技术领域
[0001] 本申请涉及生化检验和体外诊断领域，特别涉及一种肝素测定的试剂盒、应用及其制备方法。
相关背景技术
[0002] 肝素是由二种多糖交替连接而成的多聚体，无论在体内还是体外，均具有很强的抗凝作用，临床上把它作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。
[0003] 肝素作为药物，其活性功能的精准检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。作为生物活性物质，其检测不能单单用化学或物理的方法，必须与生物检测法结合，目前肝素的活性测定多采用凝固法和发色底物法。凝固法操作繁琐，耗时费力，精准性很差。相对于凝固法，发色底物法具有灵敏度高，操作简便的特点且检测范围更广。
[0004] 利用发色底物法的原理产生了一些肝素活性测定方法。然而传统肝素测定的试剂盒的价格较贵，且检测结果的准确性较低。
具体实施方式
[0032] 下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0033] 需要说明，若本申请实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
[0034] 另外，若本申请实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本申请要求的保护范围之内。
[0035] 普通肝素(unfractionated heparin，UFH)首先从肝脏发现而得名，是由糖醛酸链和葡萄胺链交替组成的多糖链混合物，带负电荷，平均分子量15000D。天然肝素主要存在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜中提取，是动物体内一种天然抗凝血物质，它主要通过增强抗凝血酶III与凝血酶的结合能力，加速凝血酶的失活从而发挥抗凝作用，在体内外都有效果。
[0036] 低分子肝素(LMWH，low molecular weight heparin，LMWH)是以UFH为原料，用物理、化学等方法将其分解或降解所得，其分子量约为UFH的三分之一。与UFH相比，LMWH戊糖链较短，抑制凝血酶的能力减弱，抑制Xa：IIa的比例升高，并且LMWH半衰期更长，具有较好的生物利用度，不易发生HIT(Heparin‑induced thrombocyttopenia，肝素诱导的血小板减少症)，大大的提升了使用的方便性和安全性。
[0037] 为了克服传统口服抗凝药的不足，成功研发了特异性更高的直接口服抗凝药(DOACs)，DOACs在使用过程中仅作用于凝血机制中的某一单个凝血因子，在保证抗凝效果的同时，使用更加方便安全。DOACs主要分为两大类：直接凝血酶抑制剂和直接Xa因子抑制剂。直接Xa因子抑制剂即通过与Xa因子的活性位点结合，阻止凝血酶原转变为凝血酶从而发挥抗凝作用，目前国内应用最广泛的直接Xa因子抑制剂为利伐沙班。
[0038] 肝素活性测定是监测UFH、LMWH和利伐沙班抗凝效果的推荐检测方法，在肝素活性测定的方法学中，发色底物法的灵敏度高、准确性好，能够精准地反映病人体内抗Xa活性，且适用于多种自动化分析仪器，在临床中的应用已经非常普遍。抗Xa活性测定的发色底物法主要通过向待测血浆中添加过量的Xa，在病人血浆中残存的肝素与AT‑III(antithrombin‑III，抗凝血酶Ⅲ)结合形成复合物，成比例地消耗已加入的Xa，剩余的Xa作用于发色底物，显色程度与剩余Xa的量呈正相关，而与血浆中肝素含量呈负相关。
[0039] 本申请提供一种肝素测定的试剂盒(以下简称“试剂盒”)，通过使用牛的活化X因子(以下简称“牛Xa”)及发色底物来检测血浆中UFH，LMWH及利伐沙班的浓度，为病人的抗凝治疗提供有效监测。本申请的试剂盒使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好。可以实现对进口抗Xa活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求。
[0040] 下面对本试剂盒的组分进行详细介绍。
[0041] 本申请的肝素测定的试剂盒包括试剂R1，其中试剂R1包括潘生丁。通过添加潘生丁来降低血浆中游离PF4(Platelet Factor‑4，血小板第四因子)的影响，防止干扰肝素与抗凝血酶Ⅲ的结合，提高肝素测量的准确性。
