[0001] 本发明涉及食品发酵领域，更具体的说是涉及融合魏斯氏菌及其在改善青方微生物结构和风味中的应用。

[0002] 腐乳是采用大豆为原料，经过天然固态发酵而生产的调味品，根据生产工艺不同，可分为红方、青方和白方三种类型，其中以青方腐乳的风味最具特色，闻起来臭，吃起来香，因此民间也称其为臭豆腐。除了具有强烈臭味和豆制品醇厚的风味特征外，青方腐乳还富含异黄酮醇、维生素B12及氨基酸等营养物质，具有抗氧化、降血压、降胆固醇及减少骨质流失等作用。

[0003] 风味是评价发酵食品感官品质的重要指标，风味的形成与微生物之间关系密切。从本质上讲，青方风味的形成受发酵过程中微生物群落的严格调控，而异常风味是最常见的青方质量问题。与传统的自然发酵工艺相比，基于微生物调控手段的现代化发酵技术可以精准地控制青方发酵过程，这对于提升产品质量与安全性具有重要意义。然而，优质发酵剂的缺失是制约产品工业化进程的突出瓶颈。因此，如何提供一种可用于青方发酵的微生物成为本领域亟待解决的技术问题。

[0044] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0045] 实施例

[0046] 1.制备青方腐乳

[0047] 青方腐乳的发酵分为豆腐坯的前期发酵和添加盐卤水的后期发酵，本实施例使用的豆腐坯(新鲜豆腐喷洒毛霉和根霉的混合悬浮液，放在无菌木托盘上，置于28℃发酵室中发酵7天后，撒盐干腌1天，豆腐坯与盐的比例为10:1；然后浸泡在20％盐水中，制成盐分浓度达到12％‑14％新鲜的盐坯)和发酵汤汁(盐水和黄浆水的混合物，其中，黄浆水为豆腐生6
产副产物)均在当地工厂制备和收集，将魏斯氏菌(Weissella confusa)M1以1×10CFU/ml的浓度接种于发酵汤汁中，将盐坯置于350mL玻璃罐中，装入接种有M1的发酵汤汁，盐坯与发酵汤汁质量比7:3，作为魏斯氏菌M1组(Add Weissella confusa M1，简称M)，罐子密封后在28℃进行后期发酵28d；相同条件下制备自然发酵的青方作为对照组(Natural，简称N)，除不添加M1外，其他条件均与魏斯氏菌M1组相同。在发酵的第0、7、14、21和28天取青方并将其研磨，样品在分析前存储在‑80℃。

[0048] 2.理化性质的检测

[0049] 2.1酸碱度的测量

[0050] 根据制造商的说明，使用数字酸度计(中国上海佑科仪器仪表有限公司3C酸度计)测量样品的酸碱度。结果如图1A所示，对照组(N)与魏斯氏菌M1组(M)的pH随发酵时间延长而上升。

[0051] 2.2盐含量的测量

[0052] 根据中国国家食品标准食品中氯化物的测定(GB 5009.44‑2016)中的硝酸银滴定法分析盐含量。结果如图1B所示，对照组(N)与魏斯氏菌M1组(M)的盐含量随发酵时间延长而上升。

[0053] 2.3氨基酸氮(AAN)、TCA可溶性肽含量及蛋白酶活力的测定

[0054] 氨基酸态氮的测定：将样品与水溶解后采用用氢氧化钠标准溶液滴定测定。

[0055] 可溶性肽的测定：将样品与5％的TCA溶液混合，匀浆1min，冰浴1h，冰浴后4℃离心5min，取上清液在680nm处测定吸光度。

[0056] 蛋白酶活力的测定：将青方样品与0.1M Tris‑HCl缓冲溶液混合并静置30min以获得酶提取液。经2％酪蛋白溶液和酶提取液加入试管混匀，在40℃水浴锅中孵育10min，立即与0.4M TCA溶液混合，终止水解反应，然后在1914g离心10min。取上清液与0.4M碳酸钠和福林酚试剂在40℃反应20min，在680nm处测量吸光度。蛋白酶活性用上清液中的酪氨酸当量表示。

