01限制性PRRSV M蛋白T细胞九聚肽表位

[0075] 2.1SPF长白猪纯合型SLA单倍型仔猪的筛选

[0076] 无菌采集不同SPF长白猪的外周血放入肝素钠抗凝管中，编号，利用猪外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)按照说明书分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，提取RNA，反转录为cDNA，以此为模板，PCR扩增SLA‑1、SLA‑2和SLA‑3的CDS全长序列，引物见表3。对PCR产物进行测序，选取单峰序列分别与IPD‑MHC数据库中(https://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/group/SLA/)提交的SLA‑1、SLA‑2和SLA‑3不同等位基因序列进行比对，筛选纯合的SLA Hp‑4.0(SLA‑1*04:01:01‑SLA‑3*04:01‑SLA‑2*04:01)和不含SLA‑1*04:01:01的Hp‑26.0(SLA‑1*08:11‑SLA‑3*05:02‑SLA‑2*10:06))单倍型仔猪(Gao,C.,et al,.Swine Leukocyte Antigen Diversity in Canadian Specific Pathogen‑Free Yorkshire and Landrace Pigs,2017)。

[0077] 表3SLA I类基因特异性引物信息

[0078]

[0079] 2.2CCK‑8方法鉴定能够刺激T淋巴细胞产生增殖反应的SLA‑1*04:01:01限制性PRRSV M蛋白T细胞九聚肽表位

[0080] 将筛选的SLA Hp‑4.0和Hp‑26.0纯合仔猪各6头分别随机分成正常组(3头)和免疫组(3头)，免疫组接种HuN4‑F112疫苗株(高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗)，剂量为3×4.5
10 TCID50，正常组PBS做对照，接种后严格饲养管理，在接种后第17天(DPI)采血分离PBMCs作为效应细胞，将合成的27个肽段分成6组(表4)进行刺激，利用CCK‑8试剂盒(产品编号：
5
C0038)按说明书检测T淋巴细胞增殖反应，具体如下：PBMCs按照每孔10个细胞铺96孔板孵育过夜，用6组肽段刺激细胞，以终浓度10μg/ml(最终的体积×终浓度就是加入的肽段的量，但需保证终浓度是10μg/ml)的植物凝集素(PHA)刺激细胞作为阳性对照孔，以ddH2O或DMSO处理作为阴性对照孔，每个样品做3个重复。刺激细胞72h后，每孔加入10μL CCK‑8，再培育5h，取出用全自动酶标仪测定450nm吸光度值(OD值)。免疫组或正常组的刺激指数＝肽段刺激细胞孔的平均OD值/阴性对照孔的平均OD值。根据第一次分组结果筛选出多肽，将筛选的多肽单独刺激PBMCs，以终浓度10μg/ml的单独肽段刺激，利用CCK‑8试剂盒按说明书再次检测T淋巴细胞增殖反应。

[0081] 结果显示，对于SLA Hp‑4.0单倍型仔猪，Group 4、Group 5和Group 6肽段分别刺激PBMCs后，免疫组的刺激指数明显高于对照组，SLA Hp‑26.0仔猪无明显变化(图4)。随后用Group 4、Group 5和Group 6的每个单独肽段分别刺激SLA Hp‑4.0单倍型PBMCs，结果显示，M27、M39和M49的刺激指数明显高于对照组，Hp‑26.0仔猪仍然无明显变化(图5)[0082] 表4 27个候选表位多肽的分组情况

[0083]分组 多肽
Group 1 M1,M2,M6,M8,M9
Group 2 M3,M4,M5,M7,M10
Group 3 M13,M14,M15,M26,M31
Group 4 M16,M17,M22,M23,M27
Group 5 M39,M44,M45,M46,M49
Group 6 M33,M34

[0084] 3.固相酶联免疫斑点实验(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)方法鉴定SLA‑1*04:01:01限制性PRRSV M蛋白T细胞九聚肽表位

