[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测嗜肺军团菌IgM抗体的酶结合物稀释液、检测试剂。

[0002] 嗜肺军团菌(LegionellaPneumophila)是专性需氧的细胞内寄生菌，普遍存在于天然淡水和人工水域环境，主要寄生在原核生物如阿米巴虫、四膜虫的细胞体内，目前发现有15个血清型，可通过饮用水系统、空调冷却水、淋浴喷头水等与人群密切接触水体以气溶胶的形式经呼吸道传播给人。

[0003] 临床上军团菌感染的主要症状有肺炎和庞提阿克热(Pontiacfever)。肺炎常表现为重症，伴多系统损害，住院患者近50％需入住ICU，病死率达5％‑30％。庞提阿克热病情较轻，主要为发热、头痛和肌肉疼痛等，无肺部炎症，与流感症状相似。嗜肺军团菌对β内酰胺类经验性治疗无效。嗜肺军团菌检测方法包括：血清特异性抗体检测、尿抗原检测、核酸检测、分离培养、下呼吸道标本抗原检测。其中分离培养阳性、尿抗原阳性、急性期和恢复期双份血清抗体4倍及以上变化可作为病原学确诊依据，核酸或单份血IgM抗体阳性诊断具有重要参考意义。

[0004] 使用检测系统进行样本检测时不可避免存在随机误差和系统误差，若抗原和抗体反应不充分就易受这些干扰因素影响造成精密性变差，

[0031] 本发明提供了一种用于检测嗜肺军团菌IgM抗体的酶结合物稀释液、检测试剂。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0032] 本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

[0033] 本发明提供一种用于检测嗜肺军团菌IgM抗体的酶结合物稀释液、检测试剂，其中，所述检测试剂包括酶结合物、磁微粒混悬液、嗜肺军团菌抗原溶液、样品稀释液和阴阳性对照。

[0034] 所述酶结合物稀释液选自如下配方之一：

[0035] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0036] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+3MNaCl，pH7.45；

[0037] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0038] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+4MNaCl，pH7.45；

[0039] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0040] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+5MNaCl，pH7.45；

[0041] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0042] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+2MKCl，pH7.45；

[0043] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0044] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+3MKCl，pH7.45。

[0045] 在制备上述酶结合物稀释液时，先将casein溶解，然后再添加NaCl或KCl，否则casein难溶，其他组分的添加顺序没有特殊限制。

[0046] 所述磁珠混悬液包括磁珠、鼠抗人IgM和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包括如下组分：

[0047] 0.02MPBS+1％酪蛋白+0.1％ADP+5％甘油+0.3％P300。

[0048] 所述嗜肺军团菌抗原溶液包括嗜肺军团菌抗原和抗原稀释液，所述抗原稀释液包括如下组分：

[0049] 0.02MPBS+3％BSA+1.5％蔗糖+0.1％ADP+0.2％Bro+0.1％P300。

[0050] 所述嗜肺军团菌抗原为嗜肺军团菌脂多糖抗原。本发明具体实施例中，所述嗜肺军团菌脂多糖抗原的制备方法如下：将嗜肺军团菌抗原原液(嗜肺军团菌菌液)和溶菌酶按照1:1的体积比混合，震荡混匀，室温5min后，12000rpm离心5min，取其上清分装500ul/支，获得嗜肺军团菌脂多糖抗原。

[0051] 嗜肺军团菌是革兰氏阴性菌，具有三层膜结构。肽聚糖薄层，比革兰氏阳性菌要薄得多，外层膜(outermembrane)，是在肽聚糖层之外的膜，内含有脂多糖。脂多糖是嗜肺军团菌的主要免疫应答抗原。

[0052] 溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N‑乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N‑乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β‑1.4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(由4个氨基酸残基)组成，NAM与NAG通过β‑1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D‑乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。使用溶菌酶处理革兰氏阴性菌能够破坏膜结构使嗜肺军团菌释放更多脂多糖。

[0053] 所述样本稀释液包括如下组分：

[0054] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+1％EDTA‑2Na+2万单位/L尿激酶+0.1％T20

[0055] +0.5％CHAPS+0.2％叠氮化钠(10％)+0.1％P300+0.002％日落黄色素+0.0019％柠檬黄色素。

[0056] 所述检测试剂还包括阳性对照和/阴性对照，其中：

[0057] 所述阳性对照包括：含有人嗜肺军团菌IgM抗体阳性血清或血浆以及阳性对照稀释液；所述阳性对照稀释液组成如下：

[0058] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+1％阴性血清+1％EDTA‑2Na+0.2％叠氮化钠+0.1％P300+0.006％胭脂红色素；

