[0001] 本发明属于桑树栽培领域，涉及桑树耐干旱胁迫栽培方法。

[0002] 桑树(MorusalbaL.)一直作为家蚕饲料而被大量种植，不仅仅在我国，在亚洲许多国家都有着广泛的种植面积。随着研究的深入，研究者发现桑叶中富含多种对人体有益的化合物(如白藜芦醇、氧白藜芦醇、桑椹苷)。可促进人体基质维持在健康状态，帮助人体积极应对高血压、高血糖、动脉粥样硬化等疾病。同时，桑树还具备水土保持、绿化美化环境等生态功能。

[0003] 到现在，桑树不仅仅在丝纺领域，甚至在于生态领域，食品保健领域都占据重要地位。

[0004] 干旱是限制全球作物产出的主要制约因素之一。根据相关数据预测，随着全球变暖的加剧这个问题在未来将会更加严重。干旱会损害植物的正常生长，扰乱水分关系，并降低植物的水分利用效率。

[0005] 已有现有结论表明：在干旱条件下生长的植物在生化和分子水平上面临许多挑战，这最终阻碍了植物的生长和产量。干旱胁迫扰乱光采集和利用机制，从而导致光合作用下降，对光合色素的新陈代谢产生负面影响，降低RuBisCo功能，同时扰乱光合作用设备。叶绿体结构的破坏也对干旱条件下生长的植物的光合作用能力产生负面影响。干旱对细胞间二氧化碳水平产生负面影响，这将减少光合作用电子传输成分，从而增强ROS的生成，导致光合作用设备中断。致使PSII的光合作用速率、气孔电导率、蒸腾速率、光化学效率和光合作用电子传输速率降低。缺水条件下的气孔关闭受内源性水平的调节，脱落酸(ABA)作为信号分子，调节各种生理和分子过程的级联。ABA的这种生物合成的增强是由ABA生物合成基因NCED3(9‑顺式环氧类胡萝卜素二氧合酶3)上调引起的。在干旱胁迫下，组蛋白H1‑S的表达得到增强，这种蛋白质促进气孔的闭合。此外，ABA还充当细胞信号通路的主要信使，进一2+
步加速ROS的生成，然后作为次要信使的细胞质Ca 的积累增加，刺激其他信号级联在分子水平上调节植物过程。

[0006] 干旱胁迫降低了植物的水位和相对含水量。水位下降进一步导致氮、磷和钾等各种必需矿物质的摄入量减少。缺水条件对氮转运体和氮代谢有负面影响。这是由于在干旱胁迫下AMT(氨转运体)、NRT(硝酸盐转运体)、NR(硝酸盐还原酶)、NiR(亚硝酸盐还原酶)、GS(谷氨酰胺合成酶)和GOGAT(谷氨酸合成酶)等基因的下调。此外，在缺水条件下生长的植物中，营养摄取量减少，其迁移到目标地点的效率将会降低。

[0007] 干旱应激导致ROS的生产和清除之间的不平衡，导致植物细胞的氧化应激反应。ROS清除失败致使ROS在植物细胞中过度积累，导致蛋白质氧化、脂质膜过氧化和遗传物质受损。ROS水平的升高还会导致二氧化碳固定效率下降，同时光呼吸增强。为了抵消干旱引起的氧化应激的负面影响，植物的酶和非酶抗氧化剂协同工作，提供抗旱性。然而，严重的干旱导致氧化还原稳态不平衡，这主要是由于抗氧化防御系统的效率下降引起的。据报道，在高干旱条件下，过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等酶的活性会下降。可溶性糖、脯氨酸和甘氨酸甜菜碱等各种溶胶的产生也有所增强，导致这些化合物的更多积累，这些化合物在干旱胁迫下起到渗透保护剂的作用。这些渗透液有助于保持叶片杂质，从而产生高效的气孔传导，然后叶子更好地摄入二氧化碳，根部摄入水分。增强的渗透保护剂积累是由于参与渗透溶质、水通道蛋白、LEA蛋白生物合成的基因的上调，以及各种重要转录因子的调节。