[0042] 本申请的试剂盒中通过潘生丁替代现有技术中的硫酸葡聚糖，潘生丁和硫酸葡聚糖虽然都能降低血浆中游离PF4的影响，但是两者作用机制并不相同。具体地，硫酸葡聚糖减小PF4影响的机制为：PF4能够与无支链多糖(硫酸葡聚糖等)或聚阴离子形成复合物，从而减小血浆中游离的PF4。潘生丁减小PF4影响的机制为：潘生丁抑制血小板内磷酸二酯酶，阻止CAMP(cyclic adenosine monophosphate，环磷酸腺苷)分解成无活性的5'‑AMP(Adenosine 5'‑monophosphate，5′‑磷酸胞苷)，使细胞内CAMP浓度增加，抑制钙离子活化，降低血小板功能，并且对血小板的颗粒释放物有中和效果，从而起到中和血浆中游离PF4的作用。可见，潘生丁和硫酸葡聚糖的作用机理不同。
[0043] 而且，市场上潘生丁的价格大约为104元/10g，而硫酸葡聚糖的价格为1066元/10g，潘生丁的价格仅为硫酸葡聚糖价格的十分之一，因此，潘生丁的价格低廉，能够降低试剂盒的生产成本。
[0044] 本申请创新性地将潘生丁应用到肝素测定的试剂盒中，不仅能够提高肝素测量的准确性，而且还能大幅降低试剂盒的生产成本。
[0045] 进一步地，试剂R1还包括第一缓冲液、牛Xa因子、第一稳定剂和第一防腐剂。
[0046] 试剂盒还包括试剂R2和稀释液。试剂R2包括：第二缓冲液、发色底物、第二稳定剂和第二防腐剂。稀释液包括：第三缓冲液、第三稳定剂和第三防腐剂。
[0047] 本实施例中，第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液可以均为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)。通过使用该特定的缓冲体系能够提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。
[0048] 在其他实施例中，第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液还可以为Hepes缓冲液或者PBS(phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲盐溶液)缓冲液。
[0049] 进一步地，试剂R1中，第一稳定剂可以包括第一蛋白酶保护剂，用于延长试剂盒的稳定性，利于试剂盒的长期使用和存储。具体地，第一蛋白酶保护剂可以包括Prionex。
[0050] 第一稳定剂还可以包括：吐温‑20、蔗糖、甘露醇、氯化钠和PEG(polyethylene glycol，聚乙二醇)。
[0051] 第一稳定剂中的Prionex对蛋白酶起到最主要的保护作用，吐温‑20、蔗糖、半乳糖、甘露醇和PEG，对蛋白酶也能起到一定的保护作用，以提高试剂盒的稳定性。
[0052] 在其他实施例中，第一稳定剂可以包括温‑20、蔗糖、甘露醇、氯化钠和聚乙二醇中至少一种，以提高试剂盒的稳定性。
[0053] 试剂R1中发色底物可以为发色底物5288，第一防腐剂可以为Proclin‑300。
[0054] 试剂R2中的第二稳定剂包括甘露醇、半乳糖、PVP(polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)。第二防腐剂可以为Proclin‑300。
[0055] 稀释液中的第三稳定剂包括氯化钠和第二蛋白酶保护剂，第二蛋白酶保护剂可以为Prionex，Prionex用于延长试剂盒的稳定性，利于试剂盒的长期使用和存储。第三防腐剂可以为Proclin‑300。
[0056] 上述实施例中，试剂R1、试剂R2和稀释液可以均为液态。使用前无需复溶，利于客户的操作。
[0057] 在一些实施例中，试剂盒中R1、试剂R2及稀释液的组成及相应的比例如表1所示。
[0058] 表1 三种试剂的成分表
[0059]
[0060] 如表1所示，试剂R1、试剂R2及稀释液中的tris缓冲液的浓度为50～100mmol/L。
[0061] 潘生丁的质量与试剂R1的质量百分比为0.1％～0.5％，比如，潘生丁的质量与试剂R1的质量百分比为0.1％、0.2％、0.3％或者0.5％等。
[0062] Prionex的质量与试剂R1的质量百分比为0.5～1.5％，比如，Prionex的质量与试剂R1的质量百分比为0.5％、0.7％、0.9％、1.2％或者1.5％等。