[0085] 采用商品化IFNγELISPOT(R&D Systems,USA)对候选PRRSV M蛋白九聚肽表位诱+导CD8T细胞分泌IFNγ的能力进行测定，利用IFNγ作为检测目标检测鉴定得到的SLA‑1*+
04:01:01限制的PRRSV M蛋白九聚肽对接种PRRSV仔猪CD8 T细胞的特异性刺激作用，具体方法为：取试剂盒中提供的预包被IFNγ单克隆抗体的96孔板，每孔中加入200μl无菌培养
5
基，室温孵育20min，弃液；每孔加入2.5×10个免疫组或正常组PBMCs铺板，分别用6组肽段(终浓度10μg/ml)进行刺激，孵育过夜，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照孔加入PHA(终浓度10μg/ml)，阴性对照孔加入ddH2O或DMSO；Wash Buffer清洗后加入100μl的Detection Antibody，4℃避光孵育过夜；Wash Buffer清洗后加入100μl的Streptavidin‑AP，室温孵育2h，Wash Buffer清洗后加入100μl的BCIP/NBT Chromogen显色剂，室温避光孵育1h，用去离子水洗涤，自然晾干，在酶联斑点图像分析系统自动读板仪上计数IFNγ斑点形成细胞数。斑点形成细胞数(SFC)＝肽段刺激的实验孔平均斑点数‑阴性对照孔平均斑点
6
数。数据最终以SFCs/10细胞表示。

[0086] ELISPOT结果显示，肽段分6组时，仅Group 4和Group 5肽段分别刺激SLA Hp‑4.0单倍型PBMCs后，免疫组ELISPOT板上显现出的平均斑点形成细胞数极显著高于其它组(p<0.01)，Hp‑26.0仔猪无明显变化(图6),随后用Group 4和Group 5的单独肽段分别刺激SLA Hp‑4.0单倍型PBMCs，结果显示，M27、M39和M49在ELISPOT板上显现出的平均斑点形成细胞数显著高于其它组(p<0.05)，Hp‑26.0仔猪仍然无明显变化(图7)。表明九聚肽表位M27、M39和M49在感染PRRSV猪中可诱导强烈的CTL应答。因此，确定3条九聚肽均为SLA‑1*04:01:01限制的PRRSV M蛋白T细胞表位。

[0087] 实施例3.利用SLA‑1*04:01:01限制性PRRSV M蛋白T细胞九聚肽表位

[0088] 1.制备疫苗的方法：将编码M27、M39和M49表位的核苷酸序列用柔性连接子(编码氨基酸GGGGS的核苷酸序列)串联，3′末端添加编码组氨酸标签(His)的核苷酸序列和终止密码子(TAA)，委托北京六合华大基因科技有限公司合成片段，利用酶切位点将上述片段与真核表达载体pcaggs连接，转化至大肠杆菌构建获得重组表达质粒pcaggs‑M27‑M39‑M49，随后将质粒转染至Expi293·F悬浮细胞表达系统，收集上清经镍柱纯化获得九聚肽表位串联多肽，将多肽用弗氏佐剂进行乳化制备获得表位多肽疫苗。

[0089] 2.SLA‑1*04:01:01限制性PRRSV M蛋白T细胞九聚肽表位对PRRSV免疫保护效果的评价

[0090] 将18头1月龄纯合SLA Hp‑4.0单倍型SPF大白猪随机分为4组：多肽免疫组(5头)(Group 1)、商品疫苗免疫组(5头)(Group 2)、攻毒对照组(5头)(Group 3)和空白对照组(3头)(Group 4)，屏障环境饲养3d，每日测1次体温。3d后，多肽免疫组经颈部肌注免疫经弗氏佐剂乳化的M27、M39和M49等量混合多肽，剂量为每头900μg，2周后二免，途径及剂量与一免相同；在一免当天对商品疫苗免疫组经颈部肌注免疫2mL HP‑PRRSV活疫苗(HuN4‑F112株)5
(10TCID50/头)。在一免后28d，多肽免疫组、商品疫苗免疫组和攻毒对照组各猪经颈部肌注
5
2mL 10TCID50/头的HuN4。空白对照组采用同样方式和剂量的DMEM处理。免疫后，每天观察猪的临床症状，每周采血。攻毒后每天观察各组猪的精神、饮水、采食、粪便和发病情况，记录临床症状，测量温度；攻毒后0d、7d、10d、14d、18d采血，分离血清，ELISA方法检测PRRSV特异性抗体，利用荧光定量PCR方法检测病毒血症；攻毒后18d对存活猪实施安乐死并剖检，观察组织病变，并利用荧光定量PCR方法检测组织/脏器中的病毒载量。

