[0001] 本发明总体涉及评估引物扩增效率的方法，更具体地，涉及评估用于定量PCR扩增的引物的相对或绝对效率的方法。本发明的方法基于相对于对单个靶标DNA分子测定的Ct的引物效率的评估，而不是连续稀释样本的Ct回归曲线分析。提供更简单但更可靠的确定引物效率的方法可用于多种应用，包括但不限于诊断和/或监测以特定基因序列为特征的疾病状况，以及目的特定基因区域的表征或分析，特别是监测以克隆淋巴细胞群为特征的疾病状态或以特异性V(D)J重组事件为特征(如检测白血病中的微小残留病)以及需要使用患者特异性引物的疾病状态。

[0002] 本说明书中对任何在先出版物(或源自其的信息)或已知的任何内容的引用不是并且不应被视为承认或允许或任何形式的暗示在先出版物(或源自由的信息)或已知内容形成本说明书所致力于的领域中的公知常识的一部分。

[0003] 本说明书中作者提及的出版物的书目细节在说明书末尾以字母顺序收集。

[0004] 克隆通常被理解为从普通前体细胞下降的细胞群。诊断和/或检测受试对象中细胞或生物体的克隆群体的存在通常构成了相对有问题的方法。具体地，克隆群体可以在较大的细胞或生物体群体中仅构成较小的组分。例如，就哺乳动物生物体而言，就诊断和/或检测肿瘤(如癌症)而言，更常见的情况之一是需要检测细胞克隆群体。然而，检测一个或多个克隆群体在诊断疾病如脊髓发育不良或真性红细胞增多症中以及在检测由免疫系统产生的抗原驱动的克隆中也是重要的。

[0005] 通常，其中产生克隆的群体对应于身体的特定组织或隔室中的细胞群体。然而，尽管对这样的细胞群进行采样有效地将检查缩小到细胞或生物体的亚群，但这仍为临床医生提供大的细胞或生物体的背景群，其中必须鉴定克隆群。

[0006] 如果克隆的成员的特征在于分子标记，例如改变的DNA序列，那么检测问题可能能够转化为在具有不同序列的较大分子群体中检测全部具有相同分子序列的分子群体的问题，其或者全部相同或者不同，或者在更大或更小程度上是异质的。可以实现的标记分子的检测水平非常依赖于检测方法的灵敏度和特异性，但是几乎总是，当较大分子群体中的靶分子的比例变小时，来自较大群体的信号噪声使得不可能检测来自靶分子的信号。尽管高度特异性，但在其检测方面呈现独特复杂性的一类特定分子标记是由遗传重组事件产生的标记。

[0007] 体细胞中遗传物质的重组涉及将最初分离的基因组的两个或多个区域集合在一起。它可作为随机过程发生，但也可作为正常淋巴细胞发育过程的一部分发生。

[0008] 关于癌症，重组可以是简单的或复杂的。简单的重组可以被认为是其中两个不相关的基因或区域并置在一起的重组。复合重组可以认为是其中多于两个基因或基因片段重组的重组。复杂重组的典型实例是免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)可变基因的重排，其发生在淋巴样细胞的正常发育过程中，并且其涉及V、D和J基因片段的重组。这些基因片段的基因座在种系中被广泛地分开，但是在淋巴发育期间的重组导致V、D和J基因片段，或V和J基因片段的并置，这些基因片段之间的连接区的特征在于小区域的核苷酸的插入和缺失(N1和N2区域)。过程随机发生，使得每个正常淋巴细胞携带独特的V(D)J重排，其可以是完整的VDJ重排或VJ或DJ重排，这取决于重排的基因和重排的性质。由于淋巴癌，如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，是作为单个正常细胞中肿瘤性改变的结果而发生的，所有癌细胞至少最初将携带最初存在于生成细胞中的连接V(D)J重排。亚克隆可以在肿瘤细胞群扩增过程中产生，并且在它们中可以发生进一步的V(D)J重排。

[0009] 由重组产生并存在于癌症克隆或亚克隆中的独特DNA序列提供了独特的遗传标记，其可用于监测对治疗的反应并对治疗作出决定。可以通过PCR、流式细胞术或下一代测序进行克隆的监测。通过流式细胞术的监测包括在诊断时确定癌细胞的免疫表型和在随后的样本中寻找相同的表型以检测和定量癌细胞。下一代测序是一种较新的方法，但是是一种昂贵的技术。

[0010] 基于PCR的分析由于其潜在的高水平特异性和自动化而是优选的方法。通过PCR定量通常包括使用来自诊断时采集的样本的DNA测序标记重排，患者特异性引物的合成和这些引物在PCR中对从治疗期间获得的样本提取的DNA的使用。通常，将两个引物置于重组位点的任一侧，通常下游引物针对J基因片段，而上游引物(其也称为等位基因特异性寡核苷酸[ASO])经设计以针对重排的最可变区域(Brisco等人，1991；Bruggemann等人，2004；Pongers‑Willemse等人，1999；Nakao等人，2000；van der Velden等人，2002；van der Velden等人，2004；van der Velden等人，2007；van der Velden等人，2009；van der Velden等人，2014；Verhagen等人，2000)。有时上游引物针对V基因片段，ASO引物位于下游并针对重排的最可变区域。因此，非ASO引物是共有引物，因为它针对许多不同重排共有的保守区域。

[0011] 通过PCR监测白血病中的微小残留病(minimal residual disease，“MRD”)已广泛用于临床实践。通常，通过在诱导治疗结束时(约一个月)和在几个巩固治疗周期后(约80天)测量白血病细胞(MRD)的数目来决定是否继续或改变治疗。如果诱导结束时的MRD水平高于定义的截止水平，则可决定增加治疗强度。截止水平在不同组方案之间略有不同，但通‑3 ‑4常在10 (1/1000)和10 (1/10,000)白血病细胞/总细胞之间。

[0012] 实时定量聚合酶链式反应(RT‑qPCR)是广泛使用的PCR变体，其用于测量DNA靶标的分子数目。使用荧光连续监测扩增，并记录达到规定荧光阈值的循环数(循环至阈值，Ct)。同时，使用标准品的一系列稀释液构建标准曲线。通常，当相对于标准物浓度的对数作图时，来自标准物曲线的各种Ct近似于直线，并且未知靶标的浓度可以由靶标的Ct和标准物曲线的最佳拟合线的方程确定。

[0013] 有效的扩增在PCR的一般使用中是重要的，但当PCR以定量方式如在RT‑qPCR中使用时特别重要。当使用两对不同的引物在同一反应中扩增两个不同的靶标时，或者甚至当使用同一套引物在同一反应中扩增两个不同的靶标时，如使用下一代测序定量微小残留病时的情况，避免偏倚也是重要的。

[0014] 其中有效扩增是重要的第三种情况是当期望多种不同引物对具有一致和最佳的性能。这只有在所有的引物以接近最大效率操作时才是真正可能的。这种情况的实例是使用患者特异性引物来定量免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)基因的重排。这些重排的定量用于评估白血病、淋巴瘤和骨髓瘤中残留疾病的水平。每个患者中的重排是独特的，并且因此用于重排的两个引物中的至少一个是独特的并且仅对患者是特异性的。因此，确定和记录患者特异性引物的效率不是直接的。关于患者特异性引物的效率的这种不确定性抑制了它们的常规和广泛用于微小残留病的定量，特别是在美国。

[0015] 除了终末期，PCR涉及靶标的指数扩增。通过荧光测量进展。在指数扩增期间的任何点处，

[0016] N＝N0·aC

[0017] 其中N0＝靶标的初始数目，N＝在关注点的靶标的数目，a是扩增/循环，C是达到点所需的循环数目。通过计算各边的对数，等式还可以表示为：

[0018] log10 N＝log10(N0)+C·log10(a)........(1)

[0019] 理论上，应可以通过确定方程中的其它三个未知数来确定扩增/循环。然而，尽管C的精确值的确定是直接的，但N0的精确值的确定受DNA浓度测量中的不精确性和任何DNA降解发生的影响。后者将导致靶标不能被扩增。由于这些因素，N值的确定是有问题的。

[0020] 在某一点处，荧光达到的固定点称为阈值，在固定点处，荧光明显高于背景并且仍然呈指数增加。如果Nt是在阈值处的靶标，Ct是达到阈值的循环数，则等式(1)可以表示为：

[0021] Ct＝log10(Nt)/log10(a)‑log10(N0)/log10(a)

[0022] 对于恒定条件下的一对引物，扩增效率是恒定的，因此：

[0023] Ct＝常数‑log10(N0)/log10(a)........(2)

[0024] Ct和log10(N0)之间的关系是一条直线，斜率由下式给出：

[0025] 斜率＝‑1/log10(a)

[0026] 并且a＝10‑1/斜率........(3)

[0027] 扩增效率(E)通常通过减去一并将结果表示为百分比而从“a”的值导出。由此：

[0028] E＝a‑1

[0029] 可以使用等式(1)来估计E的值，但是除了前面提到的限制之外，这种方法也被证明是困难的，因为可以分析的指数扩增的范围有限，它可以在背景之上，但仍然是指数的。目前几乎普遍采用等式(2)和(3)分析扩增。从等式(3)：

[0030] E＝10‑1/斜率‑1........(4)

[0031] 因此，在实践中，通常通过使用定量PCR扩增靶标浓度的范围，确定靶标浓度的对数和观察到的Ct值之间的回归线，并使用等式(4)计算引物效率来确定引物效率。