[0063] 试剂R1、试剂R2及稀释液的pH值均为7.2～7.6。
[0064] 试剂R1中牛Xa的含量为1～5IU/mL，比如，试剂R1中牛Xa的含量为1IU/mL、2IU/mL、4IU/mL或者5IU/mL等。
[0065] 上述实施例中通过使用牛Xa及发色底物来检测样本中UFH、LMWH及利伐沙班的浓度，为病人的抗凝治疗提供有效监测。样本可以是全血或者血浆。上述实施例通过使用特定的缓冲体系来增加试剂灵敏度，添加潘生丁来降低体内游离PF4的影响，通过加入蛋白酶保护剂来提高试剂盒的稳定性。
[0066] 本申请还提供一种肝素测定的试剂盒在凝血检测中的应用，关于试剂盒的组成请参阅上述任一实施例的介绍，在此不再赘述。
[0067] 进一步地，本申请还提供一种肝素测定的试剂盒的制备方法，具体地，如图1所示，该制备方法包括：
[0068] S11：通过潘生丁制备试剂R1。
[0069] 制备试剂R1，具体地，通过潘生丁制备试剂R1，关于潘生丁的介绍，请参阅上述实施例的介绍，在此不再赘述。
[0070] 进一步地，可以将第一缓冲液、潘生丁、牛的活化X因子、第一稳定剂和第一防腐剂按照上述表1所示的配方比例进行混匀，以得到试剂R1。其中关于第一缓冲、牛的活化X因子、第一稳定剂和第一防腐剂的介绍请参阅上述实施例的介绍，请参阅上述实施例的介绍，在此不再赘述。
[0071] S12：制备试剂R2。
[0072] 通过将第二缓冲液、发色底物、第二稳定剂和第二防腐剂混合搅拌，以制备试剂R2，关于试剂R2的组成及比例请参阅上述实施例的介绍，在此不再赘述。
[0073] S13：制备稀释液。
[0074] 将第三缓冲液、第三稳定剂和第三防腐剂混合搅拌以制备稀释液，具体组成及配比请参阅上述实施例的介绍在此不再赘述。
[0075] S14：将试剂R1、试剂R2和稀释液进行分装、装盒得到试剂盒。
[0076] 将上述步骤S11、S12和S13得到的试剂R1、试剂R2和稀释液进行分装、装盒以得到试剂盒。
[0077] 本申请的试剂盒的制备方法简单，成本较低，稳定性较高，且能提高检测的准确性。
[0078] 以下通过实验检验本申请提供试剂盒的效果，其具体步骤如下：
[0079] 本申请实施例1、实施例2和实施例3中的试剂盒各组分如表2、表3和表4所示：
[0080] 表2 实施例1‑试剂盒各组分配方
[0081]
[0082]
[0083] 注：“/”表示不含此成分。
[0084] 表3 实施例2‑试剂盒各组分配方
[0085]
[0086] 注：“/”表示不含此成分。
[0087] 表4 实施例3‑试剂盒各组分配方
[0088]
[0089]
[0090] 注：“/”表示不含此成分。
[0091] 设置对比例作为对照组，具体地，对比例1～3与实施例1～3的区别如下：
[0092] 对比例1中试剂R2与实施例1～3的区别在于，对比例1试剂R1、试剂R2以及稀释液中缓冲液为Hepes缓冲液，其他均与实施例1相同。
[0093] 对比例2试剂R2与实施例1～3的区别在于，对比例1试剂R1中不含潘生丁，试剂R2及稀释液均与实施例1相同。
[0094] 对比例3试剂R2与实施例1～3的区别在于，对比例1试剂R1中不含Prionex，试剂R2及稀释液均与实施例1相同。
[0095] 实施例1～3以及对比例1～3的活性测定试剂盒进行定标、空白限、准确度、线性范围、重复性、稳定性以及临床相关性测试。
[0096] (1)定标及其结果
[0097] 采用实施例1～3以及对比例1的试剂盒在全自动凝血分析仪上搭配UFH、LMWH以及利伐沙班校准品，完成UFH、LMWH以及利伐沙班项目的校准。每个项目校准品包含C1、C2、C3、C4、C5共5个浓度水平(C1～C5浓度依次升高)，定标结果如表5～表8所示。定标结果应符合要求：定标曲线的线性回归方程r≥0.980。
[0098] 表5 实施例1的试剂盒的定标结果
[0099]
[0100]
[0101] 表6 实施例2的试剂盒的定标结果
[0102]
[0103] 表7 实施例3的试剂盒的定标结果
[0104]
[0105]
[0106] 表8 对比例1的试剂盒的定标结果
[0107]
[0108]
[0109] 从表5～8的测试结果发现，实施例1～3定标曲线性回归方程的r均≥0.980，符合要求，证明实施例1～3能得到较好的定标曲线。对比例1定标曲线性回归方程的r均＜0.980，相邻校准品的OD(optical density，吸光度)值没有明显差异，影响试剂的灵敏度和定标曲线的绘制。