[0059] 阴性对照包括：0.05MTris‑HCl+1％BSA+1％EDTA‑2Na+0.2％叠氮化钠(10％)+0.1％P300+0.005％果绿。

[0060] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0061] 实施例1

[0062] 一、实验原理：本产品采用捕获法原理进行检测，用抗人IgM抗体包被磁微粒，嗜肺军团菌抗原制备抗原溶液，辣根过氧化物酶标记嗜肺军团菌抗体制备酶结合物，通过免疫反应形成固相二抗‑IgM抗体‑抗原‑酶标抗体复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与嗜肺军团菌IgM抗体的含量成正比。

[0063] 二、试剂盒组成成分

[0064] 表1

[0065]

[0066] 三、各组分的配制

[0067] 1.磁珠制备(以制备240ml磁微粒混悬液为例)

[0068] 1.1活化前洗涤：将相关技术人员提供的2.4ml羧基磁微粒工作液放置在磁架上分离至上清澄清，弃去上清；量筒精确量取24ml缓冲液A加入反应容器内，手工缓慢摇匀反应容器内的磁微粒，置摇床上200r/min混匀5min，一次洗涤结束。再重复洗涤4次，最终将反应容器放置磁架分离至上清澄清，弃去上清。

[0069] 1.2活化：先加入4ml20mg/mlEDC溶液(用缓冲液B溶解，5min内有效)，再加入4ml20mg/mlNHS溶液(用缓冲液B溶解，5min内有效)，盖紧瓶盖/容器封口，室温条件下置摇床上200r/min反应1h。

[0070] 1.3活化后洗涤：将反应容器放置在磁架上分离至上清澄清，弃去上清；量筒精确量取24ml缓冲液B加入反应容器内，手工缓慢摇匀反应容器内的磁微粒，置摇床上200r/min混匀5min，一次洗涤结束。再重复洗涤2次，最终将反应容器放置磁架分离至上清澄清，弃去上清。

[0071] 1.4包被：先加入相关技术人员指定量的缓冲液B液，手工缓慢摇匀反应容器内的磁微粒，再加入指定量的磁微粒LP‑IgM包被抗体，液体体积共计8ml。盖紧瓶盖/容器封器，室温条件下置摇床上200r/min反应2h。

[0072] 1.5封闭：反应结束后，将反应容器放置磁架分离至上清澄清，弃去上清。量筒精确量取24ml封保液加入反应容器内；手工缓慢摇匀反应容器内的磁微粒，置摇床上200r/min混匀10min，一次封闭结束。再重复封闭4次，最终将反应容器放置磁架分离至上清澄清，弃去上清。

[0073] 1.6制备后储存：准确量取磁微粒封保液240ml，多次使用磁微粒封保液将反应容器内残留磁珠转移至储存容器，置摇床上200r/min混匀5min，盖紧瓶盖/容器封口，贴上标示签，然后置于2～8℃贮存。磁微粒混悬液制备完毕。

[0074] 2.酶结合物稀释液的制备

[0075] 2.1配方一(对照1)：

[0076] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0077] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素，pH7.45；

[0078] 2.2配方二：

[0079] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0080] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+3MNaCl，pH7.45(casein溶解之后再加NaCl，否则casein难溶)；

[0081] 2.3配方三：

[0082] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0083] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+4MNaCl，pH7.45(casein溶解之后再加NaCl，否则casein难溶)；

[0084] 2.4配方四：

[0085] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0086] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+5MNaCl，pH7.45(casein溶解之后再加NaCl，否则casein难溶)；

[0087] 2.5配方五：

[0088] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0089] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+2MKCl，pH7.45(casein溶解之后再加KCl，否则casein难溶)；

[0090] 2.6配方六：

[0091] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0092] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+3MKCl，pH7.45(casein溶解之后再加KCl，否则casein难溶)；

[0093] 2.7配方七(对照2)：

[0094] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0095] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+0.1MNa2CO3，pH7.45；

[0096] 2.7配方八(对照3)：

[0097] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0098] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+0.5MNa2CO3，pPH7.45；

[0099] 2.7配方九(对照4)：

[0100] 0.05MTris‑HCl+1％BSA+0.2％casein+0.01％CaCl2+0.1％ADP+0.2％Bro[0101] +0.1％P300+0.01％胭脂红色素+1MNa2CO3，pH7.45；