[0032] 当观察到的斜率为‑3.322时，效率为100％，，但这种效率水平很少达到。

[0033] 不幸的是，这种方法不是非常精确，并且需要大量的复制和对细节的仔细关注。将Ct与输入靶标的对数相关的标准曲线通常作为常规RT‑qPCR的一部分进行。然而，它仅给出了扩增效率的非常一般的测量，并且在结果中表现出不精确性和大的变化。例如，当通过PCR定量白血病中的微小残留病(MRD)时，范围为‑3.1至‑3.9的标准曲线的斜率被认为是可接受的(van der Velden，2007)。这些斜率对应于110％至80％的效率。

[0034] 因此，目前需要开发改进的评估引物效率的方法。在导致本发明的工作中，已经令人惊讶地确定，通过参考平均Ct值，可以相对地或绝对地更准确和快速地评估引物扩增效率，平均Ct值是在已经标准化以使参考引物能够扩增单个参考模板分子的测定中从单个靶分子的扩增确定的。具体而言，尽管常规PCR理论教导了应当使用连续稀释来评估引物效率以确定每个稀释点的Ct，然后绘制Ct对于靶标DNA起始质量的对数的回归线相，还教导了由于常规观察到误差发生，不应当使用高度浓缩或高度稀释的靶标DNA样本进行定量扩增。例如，如果抑制剂存在于靶标DNA的浓缩样本中，则需要更多的循环来越过检测阈值，从而人为地增加Ct。改善曲线斜率的一种机制是稀释样本，因为抑制剂与靶标DNA一起被稀释。然而，由于随机效应(其可在扩增结果中观察到)引起的高可变性，通常也推荐从分析中省略高度稀释的样本。然而，已经令人惊讶地确定来自单个靶标DNA拷贝的扩增实际上是高度精确的，并且在多个重复序列中产生比使用传统Ct回归线建模确定效率所观察到的低得多的变异系数，这完全与所有当前的扩增教导相反。当在已经标准化的测定的背景下进行时，可以使用相同的优化和标准化的测定方案相对于参考引物和核酸模板的效率相对地或绝对地定量评估引物对的效率。此外，多个引物组的效率因此也可以直接相互比较，达到它们在相同组的标准化条件下评估的程度。最后，甚至更出乎意料地确定了从靶标DNA的单拷贝的扩增获得的Ct结果是如此可靠的，而人们假定当评估针对特定基因或基因家族的引物的效率时，这应相对于针对同源基因或基因家族模板的参考引物来评估，人们实际上可以使用不相关的基因，如普遍表达的GALT基因作为参考模板。更具体地，如果在定量PCR测定的优化和标准化方案中使用与目的测试引物靶标具有很少或没有同源性的基因作为参考模板，则标准化测定将产生与使用与目的测试引物和靶标具有较高水平同源性的参考引物和模板进行的标准化测定相当的结果，因此，出乎意料地使得能够将给定的标准化测定应用于需要效率评估的引物，而不仅仅是那些与所选参考引物和模板显示同源性的引物。

[0035] 这些发现既出乎意料又违反直觉。开发这种简单但高度可靠的方法来评估引物效率，避免了每次需要确定引物效率时进行耗时和可变Ct回归线效率建模的需要。现在可以相对地或绝对地快速且更准确地确定引物效率，并且可以直接进行不同引物组的效率之间的直接比较。因此，本发明具有广泛的潜在应用，包括在研究环境中，其中虽然在设计或优化定量PCR反应的背景下确定引物效率的问题是关键步骤，但目前是其劳动密集型的，并且可产生相当可变的结果。本发明还可应用于临床环境中，就诊断和预后应用而言，例如微小残留病(MRD)分析，其中需要对非常低拷贝数的靶标进行高度灵敏的检测而不期望引物效率的可变性。此外，由于MRD测试需要产生和使用患者特异性引物，因此评估新产生的引物的效率并在所有测试中提供标准化结果的快速且简单的方法是非常有价值的。因此，本方法克服了与引物扩增效率评估相关的现有限制。

[0100] 本发明基于开发一种简单的方法，其通过将引物扩增效率与参考引物的性能进行比较，以高精度可重复地测定引物扩增效率。通过意外地确定引物效率实际上与Ct值精确相关，能够部分地实现开发，Ct值是用引物对靶分子的单拷贝进行标准化扩增得到的。通过在这些标准化条件下相对于参考引物扩增单拷贝核酸模板的效率直接或间接评估测试引物结果，可以建立测试引物效率的精确确定。方法不是传统的Ct回归线建模，而是能够设计用于常规和可靠的大规模引物效率测试的手段。在需要测试大量引物的情况下，例如用于MRD测试的多组患者特异性引物，本发明的方法不仅有助于简单和准确地确定引物效率，而且还由于测定方案的标准化性质以及由此获得的结果，使得能够直接比较测试引物之间的效率。这在已经针对特定靶标开发了多种不同引物并且寻求鉴定和使用最有效的引物的情况下是特别期望的。在另一个实例中，现在可以客观地确定给定的引物对是否足够有效以用于需要最低效率水平的应用中。因此，本发明的方法可用于广泛的研究和临床应用，特别是患者特异性引物的设计和测试，例如用于MRD测试，以确保引物足够有效以提供足够准确的结果，从而提供用于做出治疗决定的基础。

[0101] 因此，本发明的一个方面涉及评估针对目的核酸区域的正向和反向引物对的扩增效率的方法，该方法包括：

[0102] (i)使核酸样本与正向和反向引物对接触，其中核酸样本的特征在于存在目的核酸区域的单拷贝；

[0103] (ii)根据标准化的定量扩增方案扩增步骤(i)的核酸样本，方案已经标准化以使用针对模板分子的参考正向和反向引物对实现参考核酸模板分子的单拷贝的扩增；以及[0104] (iii)确定步骤(ii)的扩增反应的Ct，并从Ct值评估引物的扩增效率。

[0105] 提及“核酸”或“核苷酸”或“碱基”或“核碱基”应理解为既指脱氧核糖核酸或核苷酸又指核糖核酸或核苷酸或嘌呤或嘧啶碱基或其衍生物或类似物。在这方面，应理解为包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸的磷酸酯，包括DNA(cDNA或基因组DNA)、RNA或mRNA等。本发明的核酸分子可以是任何来源，包括天然存在的(例如源自生物样本)、重组产生的或合成产生的。核苷酸也可以是非标准核苷酸如肌苷。

[0106] 提及“衍生物”应理解为包括提及来自天然、合成或重组来源的核酸分子的片段、一部分、部分、同系物和模拟物。“功能衍生物”应理解为表现出嘌呤或嘧啶碱基，核苷酸或核酸分子的任何一种或多种功能活性的衍生物。核苷酸或核酸序列的衍生物包括具有与其它蛋白质或非蛋白质分子融合的核苷酸或核酸分子的特定区域的片段。核苷酸或核酸分子的生物素化是本文定义的“功能衍生物”的实例。核酸分子的衍生物可以源自单个或多个核苷酸取代、缺失和/或添加。术语“功能性衍生物”还应理解为包括表现出核苷酸或核酸序列的任何一种或多种功能活性的核苷酸或核酸，例如在天然产物筛选后获得的产物。

[0107] 本文考虑的“类似物”包括但不限于对核苷酸或核酸分子的修饰，例如对其化学组成或整体构象或任何其它类型的非天然存在的核苷酸的修饰。这包括，例如，对核苷酸或核酸分子与其它核苷酸或核酸分子相互作用的方式的修饰，例如在主链形成或互补碱基对杂交的水平。在不将本发明限制于任何一种理论或作用方式的情况下，核酸由三个部分组成：磷酸骨架、戊糖、核糖或脱氧核糖和四个碱基之一。类似物可以具有任何这些改变。通常，类似物碱基尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积性质。实例包括可与所有四个规范碱基配对的通用碱基，和影响链性质的磷酸酯‑糖主链类似物如PNA。核酸类似物也称为xeno核酸。非天然存在的核酸包括肽核酸(PNA)、吗啉代和锁定核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每一种通过改变分子的主链而与天然存在的DNA或RNA区域别开来。

[0108] 目的核酸样本和/或模板核苷酸序列可以是DNA或RNA或其衍生物或类似物。核酸可以采取基因组DNA、从mRNA转录物产生的cDNA、通过核酸扩增产生的DNA、合成DNA或重组产生的DNA的形式。如果目标核酸样本是RNA，应理解首先需要将RNA逆转录为DNA，例如使用RT‑PCR。本发明的RNA可以是任何形式的RNA，如mRNA、初级RNA转录物、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA等。优选地，核酸是DNA。

[0109] 根据实施方案，提供了评估针对目的DNA区域的正向和反向引物对的扩增效率的方法，该方法包括：

[0110] (i)使DNA样本与正向和反向引物对接触，其中DNA样本的特征在于存在单拷贝的目的DNA区域；

[0111] (ii)根据标准化的定量扩增方案扩增步骤(i)的DNA样本，方案已经标准化以使用针对模板分子的参考正向和反向引物对实现参考DNA模板分子的单拷贝的扩增；以及[0112] (iii)确定步骤(ii)的扩增反应的Ct，并从Ct值评估引物的扩增效率。