[0110] (2)空白限测试及其结果
[0111] 采用实施例1～3的试剂盒测定空白样本20次，按照以下的公式(1)和公式(2)计算平均值 标准差(SD)以及空白限 测试结果如表9～11所示。测试结果应符合要求：UFH和LMWH项目的空白限应≤0.05IU/mL，利伐沙班项目的空白限应≤20ng/mL。
[0112] 公式(1)： 公式(2)：
[0113] 式中：
[0114] ——测试结果的平均值；
[0115] xi——每次的实测值；
[0116] n——测试的次数；
[0117] i——测试的序号；
[0118] B——相对偏差；
[0119] SD——标准差。
[0120] 表9 实施例1的试剂盒的空白限测试结果
[0121]
[0122]
[0123] 表10 实施例2的试剂盒的空白限测试结果
[0124]
[0125] 表11 实施例3的试剂盒的空白限测试结果
[0126]
[0127]
[0128] 从表9～11的测试结果发现，实施例1‑3均符合所规定的空白限要求。
[0129] (3)准确度测试及其结果
[0130] 采用实施例1～3以及对比例2的试剂盒分别测定UFH正确度控制品、LMWH正确度控制品、利伐沙班正确度控制品，每个正确度控制品重复测试3次，按照公式(1)和(3)计算相对偏差，测试结果如表12～15所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±10.00％范围内。
[0131] 公式(3)：
[0132] 式中：
[0133] T——正确度控制品标示值；
[0134] B——相对偏差。
[0135] 表12 实施例1的试剂盒的准确度测试结果
[0136]
[0137]
[0138] 表13 实施例2的试剂盒的准确度测试结果
[0139]
[0140] 表14 实施例3的试剂盒的准确度测试结果
[0141]
[0142] 表15 对比例2的试剂盒的准确度测试结果
[0143]
[0144]
[0145] 从表12～15的测试结果发现，实施例1‑3的相对偏差比较低，证明实施例1‑3都具有很好的准确性。对比例2的相对偏差不符合均在±10.0％范围内的要求，对比例2受样本中游离PF4的干扰，影响肝素与抗凝血酶III的结合，从而导致肝素测试结果不准。因此，对比例2的准确性不如实施例1～3。
[0146] (4)线性范围测试及其结果
[0147] 将接近试剂盒线性范围上限的UFH高值样本、LMWH高值样本及利伐沙班高值样本，分别稀释成5个不同浓度的样本，对每个浓度的样本测试3次，以理论浓度为(xi)，实测结果均值为(yi)，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(r)，测试结果如表16～18所示。测试结果应符合要求：UFH在0.1‑1.5U/mL，LMWH在0.1‑2.0IU/mL及利伐沙班在30‑500ng/mL的线性范围内时，线性相关系数r≥0.990。
[0148] 表16 实施例1的试剂盒的线性范围测试结果
[0149]
[0150]
[0151] 表17 实施例2的试剂盒的线性范围测试结果
[0152]
[0153] 表18 实施例3的试剂盒的线性范围测试结果
[0154]
[0155]
[0156] 从表16～18的测试结果发现，实施例1～3均符合上述线性范围要求。
[0157] (5)重复性测试及其结果
[0158] 采用实施例1～3的试剂盒，测试UFH低值和高值质控品、LMWH低值和高值质控品、利伐沙班低值和高值质控品各10次。按照公式(1)和(2)计算测试结果平均值平均值 和标准差(SD)，按照公式(4)计算变异系数(CV)，测试结果如表19～21所示。测试结果应符合要求：UFH低值质控品、LMWH低值质控品、利伐沙班低值质控品变异系数(CV)≤10％；UFH高值质控品、LMWH高值质控品、利伐沙班高值质控品变异系数(CV)≤8％。
[0159] 公式(4)： 式中：CV为变异系数。
[0160] 表19 实施例1的试剂盒的重复性测试结果
[0161]
[0162]
[0163] 表20 实施例2的试剂盒的重复性测试结果
[0164]
[0165] 表21 实施例3的试剂盒的重复性测试结果
[0166]
[0167]
[0168] 从表19～21的测试结果发现，实施例1‑3均符合上述重复性要求。