[0057] 氨基酸态氮、TCA可溶性肽和蛋白酶反映了发酵食品的发酵程度及味觉特性，对于发酵食品品质非常重要。整体上，所有样品中蛋白酶活力、TCA可溶性肽和氨基酸态氮浓度呈显著上升的趋势(图1C、1D、1E)，表明大豆蛋白在微生物作用下分解成氨基酸。其中，M组在发酵28d时，蛋白酶活力、TCA可溶性肽和氨基酸态氮都显著高于对照组(P＜0.01；P＜0.05；P＜0.05)，说明M1促进了发酵进程，产生更多的氨基酸，使青方腐乳的滋味更加鲜美。

[0058] 2.4色度评价

[0059] 使用色差仪CR‑400(柯尼卡美能达，中国上海)评估颜色变化，并记录亮度值(Δ2 2
L*)、红色值(Δa*)和黄色值(Δb*)。采用欧几里得距离公式(ΔE*＝√(ΔL*) +(Δa*) +
2
(Δb*))评价发酵过程中的色差。青方腐乳在不同发酵时间下的颜色变化见表1。

[0060] 表1

[0061]

[0062] 注：n＝3，不同标记字母即为差异显著(P<0.05)

[0063] 整体上，青方腐乳在发酵过程的总色差(ΔE*)是呈下降趋势的。随发酵的进行，青方腐乳的a*值呈下降趋势(绿色加深)，其中M组从14d开始a*值显著低于对照组(P＜0.01)，这表明M1在一定程度上加快了发酵进程(图1F、1H)。

[0064] 2.5感官评价

[0065] 选择10名已接受感官评估定期培训小组成员(五名男性，五名女性；平均年龄27岁)，对青方的外观颜色、香味、口感(质地)、口味及整体感官进行评价。通过最终得分的平均值评价青方的风味特征。结果如图1G所示，表明添加M1的青方品质要优于对照组。

[0066] 3.氨基酸的测定

[0067] 3.1氨基酸的提取

[0068] 精确称取适量样本于2ml EP管中，准确加入600μL 10％甲酸甲醇溶液‑H2O(1:1.V/V)溶液，加入2颗钢珠，涡旋振荡30s；放入组织研磨器中，60Hz研磨90s；12000rpm 4℃离心5min，取上清液10μL，加入990μL 10％甲酸甲醇‑H2O(1:1.V/V)溶液，涡旋振荡30s，取稀释后的样本100μL，加入浓度为1000ppb的同位素内标100μL涡旋振荡30s，上清液过0.22μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中。

[0069] 3.2LC‑MS检测

[0070] 通过Waters UPLC液相仪(WatersACQUITYUPLC)与AB4000三重四极杆质谱仪(AB5000)进行分析。采用ACQUITYUPLC BEHC18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm，美国Waters公司)，进样量5μL，柱温40℃，流动相A‑10％甲醇水(含0.1％甲酸)，B‑50％甲醇水(含0.1％甲酸)。梯度洗脱条件为0～6.5min，10～30％B；6.5～7min，30～100％B；7～14min，100％B；14～17.5min，100～10％B。流速0～8.0min，0.3ml/min；8.0～17.5min，0.4ml/min。质谱条件：电喷雾电离(ESI)源，正离子电离模式。离子源温度500℃，离子源电压5500V，碰撞气6psi，气帘气30psi，雾化气和辅助气均为50psi。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。氨基酸的浓度根据建立标准曲线确定。

[0071] 3.3TAV的计算

[0072] 游离氨基酸味觉活度值的计算如下：

[0073]

[0074] 其中，C为单一化合物的浓度；threshold为单一化合物相应的味觉阈值。

[0075] 氨基酸含量是青方发酵中的关键指标。如图2所示，两组共检测出21种氨基酸，其中包括16种游离氨基酸。OPLS分析表明，添加M1发酵14d和28d的理化指标与对照组存在显著差异(图3A、3C)。图3B、3D表明，主成分可以解释Y变量中99.6％和100％的变异，模型的可预测性为96.1％和99.7％，表明OPLS模型建立成功，可以用来区分组间差异。其中，M组中的游离氨基酸显著含量高于对照组，且28d时含量最高(表2)。