[0113] 提及“目的核酸区域”(本文也可互换地称为“靶”区域或序列)应理解为是指寻求分析的任何DNA或RNA序列。这可以是基因、基因的一部分，如基因片段或基因区域，或基因间区。为此，提及“基因”应理解为是指编码蛋白质产物的DNA分子，无论是全长蛋白质还是蛋白质片段。就染色体DNA而言，基因将包括内含子和外显子区域。然而，在核酸样本是cDNA的程度上，例如如果靶核苷酸序列是载体DNA或逆转录的mRNA，可能不存在内含子区域。然而，这样的DNA可以包括5'或3'非翻译区域。因此，本文提及的“基因”应理解为包括编码蛋白质或蛋白质片段的任何形式的DNA，包括例如基因组DNA和cDNA。主题靶核苷酸序列还可以对应于已知不与任何特定基因相关的基因组DNA的非编码部分(例如通常称为“垃圾”DNA区域)。它可以对应于通过重组产生的基因组DNA的任何区域，或者在基因组DNA的两个区域之间，或者在基因组DNA的一个区域和外源DNA例如病毒或引入的序列的一个区域之间。它也可对应于可包括SNP、点突变、超变、染色体易位、基因组基因片段重排、DNA插入、DNA缺失或断点(例如染色体断点)、特定基因片段、特定区域、基因的部分或片段、基因间区等的区域。靶序列也可以对应于部分或全部合成或重组产生的核酸分子的区域。主题靶序列还可以是先前已经通过任何核酸扩增方法扩增的DNA区域，核酸扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)(即，其已经通过扩增方法产生)。

[0114] 在一个实施方案中，目的核酸区域包括SNP、点突变、超变、染色体易位、基因组基因片段重排、DNA插入、DNA缺失或断点、例如染色体断点、特定基因片段、特定区域、基因的部分或片段或基因间区。

[0115] 在另一个实施方案中，目的核酸区域是重排的免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)DNA，更特别是重排的V、D和/或J基因片段。

[0116] 根据实施方案，提供了评估针对一个或多个重排的V、D或J基因片段的正向和反向引物对的扩增效率的方法，该方法包括：

[0117] (i)使DNA样本与正向和反向引物对接触，其中DNA样本的特征在于存在单拷贝的重排的V、D或J基因片段；

[0118] (ii)根据标准化的定量扩增方案扩增步骤(i)的DNA样本，方案已经标准化以使用针对模板分子的参考正向和反向引物对实现参考DNA模板分子的单拷贝的扩增；以及[0119] (iii)确定步骤(ii)的扩增反应的Ct，并从Ct值评估引物的扩增效率。

[0120] 在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，编码可重排的基因组DNA的Ig可变区域包括与重链或κ或λ轻链相关的可变区域，而编码可重排的基因组DNA的TCR可变区域包括α、β、γ和δ链。在这方面，细胞应理解为属于“淋巴样细胞”的范围，条件是细胞重排了编码至少一种免疫球蛋白或TCR基因片段区域的DNA的可变区域。细胞也不需要转录和翻译重排的DNA。在这点上，“淋巴样细胞”在其范围内包括，但绝不限于，未成熟的T和B细胞，其已经重排TCR或Ig可变区域基因片段但还不表达重排的链(例如TCR‑胸腺细胞)或还没有重排其TCR或Ig可变区域基因片段的两条链。定义进一步延伸至已经历至少一些TCR或Ig可变基因区重排的淋巴样细胞，但细胞可能不另外表现出传统上与成熟T细胞或B细胞相关的所有表型或功能特征。

[0121] 还应当理解，尽管在一个实施方案中，本发明的重排是完全重排，例如至少一个可变基因区的完全重排，但在另一个实施方案中，本发明的重排是部分重排。例如，仅经历DJ重组事件的B细胞是仅经历部分重排的细胞。直到DJ重组片段已经进一步与V片段重组，才实现完全重排。因此，本发明的引物设计成筛选TCR或Ig链的部分或完整可变区域重排。

[0122] 在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，在具有适应性免疫系统的生物体中的V(D)J重组是一种位点特异性遗传重组类型的实例，其帮助免疫细胞快速多样化以识别和适应新的病原体。根据重排的特定基因片段，每个淋巴样细胞经历其种系可16
变区域基因片段(V和J、D和J或V、D和J片段)的体细胞重组，以产生约10 个不同可变区域结构的总抗原多样性。在任何给定的淋巴样细胞如T细胞或B细胞中，由于包括TCR或Ig分子的两条链中的两条或更多条的重排，特别是TCR的α、β、γ或δ链和/或Ig分子的重链和轻链的重排，可能发生至少两个不同的可变区域基因片段重排。除了任何给定的Ig或TCR基因的VJ、DJ或VDJ片段的重排之外，在片段之间的连接区随机除去和/或插入核苷酸。这导致产生巨大的多样性。

[0123] 这些基因片段的基因座在种系中被广泛地分开，但是在淋巴发育期间的重组导致V、D和/或J基因的并置，这些基因之间的连接区的特征在于小的核苷酸插入和缺失区域。过程随机发生，使得每个正常淋巴细胞携带独特的V(D)J重排。由于淋巴癌，如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，是作为单个正常细胞中肿瘤性改变的结果而发生的，所有癌细胞至少最初将携带最初存在于生成细胞中的连接V(D)J重排。亚克隆可以在肿瘤细胞群扩增过程中产生，并且在它们中可以发生进一步的V(D)J重排。

[0124] 提及“基因片段”应理解为指Ig和T细胞受体基因的V、D和J区域。V、D和J基因片段聚集成家族。例如，κIg轻链有52个不同的功能性V基因片段和5个J基因片段。对于Ig重链，有55个功能性V基因片段，23个功能性D基因片段和6个J基因片段。在Ig和T细胞受体V、D和J基因片段家族的全部中，存在大量单独的基因片段，由此使得能够实现V(D)J重排的独特组合方面的巨大多样性。为了清楚起见，重排的Ig或T细胞受体[V(D)J]可变核酸区域在本文中将被称为重排的“基因”，并且单独的V、D或J核酸区域将被称为“基因片段”。因此，术语“基因片段”不仅仅指基因的片段。相反，在Ig和TCR基因重排的背景下，它是指其自身的基因，这些基因片段被聚类成家族。“重排的”Ig或T细胞受体可变区域基因在本文中应理解为这样的基因，其中一个V片段，一个J片段和一个D片段中的两个或多个(如果D片段特定重排的可变基因中)中的两个或多个已经剪接在一起形成单个重排的“基因”。事实上，这种重排的“基因”实际上是一段基因组DNA，其包括已经剪接在一起的一个V基因片段，一个J基因片段和一个D基因片段。因此有时也称为“基因区域”，因为它实际上由2或3个不同的V、D或J基因(本文称为基因片段)组成，这些基因已被剪接在一起。因此，重排免疫球蛋白或T细胞受体基因的单个“基因片段”定义为单个V、D和J基因。这些基因在IMGT数据库中详细讨论。术语“基因”在本文中用于指重排的Ig或T细胞受体可变基因。本文使用的术语“基因片段”是指V、D和J片段。然而，应当注意，在Ig和T细胞受体重排方面，使用“基因”/“基因片段”语言存在显著的不一致性。例如，IMGT指个体V、D和J“基因”，而一些科学出版物将它们称为“基因片段”。一些来源将重排的可变Ig或T细胞受体称为“基因区域”，而其它来源将其称为“基因”。本说明书中使用的术语如前面所定义。

[0125] 仍然不将本发明限制于任何一种理论或作用方式，遗传重组事件的性质使得重组基因或基因片段(如本文所定义)之间的连接区可以通过导致形成“N区域”的随机核苷酸的缺失和插入来表征。这些N区域也是独特的，因此它们本身有时是靶序列分析中有用的靶。因此，通常理解V(D)J重排提供组合多样性，而添加N核苷酸或回文(P)核苷酸提供连接多样性。

[0126] 还应当理解，在V(D)J重排的背景下，被翻译的蛋白质分子的二级结构本身确实包括独特的特征，这些特征本身通常是分析的主题，尽管它是根据编码这些二级结构特征的V(D)J重排内的DNA序列区域。例如，IgH(Ig重链)或TCRβ或δ链的翻译可变区或TCRβ或δ链采取三个环状高变区的形式，其通常称为互补决定区(CDR)1、2和3。这些CDR区域侧接四个骨架区(FR)1、2、3和4。不将本发明限制于任何一种理论或作用方式，V基因片段应理解为编码CDR1、CDR2、前导序列、FR1、FR2和FR3。CDR3区域由部分V基因片段，全部D基因片段和部分J基因片段编码。J基因片段的其余部分通常编码FR4。

[0127] 因此，在一个实施方案中并且在V(D)J重排的背景下，目的核酸区域对应于IgH、TCRβ或TCRδ的VJ、DJ或VDJ重排。在另一个实施方案中，目的核酸区域对应于Igκ、Igλ、TCRα或TCRγ的VJ重排。