[0169] (6)稳定性测试及其结果
[0170] 开瓶稳定性：将实施例1～3的试剂盒中的试剂R1，试剂R2及稀释液开瓶后置于2～8℃储存，在第0天、第30天、第60天、第80天、第85天，第90天、第95天进行准确度测试，测试结果如表22～24所示。测试结果应符合要求：试剂盒中试剂R1，试剂R2及稀释液开瓶后置于
2～8℃储存可以稳定90天，即相对偏差应在±10％范围内。
[0171] 表22 实施例1的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
[0172]
[0173] 表23 实施例2的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
[0174]
[0175] 表24 实施例3的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
[0176]
[0177]
[0178] 从表22～24的测试结果发现，实施例1～3符合上述开瓶稳定性要求。
[0179] 加速稳定性：将实施例1～3以及对比例3的试剂盒中的试剂R1，试剂R2及稀释液在未开封状态下置于37℃储存，在第0天、第8天、第12天、第16天、第20天进行准确度测试，测试结果如表25～28所示。测试结果应符合要求：试剂盒中试剂R1，试剂R2及稀释液在未开封状态下置于37℃储存可以稳定16天，即相对偏差应在±10％范围内。
[0180] 表25 实施例1的试剂盒的加速稳定性测试结果
[0181]
[0182] 表26 实施例2的试剂盒的加速稳定性测试结果
[0183]
[0184] 表27 实施例3的试剂盒的加速稳定性测试结果
[0185]
[0186] 表28 对比例3的试剂盒的加速稳定性测试结果
[0187]
[0188] 从表25～28的测试结果发现，实施例1‑3符合上述加速稳定性要求，未添加蛋白酶稳定剂的对比例3不符合上述加速稳定性要求，相比于对比例3，实施例1‑3的试剂盒具有更高的加速稳定性。
[0189] (7)临床相关性测试及其结果
[0190] 采用参比试剂盒和实施例1‑3的试剂盒同时测试一组覆盖线性范围的临床样本(40例)，以参比试剂盒的实测值为x轴，实施例1‑3试剂盒的实测值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表29‑31和图2‑10所示。测试结果应符合要求：线性回归分析应符合线性回归方程的斜率k在0.9～1.1之间且相关系数r≥0.975。
[0191] 表29 对比例1的试剂盒的临床相关性测试结果
[0192]
[0193]
[0194] 表30 对比例2的试剂盒的临床相关性测试结果
[0195]
[0196]
[0197] 表31 对比例3的试剂盒的临床相关性测试结果
[0198]
[0199]
[0200] 从表29‑31 的测试结果和图2‑10发现，线性回归分析符合线性回归方程的斜率k在0.9～1.1之间且相关系数r≥0.975。比如，计算参比试剂盒和实施例1测试UFH样本的相关性，计算两者的相关系数，并进行线性回归；其检测结果见图2所示，两种试剂盒测试UFH样本的相关系数，r＝0.992，线性回归方程为y＝1.0414‑0.0219，线性回归方程的斜率k在0.9～1.1之间且相关系数r≥0.975，符合要求。
[0201] 因此，实施例1‑3的试剂盒与参比试剂盒测试临床样本的结果做线性回归分析，线性回归方程的斜率k及相关性r均符合要求，证明实施例1‑3的试剂盒与参比试剂盒具有良好的相关性。
[0202] 综上所述，本申请的试剂盒通过使用tris缓冲液能够提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。通过添加潘生丁来降低体内游离PF4的影响，防止干扰肝素与抗凝血酶III的结合，导致肝素测量不准的情况。通过加入Prionex来有效延长试剂盒的稳定性，有利于试剂盒的长期使用和储存。本申请的试剂盒为全液态试剂，使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好。可以实现对进口肝素测定试剂盒的替代，能够充分满足临床检验的需求。
[0203] 以上仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