[0076] 表2

[0077]

[0078] 注：n＝3，不同标记字母即为差异显著(P<0.05)；“*”，必需氨基酸；TAA，总游离氨基酸含量；EAA，必需氨基酸含量；DAA(鲜味氨基酸)，Glu+Asp+Gly+Ala；SAA(甜味氨基酸)，Gly+Ala+Ser+Thr+Pro+Arg；BAA(苦味氨基酸)，Lys+Met+Val+Ile+Leu+Tyr+His+Phe；sAA(咸味氨基酸)，Glu+Asp；AAA(酸味氨基酸)，Glu+Asp+His。

[0079] 根据游离氨基酸滋味特征，将其分为鲜味氨基酸(DAA)、甜味氨基酸(SAA)、苦味氨基酸(BAA)、咸味氨基酸(sAA)和酸味氨基酸(AAA)。表2结果表明，所有呈味氨基酸的含量都是随发酵时间的进行而上升。此外，TAV≥1的物质对滋味有很大的贡献，如表2所示，除精氨酸(TAV＝0)，其他游离氨基酸都具有很高的TAV值，赋予青方腐乳丰富的滋味特征。添加M1发酵结束后，青方中的呈味氨基酸皆高于对照组，特别是Asp和Glu(P＜0.05)，强化了青方的鲜味。

[0080] 4.青方腐乳中微生物群落的宏基因组测序

[0081] 4.1宏基因组DNA提取和鸟枪法测序

[0082] 使用OMEGA土壤DNA试剂盒(D5625‑01)，按照制造商的说明提取各样品总微生物基因组DNA，并在‑20℃下储存，然后进行进一步评估。使用NanoDrop ND‑1000分光光度计(Thermo Fisher Scientifific,Waltham,MA,USA)和琼脂糖凝胶电泳分别测量提取的DNA的数量和质量。使用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit对提取的微生物DNA进行处理，构建插入大小为400bp的宏基因组鸟枪法测序文库。每个文库均由Illumina HiSeq X‑ten平台(Illumina，美国)在上海派森诺生物技术有限公司采用PE150策略进行测序。

[0083] 4.2宏基因组分析

[0084] 处理原始测序读数以获得质量过滤的读数以供进一步分析。首先，使用Cutadapt(v1.2.1)从测序读取中删除测序适配器。其次，使用fastp中的滑动窗口算法修剪低质量读取。一旦获得质量过滤的读数，就使用Kraken2对来自RefSeq的数据库对每个样本的宏基因组测序读数进行分类分类，该数据库包括来自古生菌、细菌、病毒、真菌、原生动物、后生动物和绿色植物的基因组。删除分配给后生动物或绿色植物的读数以进行下游分析。Megahit(v1.1.2)用于使用超大型预设参数为每个样本组装。然后将生成的重叠群(长于200bp)汇集在一起，并使用带有“easy‑linclust”模式的mmseqs2进行聚类，将序列同一性阈值设置为0.95，并将较短重叠群的残基覆盖到90％。非冗余重叠群的最低共同祖先分类通过使用“分类”模式的mmseqs2将其与NCBI‑nt数据库对齐获得，并且在以下分析中删除了分配给Viridiplantae或Metazoa的重叠群。所有样本的CDS序列均由mmseqs2以“easy‑cluster”模式进行聚类，将蛋白质序列同一性阈值设置为0.90，并将较短重叠群的残基覆盖到90％。为了评估这些基因的丰度，来自每个样本的高质量读数被映射到预测的基因序列上，使用基于准映射模式的“salmon”，“‑‑meta–minScoreFraction＝0.55”，以及CPM(copyper每百万映射读数的千碱基)用于标准化宏基因组中的丰度值。非冗余基因的功能通过使用mmseqs2以“搜索”模式分别针对KEGG、EggNOG和CAZy数据库的蛋白质数据库进行注释获得。EggNOG和GO使用EggNOG‑mapper(v2)获得。GO本体使用map2slim(www.metacpan.org)获得。KO使用KOBAS获得。