[0008] 目前国内外对桑树耐旱性进行了一些研究。例如，桑椹中的谷氨酸脱氢酶(GDH)可以提高转基因烟草中的蛋白质溶解度和叶绿素含量，从而提高转基因植物的耐旱性。叶绿体下降诱导的应激蛋白(MaCDSP32)可以通过调节SOD的活性和脯氨酸和可溶性糖的浓度来提高植物的耐旱性。拟南芥中活化C激酶1(Rack1)蛋白受体的过度表达降低了转基因植物的耐旱性，这可能是干旱胁迫的负调节因子。这些研究主要集中在某些特定基因对植物耐旱性的调控，没有在全基因组水平上鉴定干旱反应转录本，并未揭示了增强植物耐旱性的不同代谢途径之间的相互作用。

[0009] 现有技术中，桑树栽培中的抗干旱技术对策，主要在于桑园建园、水肥管理、覆盖地膜保水、套种保水、保水剂保水等常规抗旱措施，这些措施都需要在干旱发生前就要预先开展。现有技术中，也有施用多效挫、比久和矮壮素等抗旱，但它们都是抑制剂，对桑树的生长具有负面的影响。

[0037] 为说明褪黑素对桑树抗旱能力的提升效果，下面结合具体实施例进行说明。

[0038] 本实施例既说明了使用提高桑树耐干旱胁迫能力的方法，也说明了褪黑素在提高桑树耐干旱胁迫能力中的应用。

[0039] 为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。

[0040] 本实施例中，是以全国广泛推广的浙江白桑作为试验材料。对其外源施加褪黑素，通过测量生理指标，分析计算褪黑素对于桑树响应干旱胁迫时生理的影响。实施例使用测试仪器包括植物多酚‑叶绿素测量计DUALEXSCIENTIFIC+，光合测定仪，烧杯，广口瓶，培养皿，量筒，定性滤纸，喷壶，分析天平，吸水纸，干燥箱，纯水机等系列仪器设备。使用的试剂包括去离子水，冰醋酸，甲醛，无水乙醇，叔丁醇，DAB染色剂，NBT染色剂等。

[0041] 使用MicrosoftExcel软件统计处理实验数据，并采用SPSS22统计软件对数据进行显著性分析。

[0042] 白桑嫁接苗种植于盆口直径30厘米，高28厘米的塑料花盆中，所用基质为草炭和珍珠岩的混合基质。

[0043] 所有嫁接苗均种植在成都理工大学实验基地(104°04′e.30°64′n)中，并进行日常的养护管理。从基地中选择9株生长良好且生长较为一致的植株(株高：65±1cm，一年生枝条直径0.225±0.025cm，修剪为自然开心型)，分为3组，每组3棵。从中选择一组，用100μM的褪黑素(微量无水乙醇溶解)喷施白桑叶片，每天下午19:00喷施一次，持续三天；另外两组，用含有等体积无水乙醇的去离子水喷施白桑叶片。具体试验分组及处理如下：

[0044] (1)正常浇水组(W)，即对照组：提前喷施去离子水(含有等体积的褪黑素溶剂无水乙醇)，在正常浇水条件下生长；

[0045] (2)干旱处理组(D)：即干旱组，对提前喷施去离子水(含有等体积的褪黑素溶剂无水乙醇)的白桑植株进行自然干旱胁迫；

[0046] (3)褪黑素处理组(M+D)：即褪黑素加干旱组，褪黑素预处理的白桑植株进行干旱胁迫，提前喷施100μM(微量无水乙醇溶解)褪黑素的白桑进行自然干旱胁迫。1μM＝1μmol/L。

[0047] 4月18日进行第一次测定，随后进行干旱处理。

[0048] 分别在第5日(4月23日)，第10日(4月28日)，第15日(5月3日)对各处理进行各项测定。然后对所有植株进行浇水，复水5天后(5月9日)再次进行数据测定，分析复水后桑树恢复情况。每次处理设置三次生物学重复，三次技术重复。

