[0001] 本发明涉及药物应用领域，特别是忧遁草总黄酮在制备抗心力衰竭药物中的应用。

[0002] 随着社会经济的快速发展，国民生活方式发生了巨大的改变，居民不健康的生活方式导致心血管疾病对居民健康的影响也越来越重要，心血管疾病的发病率持续增加。心力衰竭是心脏疾病末期表现，并伴随着心脏的结构重构和电重构，而这两种重构又会加重心力衰竭。心脏结构重构是指各种因素影响下，心脏出现结构改变。心脏电重构是指心力衰竭的多种病理或生理因素出现各种形式的适应性电功能改变。心脏的结构重构和电重构是互相影响的，在心力衰竭发生初期起到代偿作用，而后又会加重心力衰竭。

[0003] 心力衰竭结构重构的表象之一是心肌肥厚，我们可以通过改善心肌肥厚从而影响心力衰竭结构重构。常用的抗心力衰竭药物主要是血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、钙拮抗剂以及β‑肾上腺素受体拮抗剂等。虽然这些药物有一定疗效但最终并不能完全阻止心衰的进一步恶化。

[0004] 近年来，在心血管疾病治疗和预防中，天然药物备受关注。忧遁草(ClinacanthusnutansCN)又名鳄嘴花，是爵床科鳄嘴花属植物，其广泛分布马来西亚、越南等热带、亚热带地区以及我国海南、云南和广东等地区。全株入药，味甘、辛、微苦、性平，入肝、肾经，具有清热解毒、散瘀消肿、消炎解酒、防癌抗癌等作用。化学分析发现忧遁草叶中含有甾醇、三萜、黄酮、多肽等化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、心血管保护等药理活性。

[0005] 目前，国内外对于忧遁草药理活性的研究报道较少，这些研究报道大多集中在抗肿瘤、抗氧化等方面。如公布号为CN107648289A的中国专利申请公开了忧遁草提取物的制备及其在抗肿瘤方面的应用，该提取物通过体外细胞毒活性试验发现对人白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌细胞具有显著的抑制作用，具有较好的抗肿瘤活性。再如公布号为CN114989248A的中国专利申请公开了一种具有抗炎抗氧化活性的忧遁草多肽及其制备方和应用，忧遁草多肽具有很好的抗炎活性及抗氧化活性。针对忧遁草提取物对于心血管方面的作用鲜有报道，对于其抗心肌肥厚作用更是未见报道。目前，也尚未有忧遁草提取物在制备抗心力衰竭药物方面的应用的报道。本申请首次发现忧遁草提取物主要是忧遁草总黄酮提取物具有显著地治疗心力衰竭的作用，忧遁草具有开发成抗心力衰竭药物的潜在价值。

[0028] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

[0029] 实施例1忧遁草总黄酮的制备

[0030] 将干燥的忧遁草叶粉碎机粉碎，用75％乙醇80℃回流提取2次(料液比1:20)，每次1h，收集这两次的提取液，旋转蒸发回收乙醇，冷冻干燥得到粗提物。HPD‑100型大孔吸附树脂对粗提物中的黄酮苷进行富集，首先用水洗脱10个柱体积以除去强极性的杂质，再用
40％乙醇‑水溶液洗脱7个柱体积将黄酮苷洗脱下来，旋转蒸发回收乙醇，冷冻干燥得到忧遁草总黄酮提取物。用紫外分光光度法来测忧遁草干叶中总黄酮的含量，绘制标准曲线，得出回归方程。将忧遁草总黄酮溶解制成供试品，测定忧遁草总黄酮溶液的吸光度，计算忧遁草总黄酮含量。