[0085] 结果表明，加入M1能够增强青方中与风味相关的理化指标是由于M1驱动了发酵过程中微生物群落结构发生变化。如图4A所示，在属水平上，对照组中的微生物主要是Leuconostoc(36.04％)、Enterococcus(13.00％)、Enterobacter(5.63％)、Tetragenococcus(3.26％)及Weissella(0.77％)等。而添加M1的青方中主要的属为Leuconostoc(34.79％)、Enterococcus(10.45％)、、Enterobacter(8.66％)、Lactococcus(6.84％)及Tetragenococcus(3.57％)等。与对照组相比，添加M1的青方中Enterobacter显著上调(P＜0.01)，Weissella和Bacillus显著下调(P＜0.05)。Enterobacter、Weissella和Bacillus是豆制品和大曲在自然发酵过程的核心菌群，与多种风味物质的具有密切的关系，并且在维持群落平衡方面发挥重要作用。因此，可以推测M1的引入是造成与对照组菌群差异的重要原因。在种水平上，对照组中的微生物主要是Leuconostoc citreum(14.50％)、Enterococcus faecalis(8.68％)、Leuconostoc pseudomesenteroides(7.17％)、Leuconostoc lactis(7.79％)和Leuconostoc garlicum(4.97％)等；添加M1的青方中的优势菌为Leuconostoc citreum(11.69％)、Leuconostoc pseudomesenteroides(8.33％)、Leuconostoc lactis(7.78％)、Enterococcus faecalis(6.24％)和Lactococcus lactis(5.44％)等(图4B)。添加M1的青方中的Enterococcus faecalis的丰度显著低于对照组(P＜0.05)；Enterococcus faecalis已被证实在发酵大豆时会产生大量的甲氧基‑苯基肟，是霉味的主要来源，因此，M1的引入可能会减轻青方的霉味。从真菌群落来看(图4C、4D)，添加M1的青方与对照组相似，在属水平上主要是Trichosporon(99.08％)，种水平上主要是Trichosporon asahii(99.10％)。

[0086] 图5A、5B分别是基于细菌和真菌所作出的PLS‑DA排序图，可以看出M1显著改变了细菌的组成，但对真菌组成没有影响，且在青方中只检测出7种真菌，其中Trichosporon asahii的相对丰度排在所有检测到的微生物物种的第108名，表明细菌是造成M组与对照组间的产品品质差异主要原因。

[0087] LEfSe分析同样表明M1与对照组间的物种组成存在显著差异(图6)。根据LDA分数≥2确定出了添加M1后显著变化细菌，其中包括种水平中的Enterococcus_sp_6C8_DIV0013、Shewanella_chilikensis、Tetragenococcus_osmophilus等，它们被确定为M1添加后的生物标记物(图7)。

[0088] 有趣的是，经分析发现Weissella confuse是对照组的生物标记物，并非M组。如图8可以看出Weissella  confuse与Leuconostoc  citreum和Leuconostoc 
pseudomesenteroides等既存在正相关，又存在竞争关系，可能因此影响了Weissella confuse的丰度。此外，还发现Leuconostoc citreum、Leuconostoc pseudomesenteroides和Weissella confuse又与多个物种相关，因而影响了整个菌群结构。综上，表明引入M1使青方微生物结构发生了不同于对照组的改变。