[0049] 1土壤相对含水量测定

[0050] 土壤含水率在本次实验中是衡量植株是否受到干旱胁迫的重要指标。土壤相对含水量的测定采用称重法和仪器测定，预实验根据土壤相对含水量＝(土样湿重‑土样干重)/(土样饱和重‑土样干重)×100％。参考刘康(2017)中土壤相对含水量测定的方法。分别测定土样湿重，土样干重和土样饱和重，并利用公式算出土壤相对含水量。每次重复3次，得出数值与仪器测定值差异后在之后实验中用仪器进行测定。

[0051] 土壤含水量测定结果见图1。

[0052] 从图1可以看到，对照组(W)由于每天进行喷灌处理，含水率一直处于50％以上，显著性差异不明显，很显然未受到干旱胁迫的条件。

[0053] 而另外两组从预处理结束后，再未浇水。在干旱处理的第5天，两组含水率就显著下降，到第10天，含水率继续保持显著下降趋势，降到了20％左右；到15天时，显著差异分析发现下降趋势得以缓解，这时两组含水率均在18％左右。数据显示两组均已受到干旱胁迫。

[0054] 复水5天后进行测定，发现干旱处理的两组土壤含水率显著上升，已经恢复到40％多。

[0055] 2叶片相对含水量测定

[0056] 叶片含水率很大程度上反映了植株活性。首先进行表型观察，再进行实验测定。

[0057] 各处理桑树叶片表型如图2所示。

[0058] 从叶片表型来看，与对照组(W)相比：

[0059] 褪黑素处理组(D+W)叶片呈现略有萎蔫状态，不过萎蔫情况不是太严重；

[0060] 干旱处理组(D)的桑树叶片则萎蔫的十分严重，肉眼可见。

[0061] 此外，在叶片颜色方面褪黑素处理组(D+W)、干旱处理组(D)两组均无太大差别，都呈现青黄色。在对桑树进行复水处理后，叶片萎蔫情况得到了改善，叶片的颜色也从之前的青黄色变为了浓厚的青绿色。

[0062] 每隔5天从每组中选取两枚叶片进行含水率测定。叶片的相对含水量测定先测试叶片鲜重(FW)，即在叶片剪下后立即称量记数。随后将叶片放入去离子水中8h，使其吸足水分，擦干多余水分后，进行称重，此时叶片含水率近乎100％。为饱和状态重量，记为TW；然后放入烘箱，80℃烘干12h，此时叶片含水率近乎0％。为干重，记为DW。然后利用公式RWC＝(FW‑DW)/(TW‑FW)×100％，计算出叶片含水率。

[0063] 叶片含水量测定结果见图3。

[0064] 从图3可以看出，对照组(W)未受到干旱胁迫，所以叶片含水率波动不大，始终稳定在90％以上，显著性差异并不明显。

[0065] 褪黑素处理组(D+W)则随着干旱处理天数的增加，自身受到的胁迫越发严重，在第5天测定时，可能由于干旱胁迫时间较短，所以叶片含水率未有显著变化；到第10天根据显著差异分析发现，叶片含水率显著下调，显然已充分受到干旱胁迫影响。随着时间延迟，到第15天测定时，褪黑素处理组(D+W)含水率下降幅度逐步降低，已经趋于稳定。

[0066] 干旱处理组(D)则随着时间延迟叶片含水率越来越低，且在处理第10天到15天含水率下降幅度并未得到遏制，显著性差异依然明显。到15天时，叶片含水率降到最低。

[0067] 在复水后，褪黑素处理组(D+W)和干旱处理组(D)叶片含水率迅速提升，褪黑素处理组(D+W)的含水率高于干旱处理组(D)和对照组(W)。

[0068] 3叶绿素含量测定

[0069] 叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，在光合作用的光吸收中，叶绿素起着核心作用。叶绿素测定使用植物多酚‑叶绿素测量计DUALEXSCIENTIFIC+进行，每盆植株选择3枚叶片，记号。每次在同一枚叶片上选取不同位置测定3次，以后每次测定在记号叶片进行。