[0128] 在另一个实施方案中，目的核酸区域是V基因片段区域，例如倾向于经历超变的区域和/或编码CDR3的一部分的J基因片段区域。

[0129] 在还又另一个实施方案中，目的核酸区域针对编码全部或部分V前导序列，IgH FR1、IgH FR2或IgH FR3的基因片段区域。

[0130] 本发明的方法涉及确定引物对的扩增效率。“扩增效率”是指每个扩增循环中扩增子的增加。这通常表示为PCR循环结束时的靶基因分子数相对于同一PCR循环开始时的靶分子数的增加百分比。理想地，靶序列的分子数在每个复制循环期间应加倍，这对应于100％的扩增效率。然而，这种情况很少。在不将本发明限制于任何一种理论或作用方式的情况下，扩增效率低于100％的原因可包括差的引物设计，非最佳试剂浓度或非最佳反应条件中的一种或多种。二级结构形成如二聚体和发夹或不适当的解链温度(Tm)也可影响引物模板退火，从而导致扩增不良。本领域技术人员应当理解，由于本发明的方法基于在标准化扩增体系中测试正向和反向引物对，因此引物自身的效率将是唯一的显著变量，并且从本方法的应用获得的结果将因此反映引物自身的效率而不是测定的一些其它组分。因此，本文提及的“正向和反向引物对的扩增效率”是指使用特定引物对可实现的扩增效率，而不是指对本发明扩增反应的任何其它组分的扩增效率的贡献。还应当理解，本文对“引物效率”的讨论仅仅是对根据本发明的方法测试的引物对的扩增效率的可互换提及。还应当理解，尽管本发明的方法提供了正向和反向引物对的扩增效率，但方法还能够计算单独的正向或反向引物对效率结果的相对贡献。如下文更详细讨论的，本方法有助于潜在地选择在测试引物对的背景下使用的参考引物之一。由于参考引物的效率是已知的，并且参考引物测定与测试引物测定之间的唯一差异是以下事实：参考引物之一(正向引物或反向引物)被测试引物代替，当相对于使用参考引物对确定的参考效率点进行评估时，从测试引物测定获得的效率结果。将有效地提供单个测试引物对效率的影响的读数，测试引物用于替换参考引物之一。

[0131] 提及“引物”或“寡核苷酸引物”应理解为是指包括核苷酸序列的任何分子，或其功能衍生物或类似物，其功能包括与目的核酸分子(目的DNA可互换地称为“靶标DNA”)的区域杂交。应当理解，引物可以包括锁核酸或非核酸组分。例如，引物还可以包括非核酸标记，例如荧光或酶标记或一些其它非核酸组分，其促进分子作为探针的使用或另外促进其检测或固定。引物还可以包括额外的核酸组分，例如下文更详细讨论的寡核苷酸标签。在另一个实例中，引物可以是包括显示核酸侧链的肽骨架的蛋白质核酸。优选地，寡核苷酸引物是DNA引物。

[0132] 提及“正向引物”应理解为是指通过与目标DNA的反义链杂交而扩增靶DNA样本中的靶DNA的引物。提及“反向引物”应理解为是指通过与目标DNA的有义链杂交而扩增靶DNA样本和PCR中的靶DNA的引物。因此，提及“正向和反向引物对”应理解为是指正向引物和反向引物，其将一起在本发明的方法中进行测试。因此，应当理解，所获得的扩增效率结果表示所选择的正向和反向引物在一起使用时的效率。应当理解，在某些情况下，在正向和反向引物都是为特定应用而独特和特异地选择或设计的，并且将被测试以确定它们的扩增效率。然而，在其它情况下，可能只需要独特地设计正向或反向引物中的一种，而另一种引物可以是已知的和可获得的引物，如共有引物或可商购的引物，或甚至是在标准化扩增反应中使用的参考引物中的一种(如下文更详细讨论的)，以产生分析测试引物Ct结果的参考效率点。在这种情况下，效率结果将仍然附着于引物的组合，但其中一个引物在测试的多个引物对中是相同的(例如对于Ig V(D)J扩增是共有J引物，但对于每个引物对是独特的V引物)，并且用所有这些引物扩增相同的目的核酸区域。当在这些引物对之间进行比较时，效率结果将有效地提供与独特引物的效率相关的实质信息，引物对各自使用一种共同引物和一种不同引物。这种类型的分析通常发生在B和T细胞瘤的MRD分析中，例如，其中需要使用针对特异性V(D)J重排的引物。在这种情况下，重排特异性(通常称为“患者特异性”)通常由V引物提供，而选择使用的J引物可以是共有或家族引物，其可用于广泛范围的不同患者重排。

[0133] 适用于本发明的引物的设计和合成是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，主题引物的长度为4至60个核苷酸，在另一个实施方案中为10至50个核苷酸，在又一个实施方案中为15至40个核苷酸，在又一个实施方案中为20至35个核苷酸。在另一个实施方案中，引物的长度为约25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个核苷酸。

[0134] 本发明的扩增方案是定量扩增反应。提及“定量”扩增反应是指在扩增反应期间实时监测靶标DNA分子扩增而不是在反应结束时监测靶标DNA分子扩增的扩增反应，如典型的经典聚合酶链反应(PCR)或数字PCR。然而，应注意的是，对于一些数字PCR仪器，也可以进行实时监测并确定由单个靶模板扩增产生的Ct值。定量PCR(qPCR)通常也称为实时PCR(RT‑PCR)或实时定量PCR(RT‑qPCR)。在这点上，RT‑PCR也是用于描述逆转录酶PCR的缩写。然而，就本文可参考RT‑PCR而言，其旨在作为定量(实时)PCR的参考。

[0135] 仍然不以任何方式限制本发明，在实时PCR中检测PCR产物的两种常用方法是(1)嵌入任何双链DNA的非特异性荧光染料，如SYBR Green、EvaGreen和Syto 82以及(2)由用荧光报道分子如荧光素，Hex或Texas Red标记的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，其仅允许在探针与其互补序列杂交后检测。

[0136] 在一个实施方案中，扩增反应是PCR。

[0137] 根据实施方案，提供了评估针对目的DNA区域的正向和反向引物对的扩增效率的方法，该方法包括：

[0138] (i)使DNA样本与正向和反向引物对接触，其中DNA样本的特征在于存在单拷贝的目的DNA区域；

[0139] (ii)根据标准化的定量PCR方案扩增步骤(i)的DNA样本，方案已经标准化以使用针对模板分子的参考正向和反向引物对实现参考DNA模板分子的单拷贝的扩增；以及[0140] (iii)确定步骤(ii)的扩增反应的Ct，并从Ct值评估引物的扩增效率。

[0141] 在另一个实施方案中，使用嵌入双链DNA的非特异性荧光染料检测通过定量PCR产生的扩增子。在另一个实施方案中，使用与报道分子如荧光报道分子可操作地连接的序列特异性DNA探针检测通过定量PCR产生的扩增子。

[0142] 如上文详述，本发明的方法基于确定当扩增靶分子的单拷贝时获得的Ct值提供比目前推荐进行的传统Ct回归线建模方法更准确和一致的扩增效率读出。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，Ct回归线建模是基于从一系列连续稀释的靶标DNA浓度确定Ct。然后将这些Ct值绘制在起始DNA浓度的对数标度上。回归线的斜率能够计算扩增反应。然而，当使用Ct回归线建模计算时，扩增效率的变异系数显著大于当测定靶标DNA的单个起始拷贝的Ct时的变异系数。就根据本方法计算定量扩增反应的效率和通过延伸引物的效率而言，必须将主题反应标准化，使得除了引物和靶标DNA之外，可能影响扩增效率的变量基本上相等。在这点上，在本扩增方案的上下文中提及的“标准化的”或“标准化的”应理解为是指除引物的设计和靶标DNA的选择之外的扩增方案的那些元件，其表现出与本参考和测试引物扩增反应之间的功能等同性。“功能等同性”是指如下文进一步描述的主题要素，即使实际上不相同，仍然提供等同的功能结果。例如，在参考和测试引物扩增反应之间可以选择使用两种不同类型的试剂，该试剂尽管在化学组成和/或来源方面不同，但仍表现出相同的功能活性。在另一个实例中，可以选择使用两种不同的仪器，条件是两种仪器能够产生相同的反应条件。如果是，使用这些仪器的扩增反应将被认为是标准化的。标准化的因素的实例包括但不限于试剂组分和材料(例如用于实时检测扩增产物的试剂浓度和材料，如嵌入染料或序列特异性报告物标记的探针)、方法(例如反应体积、Tm、循环条件和其它反应条件)、选择用于监测扩增和确定Ct值的手段、仪器和设置(如阈值线设置)等。因此，作为根据本发明方法的标准化反应的任何扩增反应将根据限定的一组参数进行，使得反应中唯一重要的变量是靶标DNA的选择和用于扩增目的DNA区域的正向和反向引物对的设计。当可以确定需要偏离特定测试引物的标准化反应方案时，有必要在这些新的反应条件下重新校准参考引物，使得从测试引物获得的Ct值可以相对于在与用于扩增测试引物的那些相同的反应条件下产生的参考引物结果进行分析。不能相对于在不同组反应条件下产生的原始参考引物结果来评估测试引物结果。

[0143] 在一个实施方案中，应用于参考和测试引物的标准化扩增方案是相同的。

[0144] 在本发明的方法中使用的定量PCR方案是被设计用于实现参考核酸模板分子的单拷贝的扩增的方案。“单拷贝”是指目标模板分子的单拷贝，然后根据本发明的方法对分子进行扩增。在目的核酸区域的上下文中提及“单拷贝”应理解为具有相应的含义。应当理解，就设计将可靠地和可重复地扩增参考核酸模板分子的单拷贝并由此成为根据本发明使用的标准的扩增方案而言，这可以通过使用参考引物及其靶核酸模板建立标准化条件或通过使用任何其它合适的引物对和靶核酸来实现。条件是确定标准化条件适于使用目的参考和测试引物扩增靶标DNA的单拷贝。