[0089] 为进一步探究M1发酵青方中微生物的动态变化，对添加M1后在不同发酵时期的微生物结构进行表征。如图9所示，第0天主要微生物为Leuconostoc lactis(13.19％)、Lactococcus lactis(10.42％)和Enterococcus faecalis(7.99％)。发酵7天后，青方的微生物结构发生了显著变化，主要是Leuconostoc citreum(23.77％)和Leuconostoc pseudomesenteroides(14.70％)，这个阶段乳酸菌丰度显著上升，这可能是由于发酵初期较高的酸性条件促进了它们的生长。但随着发酵进行，盐的渗入和厌氧环境抑制了它们的生长，因此从发酵14天开始，Leuconostoc citreum与Leuconostoc pseudomesenteroides的丰度开始逐渐下降，在发酵的第14d，这两个属的丰度分别为21.68％与14.70％；在发酵的第21d，丰度降低至14.27％与15.94％；在发酵的第28d，丰度达到最低，分别为1.70％和10.20％。图11所示韦恩图显示了M1发酵过程中的物种组成，共鉴定出了1213种微生物，包括1159种细菌，7种真菌和47种病毒。其中，整个发酵期共有的物种是394种，特有的物种分别有204种(0天)、34种(7天)、42种(14天)、88种(21天)和24种(28天)，表明随着发酵的进行，青方中物种的丰度总体上呈下降的趋势，这可能是由于随着盐渗入青方，抑制了很多物种的生长。

[0090] 3.2.2M1发酵青方中的微生物功能注释与代谢途径预测

[0091] 进一步利用KEGG数据库对M1干预下的青方中微生物功能进行注释。结果表明，在青方发酵过程中微生物参与了多种代谢与能量转换过程，其中主要以氨基酸以及碳水化合物转运和代谢为主(图12)。此外，根据LDA分数≥2确定出添加M1后显著上调的代谢通路，主要为丙氨酸‑天冬氨酸和谷氨酸代谢途径、精氨酸和鸟氨酸的代谢途径(图13)，这表明由M1驱动形成的差异微生物与游离氨基酸代谢之间有着紧密的联系。蛋白质降解和挥发性化合物的合成对提高发酵豆制品的风味和滋味至关重要，因此，根据氨基酸检测结果(图2)和KEGG注释结果对M1发酵过程中氨基酸代谢上下游关系进行预测还原，这些途径中包括了21种氨基酸的合成代谢，其中谷氨酸和天冬氨酸的合成途径最多(图14)，这也解释了M1发酵末期谷氨酸和天冬氨酸含量高的原因。谷氨酸及天冬氨酸合成途径主要包括：(1)谷氨酰胺在Escherichia coli产生的谷氨酸合成酶[EC:1.4.1.13]gltB、[EC:1.4.1.13]gltD和[EC:1.4.1.13]GLT1作用下合成谷氨酸等；(2)苯丙氨酸生成氢氰酸后在[EC:2.5.1.474.4.1.9]ATCYSC1作用下生成β‑氰基丙氨酸，又进一步在[EC:3.5.5.44.2.1.65]NIT4的作用下生成天冬酰胺，最终在[EC:3.5.1.13.4.19.5]ASRGL1作用下合成天冬氨酸。而亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)和苯丙氨酸(Phe)将会被肠杆菌、明串珠菌等微生物所产生的转氨酶和脱羧酶降解，进而产生酮类、醛类和醇类等挥发性风味物质,。

[0092] 综上可知，M1在发酵过程中形成的优势微生物与氨基酸代谢和风味形成之间密切相关。虽然真菌在发酵过程中丰度不高，但已知Trichosporon等真菌与多种风味相关。因此，将20个细菌属(图9)和8个真菌属(图10)定义为M1发酵青方中的关键微生物。

[0093] 5.青方腐乳发酵过程中挥发性风味物质的检测

[0094] 5.1挥发性代谢物的提取

[0095] 将冷冻样品研磨，称取1g与内标物(30μL40μg/ml 2‑辛醇和10μL 100μg/ml二氯苯)混合，转移至顶空瓶中震荡摇匀。采用DVB/CAR/PDMS纤维头(2cm)，40℃下孵育10min，萃取30min，在进样口中解吸5min。然后按照设定参数进行GC×GC‑TOFMS分析。