[0091] 结果如下：

[0092] (1)免疫后和攻毒后各组仔猪临床症状观察

[0093] 免疫后，4组仔猪均无PRRS临床症状。HuN4攻毒后，多肽免疫组和商品疫苗免疫组的仔猪体温正常，并未观察到明显的临床症状，与空白对照组相同，生理机能表现正常。攻毒对照组在攻毒后第1d即出现发热症状(≥40.5℃)(图8)，攻毒后3～4d出现不同的临床症状如呼吸困难、厌食、精神沉郁等，随着病情发展腹部、耳朵和后肢皮肤出现明显的出血现象，在攻毒后第10d 5头猪全部死亡。

[0094] (2)免疫后和攻毒后各组仔猪抗体水平变化

[0095] 免疫后14d，多肽免疫组和商品疫苗免疫组PRRSV抗体全部转阳，抗体保持高水平一直持续到实验结束；攻毒后7d，攻毒对照组仔猪转阳，空白对照组仔猪抗体一直为阴性(图9和表5所示)。

[0096] 表5免疫后和攻毒后各组仔猪PRRSV抗体变化水平

[0097]

[0098] (3)攻毒后各组仔猪病毒血症及组织病毒载量

[0099] 攻毒后7d，攻毒对照组、多肽免疫组和商品疫苗免疫组仔猪的病毒血症达到高峰，但多肽免疫组和商品疫苗免疫组水平相近，均显著低于攻毒对照组，随后逐渐降低，空白对照组检测均为阴性(图10和表6所示)。组织中载毒量显示，攻毒对照组中所有猪在心、肝、脾、肺、肾、颌下淋巴结和腹股沟淋巴结中均检测到了PRRSV，多肽免疫组和商品疫苗免疫组1/5检测出PRRSV，空白对照组检测均为阴性(表7所示)。

[0100] 表6攻毒后各组仔猪病毒血症变化水平

[0101]

[0102] 表7攻毒后PRRSV在各组仔猪组织中的检测结果

[0103]

[0104] (4)攻毒后各组仔猪病理剖检结果

[0105] 攻毒后，眼观攻毒对照组肺脏明显肿大，有出血点，颌下淋巴结和腹股沟淋巴结肿大出血，，而多肽免疫组和商品疫苗免疫组基本正常，无明显的病理变化。病理切片观察显示，攻毒对照组重度间质性肺炎，颌下淋巴结淋巴细胞大量坏死，多肽免疫组和商品疫苗免疫组呈轻‑中度间质性肺炎，颌下淋巴结淋巴细胞减少，少量淋巴细胞坏死，空白对照组无明显变化。

[0106] 综上结果，三种SLA‑1*04:01:01限制性PRRSV M蛋白T细胞九聚肽表位和商品化疫苗一样，可以诱导SLA Hp‑4.0单倍型仔猪产生良好的抗体，可有效降低病毒在猪血液和各组织中的载量，减轻病毒造成的病理损伤，对PRRSV感染可以提供较好的保护。

[0107] 由于SLA‑1*04:01:01是不同品种猪中普遍存在的SLA等位基因位点，因此鉴定出由SLA‑1*04:01:01限制的PRRSV M蛋白的T细胞表位，不仅在揭示PRRS发病机理方面具有重要的理论意义，而且可以为设计我国猪群更为特异的有效的新型PRRSV多肽疫苗提供可靠的实验依据，本发明建立的鉴定表位肽的方法，可用于鉴定其它病毒的T细胞表位，在表位肽疫苗的开发利用中由良好的应用前景。

[0108] 三种PRRSV M蛋白SLA‑1*04:01:01限制性T细胞表位的多肽序列M27、M39和M49：

[0109] M27：TWKFITSRC(SEQ ID NO.1)；

[0110] M39：NHAFVVRRP(SEQ ID NO.2)；

[0111] M49：GRKAVKQGV(SEQ ID NO.3)。

[0112] 三种编码PRRSV M蛋白SLA‑1*04:01:01限制性T细胞表位多肽的核苷酸序列M‑N27、M‑N39和M‑N49：

[0113] M‑27：ACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGC(SEQ ID NO.4)；

[0114] M‑39：AACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCC(SEQ ID NO.5)；

[0115] M‑49：GGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTG(SEQ ID NO.6)。