[0070] 叶绿素含量测定结果见图4。

[0071] 从图4可以看出，对照组(W)、褪黑素处理组(D+W)以及干旱处理组(D)叶绿素测定含量相差不大。干旱处理组(D)与对照组(W)未出现明显显著差异。

[0072] 但褪黑素处理组(D+W)叶绿素却稳步上升，在干旱处理第10d到15d显著上升，在干旱胁迫处理中，第0d的最低叶绿素含量到第15d的最高叶绿素含量。

[0073] 各组在复水处理后叶绿素含量也未有显著变化。

[0074] 4活性氧等积累的观察

[0075] 干旱胁迫容易导致活性氧的过量积累，而植物细胞内积累过多的活性氧将会导致细胞膜系统受损和细胞内部稳态的改变。发明人于干旱处理第10d对三组叶片进行DAB和2‑
NBT组织化学染色，以检测桑树叶片的H2O2和O 含量。

[0076] (1)DAB染色：将50mgDAB‑4HCl溶于50mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，配成DAB染色液。然后将新鲜采集的叶片浸入DAB染色液中染色8h，染色完成后，使用75％乙醇进行脱色处理，等到脱色完全后，进行观察和拍照。

[0077] (2)NBT染色：将0.1gNBT溶解在50mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)中，得到0.2％的NBT染色溶液，现用现配。将新鲜采摘的叶片放入NBT染色液中染色8h，待到染色完全后，用75％乙醇脱色完全后进行观察和拍照。

[0078] 染色结果如图5所示。图5中，a代表DAB染色处理，b代表NBT染色处理。

[0079] 染色结果表明，褪黑素处理组和干旱处理组的植株均积累了一定量的H2O2和O2‑。2‑
但是经过褪黑素处理组的桑树叶片H2O2和O 的含量比干旱处理组的桑树叶片低很多。说明褪黑素可以帮助桑树清除体内的活性氧。

[0080] 5花青素、类黄酮等测定

[0081] 植物在受到干旱胁迫时会释放出类黄酮，以便清理体内的自由基，延缓自身衰老。花青素主要表现在让植物拥有色彩，其属于生物类黄酮组织。

[0082] 使用植物多酚‑叶绿素测量计DUALEXSCIENTIFIC+进行，每盆植株选择3枚叶片，记号。每次在同一枚叶片上选取不同位置测定3次，求其平均值。以后每次测定在记号叶片进行。类黄酮含量测定结果见图6。花青素含量测定结果见图7。

[0083] 从图6可以看出，随着干旱胁迫时间的延长，为了延缓自身的衰老，干旱处理组(D)类黄酮含量不断上升。而对照组(W)含量则处于一个较为平稳的情况，显著性差异不明显。至于褪黑素处理组(D+W)也略有上升，但幅度显然不如干旱处理组(D)。且让人预料不到的是，褪黑素处理组(D+W)类黄酮含量甚至比对照组(W)还要低。

[0084] 从图7可以看出，由于叶片自身老化加上桑树利用体内花青素清除自由基，发明人测定的桑树叶片内花青素含量都呈下降趋势，三组处理中花青素下降的差异显著性较为明显。不过随着时间推移，褪黑素处理组(D+W)花青素含量逐渐成为最高，而干旱处理组(D)含量成为最低。

[0085] 在复水后，各组花青素含量依旧持续降低。

[0086] 6光合速率测定

[0087] 光合速率反应的是光合作用强弱。光合速率越高，光合作用越强。反之亦然。

[0088] 光合速率采用光合测定仪进行测定，与叶绿素选取叶片及测定量一致。每盆植株选择3枚叶片，记号。每次在同一枚叶片上选取不同位置测定3次，以后每次测定在记号叶片进行。测定结果见图8。

[0089] 从图8可以看出，施加褪黑素能够提高桑叶光合作用效率。在第5d，干旱胁迫效应不明显的情况下，褪黑素处理组(D+W)的光合速率明显高于对照组。干旱胁迫对光合效率具有负面影响，但褪黑素处理组(D+W)的光合速率始终高于干旱处理组(D)，在后期复水恢复后褪黑素处理组(D+W)的光合效率恢复程度也高于干旱处理组(D)。

[0090] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。