[0145] 使用用于扩增参考核酸模板分子的参考正向和反向引物对进行标准化的扩增方案。“参考”引物或“参考”模板核酸是指用于建立Ct、Nt和/或扩增参考效率点(在本文中称为“参考效率点”或“效率基准”)的引物和核酸靶标，将对照参考点评估测试引物扩增结果。在这方面，“参考核酸模板”是参考引物被设计用于扩增的核酸分子。这与先前定义的“目的核酸区域”(“靶核酸”)不同，“目的核酸区域”(“靶核酸”)是作为本方法的效率分析的主题的引物所针对的。通常，参考模板分子不直接对应于目的核酸区域分子，尽管不排除这种可能性，但是它们可以被设计或选择为使得它们表现出与作为测试对象的分子种类的结构或序列同源性。例如，在分析针对特异性IgH V(D)J重排的患者特异性引物的效率的背景下，可以选择重排的IgH序列作为参考模板序列，以及合适的参考引物，例如针对所选重排的V区域和J区域的共有引物或基因片段家族引物。不同组的参考引物和参考模板可用于标准化测定的背景下，用于不同类别的测试引物对和靶标，如基因断点区域。在这点上，应当理解，对于可选择用于特定类别的测试引物的每组参考引物，将必须确定技术人员可选择用于分析特定类别的测试引物的每组参考引物的参考效率点。在这点上，在一个实施方案中，本领域技术人员可以确定最初被分析为测试引物的引物实际上适于用作参考引物，并因此将代替使用原始参考引物。在这种情况下，不管新用作参考引物的测试引物是在与原始参考引物相同的标准化条件下扩增，还是在不同的一组标准化条件下扩增，新的参考引物将必须在选定的标准化条件下进行测试，并测定其Ct、Nt和/或扩增效率，以建立新的参考效率点，针对参考效率点评估将来的测试引物。在另一个实例中，如果需要偏离给定参考引物对的推荐的标准化条件，例如使得能够使用不同的扩增条件(例如扩增培养基成分的变化)，不同的方法(例如，使用备选的探针或荧光染料用于监测扩增)或与最初使用的仪器不同的仪器，有必要确定参考引物在这些改变的反应条件下的参考结果的效率点，然后分析测试引物在这些新条件下的扩增效率，以便能够相对于新的参考引物基准结果评估测试引物结果。

[0146] 参考引物扩增反应不需要与在同一组标准化条件下进行的每个测试引物扩增同时进行，尽管这通常是优选的情况。相反，参考引物的原始效率基准结果(其在较早的时间点获得)可用作随后评估(“校准”)所有未来测试引物结果的标准，条件是使用产生参考引物结果的相同标准化方案获得测试引物结果。

[0147] 还应理解的是，本发明延伸至测试引物的效率的测定中使用参考引物。例如，如上文，如果对特定目的核酸区域的特异性可单独由正向引物或反向引物提供，则对于区域仅需要一种独特的引物。在这种情况下，根据参考引物和参考模板的性质扩增方案中的参考效率点的参考引物和参考模板的性质，人们可以将一种参考引物与讨论中的测试引物配对，例如参考引物是适于靶向和扩增目的核酸区域的共有引物，而测试引物是提供必要特异性的独特引物。

[0148] 设计或选择适当的参考引物和模板以在标准化扩增方案的背景下使用，并且进一步确定在什么范围的测试引物和相应的目的核酸区域中可以使用这种标准化的方案和参考引物组合，完全为本领域技术人员熟知，记住扩增效率，来自参考DNA模板单拷贝的扩增的Nt和/或Ct将建立参考效率点，相对于该参考效率点，将相对地或绝对地评估测试引物测定的Ct。为此，本发明人已经令人惊讶地确定，事实上，本发明的方法是有效的，即使在使用与目的核酸区域显示很少或没有同源性的参考模板分子进行标准化测定的情况下。例如，已经确定靶向任何V、D和/或J基因重组，无论T或B细胞来源，将实现模板重排扩增的任何引物对一起有效提供能够评估针对任何V(D)J重排的测试引物的扩增效率所需的参考效率点。事实上，已经进一步确定，当使用与目的核酸区域(例如普遍表达的GALT基因)没有同源性的参考模板优化和标准化测定以显示高水平的效率时，这些标准化条件的应用，以及由此确定的用于评估测试引物效率的参考效率点仍然实现了测试引物的准确效率评估，尽管有这样的事实，常规的教导表明被扩增的靶序列的性质本身可导致扩增效率的变化。使用针对单拷贝基因(例如GALT基因)的引物来提供用于测试针对其它单拷贝基因的引物的参考系统具有以下优点：参考模板通常是可用的，且如果在相同模板中比较参考和测试引物，那么参考和测试模板的质量是相同的。因此，可以理解，本方法扩展到使用基因如GALT基因进行标准化测定，并进行引物相对于标准的所有扩增效率测试，或建立多个不同的标准化测定，每个测定都涉及测试针对目标核酸区域的引物的效率，目标核酸区域显示出与给定标准化测定的背景下使用的特定参考模板的同源性。

[0149] 在一个实施方案中，参考核酸模板是重排的IgH或TCR序列。

[0150] 在另一个实施方案中，参考核酸模板是单拷贝基因，特别是GALT基因。

[0151] 应当理解，定量PCR方案可以通过本领域技术人员熟知的任何合适的方法标准化。在不以任何方式限制本发明的情况下，在一个实施方案中，将方案标准化，使得它以高水平的效率进行，即，已经优化引物以高水平/最大扩增效率进行。实现这种优化通常需要优化反应条件，监测扩增和确定Ct值的方法以及仪器的选择。然而，尽管在大多数情况下，本发明的测定将被优化以在可实现的最高效率水平下运行，但可能存在其中尽管本发明的测定已被标准化，但这些标准化的条件不一定是最佳的情况。因为根据本方法评估的测试引物是使用标准化方案评估的，所以标准化方案的效率提供了扩增参考效率点，相对于参考点分析(校准)测试引物Ct结果。因此，在寻求在鉴定高效引物方面实现最佳可能结果的实施方案中，需要建立以高效水平起作用的标准化方案。

[0152] 本发明的方法能够通过根据标准化的PCR方案扩增测试引物和目的核酸区域的单拷贝来相对或绝对确定测试引物对的效率。由此确定的Ct值然后可以相对于标准化参考引物测定的扩增效率进行评估，如使用参考引物测定的初始Ct回归线建模分析所确定的，如下文进一步讨论的。提及“Ct”是指循环阈值。在不以任何方式限制本发明的情况下，在定量PCR中，通过在每个扩增循环期间实时产生的阳性信号(例如从特异性探针或非特异性嵌入染料释放的荧光信号)的累积来检测阳性反应。因此，扩增Ct应理解为信号达到阈值所需的扩增循环数。清楚且可靠地超过背景水平的最小荧光水平被称为“阈值”，并且阈值可以由本领域技术人员手动设置，或者可以由选择使用的扩增体系的软件自动设置。因此，Ct水平通常与样本中靶核酸的量成反比。其中Ct水平越低，样本中起始靶核酸的量越大。然而，测定的效率以及其它测定变量也可能影响Ct值。因此，虽然Ct通常被认为是样本中核酸靶起始浓度的相对量度，但除了仅靶标DNA的起始浓度外，还有许多因素可能影响Ct值。

[0153] 在本发明的上下文中，影响Ct的变量通过标准化测定和从目的DNA区域的单个起始拷贝进行测试引物的扩增而最小化。本领域技术人员还将意识到，除了参考引物或参考引物对的扩增效率之外的因素可以影响观察到的Ct值，并因此影响Nt的值。这些因素包括反应体积，操作者或仪器软件对阈值的定位，在PCR过程中测量荧光水平的方法和仪器的性质。当考虑到源自高度稀释的样本的qPCR扩增Ct分析是不可靠的并且由于在扩增结果中可以观察到的由随机效应引起的高可变性，这种高度稀释的样本应当从分析中省略的当前教导时，测定结构事实上使得能够基于从目的DNA的单拷贝获得的Ct值更精确，简单和可再现地确定测试引物的效率是违反直觉的。更进一步地，甚至更出乎意料地确定了从靶标DNA的单拷贝的扩增获得的Ct结果是如此可靠的，而将假定当评估针对特定基因或基因家族的引物的效率时，这应相对于使用同源基因或基因家族模板标准化的测定条件来评估，还可以使用非同源基因作为参考模板，并且仍然获得与测试引物相关的准确效率结果。这些发现现在避免了对每个目的测试引物进行Ct回归线分析的需要，回归线比本发明的方法表现出更高的变异系数，执行起来更费时和费力，并且不便于多个引物组的效率相对于彼此的评估和直接比较，因为现有技术的方法没有建立可评估所有测试引物Ct结果的客观参考效率点。因此，现有技术的方法没有提供一种以提供确定性的方式客观地证明引物效率的手段。

[0154] 因此，本发明基于根据标准化方案用目的正向和反向引物对扩增目的核酸区域的单拷贝。将目的核酸区域的单拷贝与正向和反向引物对接触应理解为是指促进引物与核酸样本混合，使得可以发生相互作用(例如，杂交)。实现目的的方法是本领域技术人员公知的。实现引物定向扩增的方法也是本领域技术人员熟知的。本领域技术人员还将理解，对于参考引物，为了使扩增效率确定的准确性和当扩增参考模板的单拷贝时观察到的Ct最大化，可以选择进行扩增效率和单拷贝Ct的多重估计，然后计算平均值以估计阈值处的拷贝数量。还可以通过在标准化条件下分析引物和模板的群体，对它们的扩增效率和单拷贝Ct进行单个估计，并从这些中确定这些统计的平均值并计算在阈值处的拷贝数目的平均值来获得类似的参考值。