[0096] 5.2GC×GC‑TOFMS分析

[0097] 挥发性化合物用安捷伦(Santa Clara,CA)7890B气相色谱仪与LECO Pegasus 4D质谱仪进行分析。采用第一维柱DB‑WAX(30m×250μm×0.25μm)；进样温度250℃；初始温度40℃保留3min，然后以5℃/min升至250℃，保留5min；氦气(99.9999％)1.0ml/min；无分流；
二维柱DB‑17MS(2m×100μm×0.10μm)；柱温高于第一维柱5℃；调制解调器温度始终高于第二维柱5℃。质谱条件：全二维分析时调制周期6.0s；接口温度270℃；离子源温度250℃；电子轰击源70eV；检测器1680v；采集率50张/秒；质谱扫描范围33～500m/z。将鉴定的挥发性化合物与与美国国家标准与技术研究院数据库中的香气化合物进行比较，并考虑与NIST数据库相似度≥80％的挥发性化合物。挥发性化合物的浓度是根据其峰面积与内标物的峰面积之比来确定的，所有挥发性化合物对内标物的差异被标准化。每个样品测量3次，平均值计算到小数点后两位。

[0098] 如图15所示，在所有青方样品中共鉴定出了272种挥发性化合物，包括66种酯，56种醇，35种烃类，32种酮，29种醛，10种酸，10种呋喃，5种酚，以及29种其他类挥发性化合物(图16)，可以看出青方的主要挥发性化合物是酯类和醇类。酯类主要是在微生物代谢过程中由葡萄糖和氨基酸经过酶促或非酶促反应后生成醇和酸，再经酯化反应后生成，它们多呈水果香气。醇类化合物可能是由于大豆在成熟过程中碳水化合物的代谢和氨基酸脱羧及脱氢后产生，赋予青方青草味、果味和甜味。此外，还在青方中检测出很多其他类化合物，如吲哚、二甲基硫醚和二甲基三硫醚等，呈烧焦、鱼腥及硫磺等刺激性气味，是青方臭味的主要来源。它们主要来自于发酵中期甲硫氨酸和色氨酸的降解(图2)。其次，我们可以在图S15中看出自然发酵青方中(对照组)三个平行样品的风味物质波动较大，而添加M1后，各平行组间的风味物质变化差异较小，表明M1有利于维持青方发酵过程中风味的稳定性。

[0099] 如图16所示，添加M1后在28d时检测出了55种醇，65种酯，31种酮，29种醛，10种酸，9种呋喃，4种酚，34种烃类及25种其他类化合物，这8类化合物中有7类均高于对照组(除了酚类)，表明接种M1能够使青方的风味更加丰富。此外，OPLS分析表明，接种M1发酵14d和28d的青方与对照组在挥发性化合物上存在显著差异(图17A、17B)。变量重要性参数(VIP)表示每种代谢物对模型的贡献，一般将VIP≥1的挥发性化合物被选为标志性风味物质，VIP值越大的化合物对两组间风味差异的贡献就越大；在14d和28d分别有48和42个挥发性化合物的VIP值≥1(图18A、18B)，其中甲醇、4‑甲基‑4‑硝基戊酸甲酯、2‑丁醇、乙醇、4‑戊酮酸酯、二甲基三硫及乙酸乙酯的VIP值≥3，因此它们被认为是关键差异代谢物。

[0100] 5.3关键香气化合物的鉴定与筛选

[0101] 通过如下等式计算相对气味活度值来确定每种挥发性化合物对香气特征的贡献：

[0102]

[0103]

[0104] 其中，OAVi是任意挥发性化合物的气味活度值(OAV)，OAVmax是每个样品组中所有挥发性化合物中最大气味活度值；Ci是挥发性化合物的浓度；Ti是挥发性化合物的气味阈值。0.1≤ROAV＜1的化合物被认为对香气有贡献，而ROAV≥1的化合物被认为是关键香气化合物。所有的独立实验都至少进行3次。热图通过R(v3.3.2)中pheatmap程序包对数据集进行绘图。