[0102] 将辣根过氧化物酶标记后的嗜肺军团菌鼠源单克隆抗体按1/4000加入到上面四种酶结合物稀释液配方中。

[0103] 3.抗原溶液制备

[0104] 3.1容器准备

[0105] 配制前需准备配制磁微粒嗜肺军团菌抗原所需的容器具。

[0106] 3.2缓冲液配制：

[0107] 3.2.1缓冲液标准配方及原料要求：

[0108] 表2

[0109]

[0110] 3.3配置程序

[0111] 3.3.1根据需要确定PBS配制体积，并按配方备注计算出缓冲液的总质量。

[0112] 按标准配方计算出各种原料的用量；

[0113] 3.3.2在容器中加入所需量的纯化水，再加入所需量的NaCl、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O，充分搅拌溶解；

[0114] 3.3.3测定溶液的pH值，记录溶液的pH值(PH＝7.6±0.1)；

[0115] 3.4溶菌酶溶液配制：

[0116] 3.4.1配制程序：称取10mg溶菌酶，加入1mlPBS进行溶解，配置成10mg/ml溶菌酶溶液，充分混匀，备用。

[0117] 3.5抗原处理过程：

[0118] 3.5.1抗原原液(嗜肺军团菌的菌液)和溶菌酶1:1体积比混合，震荡混匀，室温5min后，12000rpm离心5min，取其上清分装500ul/支，作为抗原。

[0119] 表3

[0120]

[0121] 抗原按1/1000效价将处理后的抗原加入到抗原稀释液中配置成抗原溶液。

[0122] 按照表1配方制备样品稀释液、阴性对照和阳性对照。其中，按照1/100效价将含有人嗜肺军团菌IgM抗体阳性血清或血浆加入到阳性对照稀释液中配置成阳性对照。

[0123] 四、实验所用全自动仪器

[0124] AutoLumoA2000Plus

[0125] 五、测试步骤

[0126] 准备测试样本(阴阳性对照或待测样本)并正确放置后，点击启动按钮进行定Cutoff值程序或样本检测程序，仪器将执行以下操作：

[0127] (1)将样本架传送到吸样位，将反应容器加载到加样位。

[0128] (2)执行定Cutoff值程序时，完成100μL阴阳性对照、20μL磁微粒混悬液的分注。

[0129] (3)执行样本检测程序时，完成10μL样本、20μL磁微粒混悬液、100μL样品稀释液的分注。

[0130] (4)对反应液进行混匀、温育，温育温度为37℃，温育时间为15分钟。

[0131] (5)温育完成后，使用清洗液对反应液进行清洗分离。

[0132] (6)完成50μL酶结合物、50μL抗原溶液的分注。

[0133] (7)对反应液进行混匀、温育，温育温度为37℃，温育时间为17分钟。

[0134] (8)温育完成后，使用清洗液对反应液进行清洗分离。

[0135] (9)完成50μL底物A液和50μL底物B液的分注。

[0136] (10)对反应液进行混匀，检测发光强度。

[0137] 六、实验结果

[0138] 表4酶结合物稀释液中添加不同浓度的NaCl对试剂盒精密度的影响

[0139]

[0140] 备注：NaCl在2‑8℃水溶液中溶解度为6M。

[0141] 结果分析：随着氯化钠摩尔浓度升高样本发光值也随着升高，在4M时达到平台期，相对应精密性也最好，说明氯化钠能明显增强抗原抗体反应速率，提高检测的精密度。

[0142] 表5酶结合物稀释液中添加不同浓度的KCl对试剂盒精密度的影响

[0143]

[0144]

[0145] 备注：KCl在2‑8℃水溶液中溶解度为4M；其中，2M/对照、3M/对照和4M/对照为对应五组数据的平均值与对照平均值的比值。

[0146] 结果分析：随着氯化钾摩尔浓度升高样本发光值也随着升高，在4M时达到平台期，相对应精密性也最好，说明氯化钾能明显增强抗原抗体反应速率，提高精密度。

[0147] 表6酶结合物稀释液中添加不同浓度的Na2CO3对试剂盒精密度的影响

[0148]

[0149] 备注：Na2CO3在2‑8℃水溶液中溶解度为1M；

[0150] 结果分析：酶结合物稀释液中添加碳酸钠对抗原抗体发光值影响很小，不能提高精密性。

[0151] 从以上数据分析可以发现，本发明在酶结合物稀释液中添加2～5M的氯化盐(KCl或NaCl)能够提高嗜肺军团菌脂多糖抗原抗体反应性，从而提高精密性。

[0152] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。