[0155] 提及“核酸样本”应理解为指生物或非生物样本。非生物样本的实例包括例如合成产生的核酸群体的核酸产物。提及“生物样本”应理解为是指源自动物、植物或微生物(包括微生物培养物)的生物材料的任何样本，例如但不限于细胞材料、血液、粘液、粪便、尿液、组织活检样本、已引入动物体内并随后除去的流体(例如在肺灌洗后从肺提取的盐水溶液或从灌肠洗液回收的溶液)，植物材料或植物繁殖材料如种子或花或微生物群落。根据本发明的方法测试的生物样本可以直接测试或在测试前需要某种形式的处理。例如，活组织检查样本可能需要在测试前均化，或者可能需要切片用于原位测试。此外，在生物样本不是液体形式的情况下(如果测试需要这种形式)，可能需要加入试剂，例如缓冲液，以使样本移动。

[0156] 就靶标DNA存在于生物样本中的程度而言，可直接测试生物样本，或者可在测试之前分离生物样本中存在的所有或一些核酸物质。在测试前预处理靶核酸分子，例如灭活活病毒或在凝胶上电泳，也在本发明的范围内。还应当理解的是，生物样本可以是新鲜收获的，或者可以在测试之前储存(例如通过冷冻)，或者在测试之前进行其它处理(例如通过进行培养)。

[0157] 选择哪种类型的样本最适于根据本文公开的方法进行测试将取决于情况的性质，例如被监测的状况的性质。例如，在优选的实施方案中，肿瘤病症是分析对象。如果肿瘤疾病是白血病、血样、淋巴液样本或骨髓抽吸物可能提供合适的测试样本。当肿瘤病症是淋巴瘤时，淋巴结活组织检查或血液或骨髓样本可能提供合适的组织来源用于测试。还需要考虑是否要监测肿瘤细胞的原始来源或是否要监测转移瘤的存在或肿瘤从起源点的其他形式的扩散。在这方面，可能需要从任何一种哺乳动物收获和测试许多不同的样本。为任何给定的检测情况选择合适的样本将属于本领域普通技术人员的技能。

[0158] 本文所用的术语“哺乳动物”包括人、灵长类、家畜动物(例如马、牛、绵羊、猪、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、伴侣动物(例如狗、猫)和圈养野生动物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，哺乳动物是人或实验室试验动物。甚至更优选地，哺乳动物是人。

[0159] 然而，应当理解，由于本发明的方法要求仅扩增目的核酸区域的单拷贝，本领域技术人员将需要制备受试样本，使得在反应中仅存在单拷贝。实现目的的方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于使用诸如微操作，使用流式细胞术将单个细胞沉积到单个孔中以及使用有限稀释将单个细胞分配到单个孔中的方法。

[0160] 在这方面，并且在本发明的相关方面，已经令人惊讶地确定，可以通过基于对从扩增反应获得的Ct结果应用统计分析计算平均Ct值来估计用于扩增单个靶核酸分子的可靠和准确的Ct结果，扩增反应已经在扩增之前经历连续稀释的核酸靶上进行。方法避免了肯定地鉴定和确定单个靶核酸分子已被成功分离和扩增的需要，这既费时又费力。通过开发一种方法，其能够基于从直接限制性稀释测定获得的统计学分析结果依赖平均Ct结果，这促进了将本发明的方法应用于确定引物效率的大规模自动化分析。

[0161] 本发明方面的方法基于在一系列反应孔或任何其它合适的区室化或分隔系统中稀释目的核酸样本，其浓度使得只有一些反应孔含有一个或多个拷贝的目的核酸区域，而其余的孔不含有拷贝的目的核酸区域。给定孔含有0、1、2或更多个目的核酸区域的起始拷贝的概率通过泊松分布描述。因此，通过应用泊松分布计算，可以确定含有两个或多个DNA起始拷贝的孔的数目。因为较低的Ct通常与较高的靶标DNA起始浓度相关，所以丢弃通过泊松计算确定的含有两个或多个目的核酸区域起始拷贝的孔的比例的最低Ct结果，如未显示扩增的孔的结果，表明这些孔不含DNA。将剩余孔的Ct结果平均以获得平均Ct值，剩余孔通过应用泊松分布计算而被确定为含目的核酸区域的单个起始拷贝。本发明人已经确定，通过方法计算的平均Ct值实际上是使用目的引物对扩增靶核酸的单个起始拷贝的实际Ct的可靠估计，并且可以使用标准统计技术确定其置信界限。

[0162] 因此，在本发明的相关方面，提供了确定针对目的核酸区域的正向和反向引物对的Ct的方法，该方法包括：

[0163] (i)使核酸样本的多个等分试样与正向和反向引物对接触，其中多个等分试样中的至少两个的特征在于存在目的核酸区域的单拷贝；

[0164] (ii)根据定量扩增方案扩增步骤(i)的核酸等分试样，定量扩增方案经设计以实现核酸靶分子的单拷贝的扩增并测定每个等分试样的Ct；以及

[0165] (iii)测定步骤(ii)的扩增反应的平均Ct，扩增反应从目的核酸区域的单拷贝扩增。

[0166] 在一个实施方案中，核酸是DNA。

[0167] 更具体地，提供了确定针对目的DNA区域的正向和反向引物对的Ct的方法，该方法包括：

[0168] (i)对包括目的DNA区域的生物样本进行有限稀释，并产生样本的多个等分试样，其中等分试样的亚组不含目的DNA区域的拷贝；

[0169] (ii)使步骤(i)的等分试样与正向和反向引物对接触并根据定量扩增方案扩增等分试样，定量扩增方案经设计以实现目的DNA区域的单拷贝的扩增并测定每个等分试样的Ct；

[0170] (iii)统计地确定来自步骤(i)的等分试样的比例，等分试样包括目的DNA区域的至少两个起始拷贝；以及

[0171] (iv)确定扩增反应步骤(ii)的平均Ct，其中平均的计算不包括从未观察到扩增的等分试样获得的Ct结果和对应于步骤(ii)中确定的比例值的最低单个等分试样Ct结果的比例。

[0172] 提及“平均”Ct应理解为对目的核酸区域的单个起始拷贝进行多个独立扩增反应的平均值。然而，当技术人员选择对目的核酸区域的单拷贝仅进行一次扩增反应时，“平均值”将简单地对应于所获得的单个Ct值。本领域技术人员应当理解，平均Ct值可以通过任何合适的实验设计来确定，并且上文描述的基于泊松分布的方法仅举例说明一种可能性。

[0173] 提及“多个”样本应理解为是指2个或更多个样本。在不以任何方式限制本发明的情况下，通过对单个起始核酸样本进行有限稀释以产生多个等分试样来产生多个样本。“等分试样”是指与原始样本分开的样本，并且样本也可以在过程中被稀释。然后在单独的反应中维持和扩增受试等分试样。分隔这些等分试样的方法可以采用任何合适的形式，例如通过使用单独的管或多孔板。在一个实施方案中，平均Ct值由至少两个核酸等分试样的Ct结果确定，等分试样的特征在于在开始本发明的扩增方法之前仅存在一个拷贝的目的核酸区域。在另一个实施方案中，设计步骤(i)的有限稀释以产生2‑384个等分试样，在另一个实施方案中8‑96个等分试样和在又一个实施方案中12、16或24个等分试样。在还又另一个实施方案中，等分试样的数目对应于在数字PCR过程中产生的分割样本的数目。在这点上，进行有限稀释的方法是本领域技术人员公知的。

[0174] 应当理解，统计确定包括两个或更多个靶标DNA起始拷贝的等分试样的比例的步骤可以在任何合适的时间点进行，并且不必在扩增步骤之后严格计算。即，也可以在执行极限稀释步骤之后立即执行计算。

[0175] 本发明的这一方面可用于任何引物对的应用范围，引物对可以是目的受试对象并且其中需要靶标DNA的单拷贝的Ct。例如，可以将通过方法获得的结果与使用传统回归线分析确定的扩增效率组合在一起，以确定在特定目的引物对的阈值下产生的扩增分子的数目。就分析用作参考引物的引物的适合性而言，这可发现作为独立方法的特定效用。或者，如上文所用，这种确定Ct的方法可与测试引物相对于参考引物的绝对或相对效率的确定结合并用于上下文中。

[0176] 根据实施方案，提供了评估针对目的DNA区域的正向和反向引物对的扩增效率的方法，该方法包括：

[0177] (i)使多个核酸样本与正向和反向引物对接触，其中多个样本中的至少两个的特征在于存在目的核酸区域的单拷贝；

[0178] (ii)根据标准化的定量PCR方案扩增步骤(i)的DNA样本，方案已经标准化以使用针对模板分子的参考正向和反向引物对实现参考DNA模板分子的单拷贝的扩增；以及[0179] (iii)测定步骤(ii)的扩增反应的平均Ct并从Ct值评估引物的扩增效率。

[0180] 在另一个实施方案中，测试引物和/或参考引物的平均Ct值已经通过以下确定：

[0181] a)对包括目的DNA区域的生物样本进行有限稀释，并产生样本的多个等分试样，其中等分试样的亚组不含目的DNA区域的拷贝；

[0182] b)使步骤(a)的等分试样与正向和反向引物对接触，并根据标准化定量PCR方案扩增步骤(a)的DNA，并测定每个等分试样的Ct；

[0183] c)统计地确定来自步骤(a)的等分试样的比例，等分试样包括目的DNA区域的至少两个起始拷贝；以及

[0184] d)确定扩增反应步骤(b)的平均Ct，其中平均的计算不包括从未观察到扩增的等分试样获得的Ct结果和对应于步骤(b)中确定的比例值的最低单个等分试样Ct结果的比例。