[0105] 在添加M1的样品及其对照组中共鉴定出27种ROAV≥0.1的挥发性化合物，包括2种醇，3种酮，9种醛，6种酯和7种其他类化合物，见图19。其中，二甲基三硫醚的阈值较低，因此被认为在发酵过程中对青方风味贡献最大。它主要呈令人不快的气味，是青方臭味的主要来源。在发酵开始(0天)时，青方含有9种主要挥发性化合物(0.1≤ROAV＜1)和8种核心挥发性化合物(ROAV≥1)，它们还原了青方发酵前的香气特征，其中2‑甲基丁醛(ROAV＝100)、二甲基三硫醚(ROAV＝98.4)和2,3丁二酮(ROAV＝9.18)对其风味贡献最大，为青方提供了青草、盐腥味和黄油香气。开始发酵14天后，添加M1的青方中含有12种主要挥发性化合物和4种核心挥发性化合物，对照组中含有13种主要挥发性化合物和4种关键挥发性性化合物，此时两组之间的主要风味化合物存在差异，PCA分析也可看出两组之间的风味化合物组成存在分离趋势(PC1和PC2的累积解释量为75.45％，图20A)。到发酵终期28d时，M组含有11种主要挥发性化合物和7种核心挥发性化合物，对照组含有12种主要挥发性化合物和4种核心挥发性化合物，表明M1的引入提升了核心风味物质的种类。同时，在图20B中可以看出，在发酵的第28天，两组的风味组成在PCA得分图中有明显分离的趋势(PC1和PC2的累积解释量为96.24％)，表明在发酵末期，添加M1的青方中的核心风味物质与对照组相比存在显著差异。
具体来说，对照组中的核心化合物为二甲基三硫醚(ROAV＝100)、2‑甲基丁醛(ROAV＝
20.91)、3‑甲基丁醛(ROAV＝2.4)和丁酸甲酯(ROAV＝1.17)，它们赋予青方盐腥味、青草味和水果香气，而添加M1发酵后，青方在保留上述风味物质的基础上又增加了正己醛(ROAV＝
1.01)、3‑甲基丁酸乙酯(ROAV＝1.47)、丁酸乙酯(ROAV＝4.78)和丁酸甲酯(ROAV＝2.51)等特殊的风味物质，这些化合物又为青方添加了叶子、苹果及菠萝等令人愉悦的香气，使产品风味更加丰富和适口。

[0106] 5.4关键香气化合物的重组与缺失

[0107] 为了验证OAV分析对香气化合物的鉴定与筛选，将其结果进行重组与原始样品的香气特征进行比较。

[0108] 首先，将M组发酵28天样品进行冻干，研磨后分别使用甲醇、乙醚、二氯甲烷和戊烷进行逐步提取，经过滤干燥后得到重组基质。

[0109] 其次，将M组发酵28天ROAV≥1的7种核心风味物质以实际浓度添加到基质中得到重组模型1；同时将M组香气化合物含量最高的前五名以实际浓度添加到基质中得到重组模型2。然后，将测试样品在室温下平衡10min，对重组样品进行感官评定。

[0110] 结果表明，相比于重组模型2，重组模型1的香气特征与产品的香气特征最为接近(图21)，说明OAV分析和GC‑MS技术对核心风味物质的筛选、鉴定和定量是成功的。

[0111] 5.5遗漏测试

[0112] 使用三角形测试对重组模型1进行遗漏测试，以评估单一化合物对整个M‑28d香气特征的贡献。样本包括完整的重组样本和去除一个或一组芳香活性化合物的缺失样本，随机编号进行三角形测试。感官小组成员(10名成员)，实验重复三次。

[0113] 如表3所示，发现2个遗漏模型在香气特征上表现出极其显著差异(P≤0.001)，1个遗漏模型表现出极显著差异(P≤0.01)，其余5个遗漏模型显示出显著差异(P≤0.05)。首先，该实验显示缺失掉7种核心风味物质(模型1：二甲基三硫醚、2‑甲基丁醛、正戊醛、正己醛、3‑甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯和丁酸甲酯)导致它们的香气特征与原样品之间存在极其显著差异(P≤0.001)，表明核心风味物质对青方整体风味形成的关键作用。其次，在没有正己醛或没有二甲基三硫醚时，模型1‑3和1‑7也与原样品之间存在极显著(P≤0.01)和极其显著(P≤0.001)的差异。这也显示了正己醛和二甲基三硫醚对青方风味的巨大贡献。

[0114] 表3

[0115]