[0031] 实施例2忧遁草总黄酮对小鼠心脏功能的影响

[0032] 1.小鼠分组及给药

[0033] 正常组：每天灌胃同体积的生理盐水，连续一个月后，皮下注射生理盐水3周。

[0034] 模型组：每天灌胃同体积的生理盐水，连续一个月后，皮下注射AngII(0.6mg·kg‑1 ‑1·d )3周。

[0035] 忧遁草总黄酮低剂量组：每天灌胃75mg·kg‑1忧遁草总黄酮溶液连续一个月后，皮‑1 ‑1下注射AngII(0.6mg·kg ·d )3周。

[0036] 忧遁草总黄酮中剂量组:每天灌胃150mg·kg‑1忧遁草总黄酮溶液连续一个月后，‑1 ‑1皮下注射AngII(0.6mg·kg ·d )3周。

[0037] 忧遁草总黄酮高剂量组：每天灌胃300mg·kg‑1忧遁草总黄酮溶液连续一个月后，‑1 ‑1皮下注射AngII(0.6mg·kg ·d )3周。

[0038] 2.心脏功能的测定

[0039] 皮下注射AngII(0.6mg·kg‑1·d‑1)3周后，小鼠麻醉之后使用超声影像系统检测小鼠的心脏功能并记录M型超声图像。测量小鼠的左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD),并计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)。

[0040] 最后一次皮下注射后，禁食24个小时。皮下注射AngII(0.6mg/kg/d)3周后，我们通过超声来测定小鼠心功能。如表1所示，我们可以观察到与正常组组相比，模型组小鼠LVEDD(左室舒张末期内径)、LVESD(左室收缩末期内径)值升高，而LVEF(左室射血分数)、LVFS(左心室短轴缩短分数)降低，说明模型组小鼠出现心肌肥厚及心功能降低(**P<0.01)。与模型组相比，忧遁草总黄酮组LVEDD、LVESD值降低，而LVEF、LVFS升高，说明忧遁草总黄酮能明显改善心肌肥厚及提高心功能(##P<0.01)。

[0041] 表1忧遁草总黄酮对AngⅡ诱导的小鼠心肌肥厚模型超声结果Table1.UltrasoundresultsofthetotalflavonoidsofAngII‑inducedmouseheartmodel

[0042]##

[0043] 注： n＝6，与正常组相比，**P<0.01。与模型组小鼠相比，P<0.01。

[0044] 实施例3忧遁草总黄酮对小鼠各项心脏测量指标的影响

[0045] 皮下注射AngII(0.6mg·kg‑1·d‑1)3周后，取各组小鼠，称量其体重后颈椎脱臼处死，迅速固定在手术台上，用手术剪剪开胸部皮肤，充分暴露心脏和肺，从主动脉根部剪断，取下心脏。将心脏冲洗3次，冲洗干净后称重，观察心脏形态并拍照。最后测量小鼠右侧后肢胫骨长度。计算心脏质量指数、左心室质量指数、肺脏重量与体重比值、胫骨长度与心脏的比值增大。

[0046] 如表2所示，与对照组相比，模型组HW/BW(心脏总量/体重)、LVW/BW(左心室重量/体重)、LW/BW(肺脏重量/体重)、HW/TL(心脏重量/胫骨长)均明显增加(**P<0.01)。而忧遁##草总黄酮低中高剂量组比模型组HW/BW、LVW/BW、LW/BW、HW/TL均有显著降低( P<0.01)。

[0047] 表2忧遁草总黄酮对AngⅡ诱导的小鼠心脏模型各项心脏测量指标的影响Table2.TheeffectsoftotalflavonoidsfromAngII‑inducedmouseheartmodelonvariouscardiacmeasurementindexes

[0048]

[0049]

[0050] 注： n＝6；与正常组相比，**P<0.01；与AngⅡ组相比，##P<0.01。

[0051] 如图1HE染色所示，在20倍显微镜下，对照组中心肌细胞形态正常，结构明晰，大小均一，无明显肥大细胞，且细胞间排列整齐；模型组中，心肌细胞的形态改变，心肌细胞明显肥大，且细胞间排列紊乱。与模型组相比，忧遁草总黄酮组心肌细胞形态较为均一，细胞肥大程度降低，且细胞排列较整齐。