[0185] 在一个实施方案中，目的核酸区域包括SNP、点突变、超变、染色体易位、基因组基因片段重排、DNA插入、DNA缺失或断点、例如染色体断点、特定基因片段、特定区域、基因的部分或片段或基因间区。

[0186] 在另一个实施方案中，目的核酸区域是重排的免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)DNA，更特别是重排的V、D和/或J片段。

[0187] 在又另一个实施方案中并且在V(D)J重排的背景下，目的核酸区域对应于IgH、TCRβ或TCRδ的DJ或VDJ重排。在另一个实施方案中，目的核酸区域对应于Igκ、Igλ、TCRα或TCRγ的VJ重排。

[0188] 在还又另一个实施方案中，目的核酸区域是V基因片段区域，倾向于经历超变的区域和/或编码CDR3的一部分的J基因片段区域。

[0189] 在又还另一个实施方案中，目的核酸区域针对编码全部或部分V前导序列，IgH FR1、IgH FR2或IgH FR3的基因片段区域。

[0190] 在另一个实施方案中，扩增反应是PCR。

[0191] 在另一个实施方案中，使用嵌入双链DNA的非特异性荧光染料检测通过定量PCR产生的扩增子。在另一个实施方案中，使用与报道分子如荧光报道分子可操作地连接的序列特异性DNA探针检测通过定量PCR产生的扩增子。

[0192] 在另一个实施方案中，参考核酸模板是重排的IgH基因或TCR基因。

[0193] 在另一个实施方案中，参考核酸模板是单拷贝基因，优选GALT基因。

[0194] 如上文详述，从扩增目的DNA区域的一个起始拷贝的标准化PCR测定获得的平均Ct提供了用于评估目的引物对的扩增效率的出乎意料地准确和可再现的参数。评估可以是相对的或绝对的。为了能够进行评估，必须使用标准化测定(本文称为“标准化参考测定”)确定参考引物扩增参考DNA模板分子的效率和/或用参考引物扩增单拷贝参考DNA模板的Ct中的一种或两种。标准化参考确定的扩增效率测定可以通过进行如上的传统Ct线回归建模来实现。然而，除了在优化和标准化测定的背景下进行的初始线性回归分析之外，就随后使用标准化测定测试的引物而言，不需要进一步的这种建模。相反，来自测试引物扩增的平均Ct值是能够评估所讨论的测试引物的扩增效率所需的唯一值。在这点上，提及“评估”测试引物的扩增效率应当理解为得出关于受试测试引物的效率的结论，无论其是测试引物效率的相对、绝对、定性或定量方面。此类评估包括但不限于：

[0195] (i)从平均Ct值本身推断测试引物的扩增效率，其中Ct值越低，引物效率越好。因为经验上已知在100％的扩增效率下，一个靶拷贝的Ct将是36.53并且95％的效率将是37.91，那么在标准化参考测定方案经优化以在高效率水平下起作用的情况下，小于38的测试引物Ct值指示良好的引物效率。根据这种分析形式，Ct值提供了扩增效率的量度，而不是实际的扩增效率；

[0196] (ii)当用参考引物扩增单拷贝的参考模板的Ct被确定或先前已经被确定时，(i)中描述的推断可以通过将测试引物的单个靶分子Ct相对于参考引物的单个靶分子Ct进行比较来进行。如果在标准化条件下扩增测试引物模板的单拷贝得到的Ct是先前从扩增参考模板的单拷贝观察到的Ct的数量级，则可以推断测试引物以与参考引物类似数量级的效率操作。此外，测试引物的Ct值相对于参考引物的Ct的增加将推断测试引物显示出比参考引物更差的效率。

[0197] (iii)在已经确定标准化参考测定的Ct线回归模型中的线的斜率的情况下，可以使用下式确定反应的效率：

[0198] E＝10‑1/斜率–1………(4)

[0199] 靶分子的初始数目(N0)、扩增效率(E)、循环阈值(Ct)和阈值处的扩增子数目(Nt)之间的关系为：

[0200] Nt＝N0·(1+E)Ct

[0201] 对于单个的靶核酸分子的扩增，公式简化成：

[0202] Nt＝1·(E+1)Ct........(5)

[0203] 因此，Nt可以通过在本文的标准化条件下测定参考引物的扩增效率和通过在那些标准化条件下测定通过扩增单个参考模板分子获得的Ct来计算。由于Nt是常数，并且本发明人令人惊讶地确定了在标准化测定中扩增靶标DNA分子的单拷贝的测试引物的Ct是高度精确和可再现的，并且在相同标准化条件下扩增的参考引物和模板分子提供了分析测试引物结果的可靠的有效参考点，使用公式(5)可以可靠和快速地确定测试引物的效率，其中Ct由靶标DNA的单拷贝的测试引物扩增确定，Nt由标准化参考测定计算。在公式(5)的推导中，可以使用公式(6)确定测试引物的扩增效率(Et)：

[0204] E(测试)＝Nt(参考)1/Ct(测试)–1........(6)

[0205] 其中Nt的值由参考引物扩增结果以及当扩增目的测试核酸区域的单个分子时测试引物扩增达到阈值所花费的循环数(Ct.t)确定。

[0206] 如上文详述的，本发明的方法由于意外的确定而变得甚至更有用，即使当选择使用的参考核酸模板与测试引物和目的靶标核酸表现出很少或没有同源性时，其在标准化测定中的扩增将产生与标准化测定相当的结果，标准化测定使用与测试引物和目的靶标表现出更高水平同源性的参考引物和模板进行。由此出乎意料地使得能够将给定的标准化测定应用于需要效率评估的基本上更宽范围的引物，而不仅仅是与所选参考引物和模板表现出同源性的那些引物；以及

[0207] (iv)在已知用参考引物扩增参考模板的一个拷贝的扩增效率和Ct的情况下，可以仅使用效率和Ct值快速且容易地计算在标准化测定中测试的任何测试引物的效率，因为参考和测试的Nt是相同的。更具体地，由于Nt是常数，则Er和Et(分别为参考和测试引物的扩增效率)以及Ct.r和Ct.t(分别为扩增单拷贝参考和测试模板时的阈值循环数)如下相关：

[0208] 1.(E(测试)+1)Ct(测试)＝1·(E(参考)+1)Ct(参考)

[0209] 并且因此：

[0210] E(测试)＝(E(参考)+1)Ct(参考)/Ct(测试)–1........(7)

[0211] 在一个实施方案中，扩增效率是相对于参考效率点来评估的，参考效率点是在标准化测定中通过参考引物从参考模板DNA的扩增来确定的。

[0212] 在另一个实施方案中，参考效率点是参考引物的平均Ct值，并且扩增效率评估是通过将针对目的DNA区域的正向和反向测试引物对的平均Ct值与针对参考DNA模板分子的参考正向和反向引物对的扩增确定的平均Ct值进行比较而进行的。

[0213] 在又另一个实施方案中，参考效率点为Nt(参考)，并且扩增效率评估通过使用下式中的针对目的DNA区域的正向和反向引物对的平均Ct值(Ct(测试))进行：

[0214] E(测试)＝Nt(参考)1/Ct(测试)‑1

[0215] 在还又另一个实施方案中，参考效率点为E(参考)和Ct(参考)，并且扩增效率评估通过使用下式中的针对目的DNA区域的正向和反向引物对的平均Ct值(Ct(测试))进行：

[0216] E(测试)＝(E(参考)+1)Ct(参考)/Ct(测试)‑1

[0217] 在另一个实施方案中，目的核酸区域包括SNP、点突变、超变、染色体易位、基因组基因片段重排、DNA插入、DNA缺失或断点，例如染色体断点、特定基因片段、特定区域、基因的部分或片段或基因间区。

[0218] 在还另一个实施方案中，目的核酸区域是重排的免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)DNA，更特别是重排的V、D和/或J片段。

[0219] 在又另一个实施方案中并且在V(D)J重排的背景下，目的核酸区域对应于IgH、TCRβ或TCRδ的DJ或VDJ重排。在另一个实施方案中，目的核酸区域对应于Igκ、Igλ、TCRα或TCRγ的VJ重排。

[0220] 在还又另一个实施方案中，目的核酸区域是V基因片段区域，倾向于经历超变的区域和/或编码CDR3的一部分的J基因片段区域。

[0221] 在又还另一个实施方案中，目的核酸区域针对编码全部或部分V前导序列，IgH FR1、IgH FR2或IgH FR3的基因片段区域。

[0222] 在另一个实施方案中，扩增反应是PCR。

[0223] 在另一个实施方案中，使用嵌入双链DNA的非特异性荧光染料检测通过定量PCR产生的扩增子。在另一个实施方案中，使用与报道分子如荧光报道分子可操作地连接的序列特异性DNA探针检测通过定量PCR产生的扩增子。

[0224] 在另一个实施方案中，参考核酸模板是重排的IgH基因或TCR基因。

[0225] 在另一个实施方案中，参考核酸模板是单拷贝基因，优选GALT基因。

[0226] 本发明的方法提供了一种用于评估用于定量扩增反应，特别是定量PCR的引物对的正向和反向引物中的一个或两个的效率的方法。方法避免了进行传统的和耗时的线性回归建模以评估每个目的引物的需要，并且现在提供了快速，简单和更可靠的评估效率的手段。更进一步地，通过在其中测试这些引物的标准化系统的设计和应用，在系统中测试的任何引物的效力可以直接与在系统中测试的任何其它引物比较。因此，当设计多个引物以扩增单个靶标时，可以快速和容易地鉴定最有效的引物。在另一个实例中，当试图将标准化的扩增方案的性能转移到新的仪器(例如可能在新的实验室中发生的)，或改变反应条件的某些方面时，上述的评估分析选项有助于测定的准确和简单的重新校准。例如，用于新仪器的特别简单的方法将是通过在新条件下扩增参考核酸模板，确定单个靶模板的Ct并由此计算Nt来确定阈值处的扩增子数目。然后可以相对于这些结果确定测试引物效率。由于还意外地确定了可以使用参考引物和模板进行优化和标准化的测定，参考引物和模板与目的核酸区域(例如GALT基因)显示出很少或没有同源性，因此可以在单个标准化测定的背景下测试的引物的范围是宽的，从而进一步降低了测试宽范围引物的复杂性和成本。