[0116] a.根据三角测试评估香味差异的10名小组成员的正确判断数

[0117] b.***(P≤0.001,极其显著)；**(P≤0.01,极显著)；*(P≤0.05,显著)

[0118] 5.6M1发酵青方中理化特性、关键菌群与风味物质之间的相关性分析

[0119] 5.6.1M1青方发酵中理化特性与关键菌群之间的相关性分析

[0120] 采用RDA分析M1发酵青方过程中理化特性与关键菌群之间的相关性。如图22所示，发现Enterobacter和Citrobacter与pH、盐含量、蛋白酶活力、TCA可溶性肽及氨基酸态氮呈正相关，尤其是Enterobacter，这表明在发酵过程中，Enterobacter在氨基酸代谢中起着至关重要的作用。此外，色差也是判断青方发酵程度的重要指标，其与Lactococcus呈强正相关，显示了其在青方发酵过程中的重要作用。综上表明，青方中的主要微生物具有其独特的生理特性，能够使发酵环境发生变化并不断适应。

[0121] 此外，M1发酵的第0d与28d的菌群比较相似，第7d、14d和21d的菌群结构较类似(图22)，与宏基因组测序结果一致。主要微生物菌属当中，Enterobacter,Enterococcus,Lactococcus,和Leuconostoc呈负相关，而与Citrobacter呈正相关，这于图5显示的结果一致。

[0122] 5.6.2M1发酵青方中游离氨基酸、关键风味化合物与关键菌群之间的相关性分析[0123] 为明确M1在青方发酵过程中如何驱动微生物的变化进而对风味产生影响，对M1发酵过程中的关键菌属(20种细菌属和8种真菌属)、16种游离氨基酸和发酵终期的20种关键风味化合物(18种ROAV≥0.1及2种高含量挥发性化合物)进行Spearman相关分析。结果表明，有23个属(19个细菌属，4个真菌属)与19种关键风味化合物和15种游离氨基酸之间存在显著相关性(|r|>0.6,P<0.05)(图23)，有20个属(17个细菌属和3个真菌属)与关键风味物质相关，18个属(14个细菌属和4个真菌属)与游离氨基酸显著相关，这表明细菌在青方发酵过程中对风味有着更多的贡献。

[0124] 其中，Lactococcus、Enterobacter和Tetragenococcus与17种关键风味物质呈显著正相关，主要包括乙酸甲酯、丁酸甲酯和苯甲醛等酯类和醛类化合物，这表明它们在青方发酵过程中主要和脂质代谢和碳水化合物代谢相关。与此一致的是，以往的研究表明Tetragenococcus表达了与脂肪酸代谢相关的乙醛脱氢酶[EC：1.2.1.10]、醇脱氢酶[EC：1.1.1.1]和支链氨基酸转氨酶[EC：2.6.1.42]，并参与醛和酮的合成，对发酵食品的风味有巨大的影响。相反，Staphylococcus和Pichia与17种关键风味化合物呈显著负相关，因此它们在风味形成的过程中可能起到直接或间接的抑制作用。

[0125] 14个细菌属和3个真菌属与青方中的游离氨基酸呈显著正相关，尤其是脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和精氨酸等甜味和苦味氨基酸与多种微生物显著相关(|r|>0.6,P<0.05)。此外，Enterobacter、Escherichia和Tetragenococcus与各种氨基酸相关，表明在发酵过程中它们更多地参与了游离氨基酸的合成和代谢，其中Enterobacter、Escherichia和Tetragenococcus与鲜味氨基酸呈显著正相关，有助于青方鲜味的形成。同样有研究表明Tetragenococcus具有与脯氨酸、谷氨酸及谷氨酰胺代谢与运输先关的基因。此外，虽然在发酵过程中检测到了可能具有潜在致病风险的Escherichia，但其在发酵过程中丰度较低，且随着时间的推移不断减少，在发酵45天以后将完全消失。并且在前面功能注释的研究中发现与人类疾病和病毒相关的基因很少被注释(图12)，表明在此发酵条件下生产的青方腐乳是安全的。

[0126] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。