[0052] 实施例4忧遁草总黄酮抑制小鼠心肌组织胶原沉积

[0053] 心肌肥厚时，心肌组织胶原增多。在Masson染色中，红色代表肌纤维，蓝色代表胶原沉积。如图2所示，与空白组相比，模型组有明显蓝色沉积，说明模型组小鼠心肌组织中胶原增多；与模型组相比，忧遁草总黄酮可使胶原沉积明显减少。

[0054] 实施例5不同浓度忧遁草总黄酮对细胞活力的影响

[0055] CCK‑8检测细胞活力

[0056] H9C2细胞生长至覆盖培养瓶的80％面积时，在超净台内，弃去原有的培养液，用3mLPBS清洗2次，加入0.25％胰蛋白酶消化，然后离心，弃去上清液，添加3mL完全培养基吹
5
打混匀，在显微镜下计数。然后以3×10个/mL浓度将细胞接种至96孔板中，每个孔添加100μL细胞液，每组设置了6个复孔。24h后加入不同浓度的忧遁草总黄酮(0、10、20、40、80、160、
320μg/mL)。继续孵育24h。换液每孔加入10μLCCK8溶液，避光孵育0～4h，酶标仪490nm波长检测忧遁草总黄酮对H9C2细胞活力的影响。

[0057] 采用CCK‑8法测忧遁草总黄酮对H9C2干预24h后细胞活力的影响，如图2所示，不同浓度的忧遁草总黄酮(0、10、20、40、80、160、320μg/mL)对H9C2细胞活性的影响，忧遁草总黄酮在0～320μg/mL范围内中提高了H9C2细胞活力，而当忧遁草浓度在40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL时，细胞活力上升最大，故后续细胞实验采用的忧遁草浓度为40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL(**P<0.01)。

[0058] 实施例6忧遁草总黄酮对细胞总蛋白含量影响

[0059] BCA试剂盒测定其蛋白浓度，如图4所示，结果表明AngII(lμmol/L)孵育24h能够有效增加大鼠心肌H9C2细胞内总蛋白浓度，且有统计学意义(***P<0.001)；忧遁草总黄酮提取物(40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL)预处理24h，能够抑制AngII诱导的H9C2细胞总蛋白浓度# ## ###的升高(P<0.05，P<0.01， P<0.001)。

[0060] 实施例7忧遁草总黄酮降低心肌肥厚时细胞ROS水平

[0061] 检测细胞ROS水平

[0062] 大鼠心肌细胞H9C2计数，接种在6孔板中，分组如上，设置3个复孔，培养24小时，DCFH‑DA稀释1000倍。弃去培养液，加1mLDCFH‑DA。锡箔纸包裹避光，放37℃孵育箱内15min。无血清培养液冲洗干净细胞，使用荧光显微镜，避光拍摄。

[0063] AngⅡ可以诱导氧化酶激活及产生过量活性氧，过量的ROS生成会引发细胞功能障碍、脂质过氧化和DNA突变，并可能导致细胞损伤或死亡,诱导心肌肥大[12‑14]。ROS已被认为是心肌肥厚发生的关键因素之一。使用ROS试剂盒检测忧遁草总黄酮提取物对AngⅡ诱导的H9C2细胞的ROS水平的影响。如图5(A)所示，与对照组比较，AngⅡ组荧光强度明显增强(***P<0.05)。忧遁草总黄酮(40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL)预处理24h，能够减弱AngⅡ诱导H9C2的荧光强度(##P<0.01)。如图5(B)所示，AngⅡ组ROS水平显著增加，忧遁草总黄酮能抑制AngⅡ诱导的ROS水平上升。与对照组相比，***P<0.001；与AngⅡ组比较，##P<0.01。