[0227] 因此，本方法可用于测试和选择用于诊断、预后、分类、预测疾病风险、检测疾病复发、免疫监视或监测上下文中的预防或治疗功效或可通过表达一种或多种靶核苷酸序列表征的任何疾病或非疾病状态的引物。此外，方法可应用于需要分析某些靶标DNA和RNA区域中的序列或筛选特定靶标DNA和RNA序列的存在的任何其它情况，例如用于研究和开发或PCR质量控制的情况。例如，本发明提供了科学家和生物技术工业在基因组学、药物基因组学、药物发现、食品表征和基因分型领域中寻求解决的当前和新兴需求的解决方案。

[0228] 使用淋巴样瘤形成作为非限制性实例，本发明提供了用于检测和选择在qPCR反应中使用的引物的手段，qPCR反应用于确定哺乳动物(例如人)是否具有瘤形成，取自哺乳动物的生物样本是否含有瘤细胞或源自瘤细胞的DNA，估计哺乳动物发展瘤的风险或可能性，监测抗癌治疗的功效或选择患有癌症的哺乳动物的适当治疗。这些方法基于确定淋巴样瘤形成的特征在于表达独特V(D)J重排的细胞的克隆扩增。

[0229] 本发明的方法能够设计有效的引物，其可用于评价已知或怀疑患有瘤形成的个体，或作为不一定怀疑患有瘤形成的个体的常规临床试验。此外，本发明的方法可用于评估疗程的功效。例如，抗癌治疗的功效可以通过监测患有淋巴癌的哺乳动物随时间的MRD来评估。通常，在治疗后取自哺乳动物的生物样本中特征在于特异性靶核苷酸序列的克隆群体的减少或缺失表明有效的治疗。

[0230] 本发明的方法在诸如设计患者特异性(例如MRD分析)或疾病特异性引物的应用中特别有用，其中需要不断产生新的引物以检测和扩增新的或不断突变的DNA靶标，或其中DNA靶标对于不同患者不同。在用于测试这些引物的效力的当前方法将产生可变结果或不同引物的准确测试将消耗不协调的资源的情况下，本发明的方法提供了标准化的系统，该系统使得能够客观地，一致地和快速地评估引物效率，并且必要时，与在相同系统中测试的任何其他引物的效率进行比较。因此，假定标准化的参考测定以被管理当局等认为适当的效率水平起作用，本方法使得参考实验室或内部实验室能够建立标准化的测定，然后相对于已知和批准的标准测试和证明目的引物的功效。预期参考引物和模板分子例如可以与标准化方案的细节一起提供给实验室，使得可以在任何实验室建立和验证测定。或者，可将待测试的引物送至中央参考实验室进行评估。

[0231] 因此，在另一个方面，本方法涉及用于促进针对目的核酸区域的正向和反向引物对的效率的评估的试剂盒，试剂盒包括参考正向和反向引物以及详述如本文前面定义的标准化扩增方案方法和/或最小效率结果的说明书，任选地与如上文所定义的参考核酸模板分子和适用于根据标准化方案促进参考引物扩增的试剂一起。

[0232] 本发明的其它特征在以下非限制性实施例中更充分地描述。

[0233] 实施例1

[0234] 1个拷贝Ct的标准方案的开发

[0235] 本领域技术人员将熟悉在主题方案中举例说明的扩增的一般原理。

[0236] 试剂和材料

[0237]

[0238] 反应组分/孔

[0239] 表1

[0240]  μl
水 16.45
缓冲液10X 2.5
MgCl2 50mM 2.5
dNTP 10mM 0.75
正向引物50μM 0.2
正向引物50μM 0.2
Syto 82 50μM 0.25
探针IGHJ FAMμM 0.2
Platinum Taq 5U/μl 0.2
DNA eg 2.5pg 2
最终体积 25

[0241] PCR的温度方案

[0242] 91℃3min

[0243] 97℃，15sec；72℃，30sec×5个循环

[0244] 96℃，15sec；72℃，30sec×5个循环，

[0245] 94℃，15sec；72℃，30sec×35个循环

[0246] 注

[0247] ·对于单拷贝实验，目的是在每个孔中具有约0.5‑1拷贝的靶模板的平均值，因为这将导致约39％至63％的孔为阳性。对于来自非肿瘤细胞群体的DNA，这通常可以通过等分2‑4pg DNA/孔来实现。当研究肿瘤细胞群时，肿瘤细胞可包括总细胞群的未知比例，如果是，可以进行最初的研究以确定一些孔是阳性而一些孔是阴性所需的DNA的近似质量。

[0248] ·Syto82仅在一些实验中使用，如果不使用，则用等体积的水代替。所用浓度先前已显示不抑制Ct。随着PCR的进行，Syto82监测双链DNA的累积。其是通用探针，而不是基因特异性探针。其给出了与基因特异性探针相同的结果，但偶尔阳性孔与基因特异性探针呈阴性，因此在后面的实验中省略了它的使用。

[0249] ·标准化方案的几个特征与大多数PCR方案的特征略有不同。(a)Taq浓度相对较高(b)PCR期间的变性温度优化早期循环期间基因组DNA的变性(c)退火温度高于大多数受试对象使用的温度，因为所研究的大多数引物是长引物。

[0250] ·所示探针用于IGH PCR。相关的基因特异性探针用于其它基因。阈值的设置由操作者和仪器算法进行。仪器算法将阈值设置为高于操作者，仪器阈值提供的Ct大约比使用者阈值提供的Ct大1.5。除非另有说明，显示的结果是仪器提供的结果。

[0251] 实施例2.

[0252] 确定要分析的孔的数量

[0253]

[0254] 实施例显示了选择特定孔用于计算平均Ct和分析24个孔的方法。使用观察到的阳性孔的数量和由泊松分布提供的概率计算孔源自0、1或多于1个模板的概率。例如，如果13个孔是阳性的，可能9个孔来自1个模板，4个孔来自2个或更多个模板。来源于2个或更多模板的扩增将导致比来源于1个模板的扩增更低的Ct。因此，丢弃4个最低Ct值，并根据剩余9个Ct值计算平均Ct。

[0255] 实施例3：

[0256] 从一个模板拷贝计算平均Ct

[0257]

[0258] 来自一个样本的24个等分试样在产生一些阳性和一些阴性孔的稀释液中扩增。连续列示出了：Ct结果；Ct结果按降序排列；除去任何离群值；如果在泊松概率的基础上判断结果是由一个以上拷贝的扩增产生的，则除去结果；最终平均值、标准偏差和孔数。在实施例中，有19个阳性孔，并且基于泊松概率，丢弃11个最低Ct结果，并由剩余的8个确定平均Ct值。

[0259] 实施例4.

[0260] 结果

[0261]

[0262] 本实例提供了斜率和单拷贝Ct结果的概述。对于2个参考基因中的每一个，结果是基于多个实验，每个实验涉及相同的模板序列和其相应的引物。IGH群体的结果包括来自不同患者的IGH序列以及针对每个序列的2个引物。相同的探针用于所有IGH PCR。表格的Ct结果是使用为仪器提供的软件算法确定的结果。

[0263] 应注意斜率估计和单拷贝估计之间的精度的显著差异。

[0264] 扩增效率的结果仅从斜率估计导出。

[0265] 阈值目标的结果基于扩增效率和平均单拷贝Ct。

[0266] 实施例5

[0267] 扩增效率的95％置信区间

[0268]

[0269] 表显示了各组引物扩增效率的平均值和95％置信区间。Ct结果是操作者设定的阈值确定，而不是由软件算法确定。操作者设置的阈值导致Ct比软件算法设置的Ct小约1.5个单位。IGH和TCR结果是指实验室中引物的分析研究，MRD结果是在MRD测定期间获得的数据11
的回顾性分析。从一个拷贝Ct结果和阈值扩增子数的参考值1.1×10 计算扩增效率。由于单拷贝Ct结果的变化可由随机实验误差或由引物之间的变化引起，因此对每组进行方差分析以确定引物之间的方差，并将值和平均值用于确定扩增效率的95％置信区间。

[0270] 实施例6.

[0271] 各种基因的结果

[0272]

[0273] 结果显示，当分析不同基因的引物以确定源自一个拷贝Ct和斜率的扩增效率时，观察到高度一致性。在标准化条件下扩增所有的基因靶，但对每个基因使用特异性探针。表格的Ct结果是使用为仪器提供的软件算法确定的结果。先前已经给出了IGH群体和参考的编号。GALT参考结果基于对一个拷贝Ct和斜率的22个估计，而对于其余基因，对于每一个给出的结果基于对一个拷贝Ct和斜率的每一个的至少2个估计。TCR结果是异质的，因为它们包括对TCRβ和TCRγ基因的估计，并且TCRβ的结果包括涉及针对不同靶标的3种不同探针的结果。

[0274] 本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文描述的发明易于变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。

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