[0001] 本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种TRPV1信号通路抑制剂及其在疼痛舒缓类化妆品中的应用。

[0002] 瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道在机体中具有较为广泛的表达。TRPV1是一种非选择性阳离子通道，参与慢性疼痛的发生发展。皮肤角质形成细胞中表达的TRPV1，在皮肤表面温度以及渗透压的调控中发挥了重要的调控作用。TRPV1通道不仅参与了外界刺激条件下炎症介质的释放过程，该离子通道还参与了对传导疼痛信号的调控作用。此外，TRPV1通道表现出两种脱敏：第一种是急性脱敏，第二种是快速耐受性。TRPV1通道的拮抗剂通过抑制通道活性以及激动剂通过使通道脱敏发挥镇痛作用。

[0003] P物质(SP)与TRPV1在初级感觉神经元中表达有P物质，它在伤害性刺激的介导中发挥着重要作用。在慢性非细菌性前列腺炎的疼痛中，前列腺上皮以及脊髓背角神经元上P物质和TRPV1的表达增加,使痛觉阈值降低，引起脊髓中枢痛觉敏化疼痛的产生。P物质与受体结合后，依赖细胞内G蛋白偶联受体‑PL Cβ‑IP/DG‑PKC/Ca2+信号通路磷酸化TRPV1，增强对热、H+、辣椒素的敏感性。NK‑1是P物质的受体，主要在浅脊髓背角神经元和DRG神经元突触前膜表达。P物质与NK‑1受体结合后激活PLC，而后将PIP2水解成IP3和DAG，IP3激活细胞膜上的Ca2+通道并且使细胞内钙库释放Ca2+，从而使细胞内的Ca2+浓度升高，间接地激活PKC，而DAG则可以直接激活PKC，PKC可以磷酸化TRPV1，使其敏感性增强。此外，NK‑1的激活可以使Nav1.8的激活阈值降低,激活Nav1.8引起Na+大量内流，DRG神经元去极化，促使P物质从细胞内释放，使疼痛的发应增强。

[0004] 炎症激活肥大细胞和巨噬细胞时，L‑1β释放到炎症环境中，在炎症反应中起着重要的作用。在蛇毒诱发的痛觉过敏中，IL‑1β能增强痛觉过敏，IL‑1β拮抗剂能减弱这种痛觉过敏症状。IL‑1β能促进炎症的形成发展，还能诱导伤害性感受器敏感物质如PGE2和NGF的合成。此外还能够快速直接激活伤害性感受器诱发动作电位,诱发痛觉过敏。IL‑1β通过其相应受体,依赖下游PKC信号通路，敏化TRPV1，诱导痛觉过敏的产生。

[0005] 汉防己在中药上具有广泛的用途，其根部主要可以提取出两类生物碱，包括了汉防己甲素和汉防己乙素。汉防己素主要具有消炎、镇痛、减轻过敏反应的作用。因此，汉防己素在许多领域都有着广泛应用。现有技术中，将中草药用于舒缓类化妆品的制备过程中，通常要加入多种中草药组分配合使用，这就使得化妆品的制备过程较为繁杂，而将汉防己作为TRPV1信号通路抑制剂并将其应用于制备成分精简的舒缓类化妆品则未见报道。

[0032] 为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域的技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

[0033] 本发明实施例所用的汉防己甲素的分子式为C38H42N2O6，由防己科植物粉防己根提炼的一种生物碱，纯度需在95％以上，具体结构式如下：

[0034]

[0035] 本发明实施例所用的汉防己乙素的分子式为C37H40N2O6，由防己科植物粉防己根提炼的一种生物碱，纯度需在95％以上，具体结构式如下：

[0036]

[0037] 实施例1‑8疼痛舒缓类化妆品的制备

[0038] 汉防己素作为TRPV1信号通路抑制剂在制备疼痛舒缓类化妆品中的应用，所述疼痛舒缓类化妆品的制备过程为：

[0039] 第一步，选取制备好的茶油作为化妆品原产品；

[0040] 第二步，称取500g茶油，备用。再缓慢加热至温度达到30‑50℃，向其中加入如表1所示配方量的汉防己素，不断搅拌，使其充分溶解；

[0041] 第三步，期间缓慢加热，溶解完全后，再静置冷却。待到茶油温度达到室温时，储藏即可，用于后续检测。

[0042] 表1疼痛舒缓类化妆品的配方

[0043]化妆品组成 茶油/g 汉防己甲素/g 汉防己乙素/g
实施例1 500 0.5 0
实施例2 500 10 0
实施例3 500 0 0.5
实施例4 500 0 10
实施例5 500 0.3 0.2
实施例6 500 0.25 0.25
实施例7 500 0.2 0.3
实施例8 500 5 5

[0044] 对上述各实施例制备得到的疼痛舒缓类化妆品进行性能测试。

[0045] 实施例9基于TRPV1信号通路检测产品的疼痛舒缓功效

[0046] 通过建立HaCaT细胞模型，采用qPCR的方式检测TRPV1、SP和IL‑1βmRNA表达量，评价本发明中添加有汉防己素的疼痛舒缓化妆品，对TRPV1信号通路的抑制作用。

[0047] 具体过程为：

[0048] (1)细胞培养：选取HaCaT细胞(购自中国细胞资源库)。选用DMEM培养基，培养基的配制中需加入10％的血清+1％的双抗。选用细胞培养瓶进行培养，每瓶加入5‑6mL培养基，每2‑3天传代一次。待细胞生长至培养瓶底面80％‑90％时，使用0.25％的胰酶消化，吹匀细6
胞，并稀释至10 个/mL。后将细胞悬液转移至60mm培养皿中，每皿加入3mL细胞悬液，混匀后静置。待细胞全部沉底后，置于37℃，5％CO2培养箱培养，培养24h后加药。

[0049] (2)实验组别设置：共分成11组，分别为空白对照组，模型组，对照组，模型+例1组，模型+例2组，模型+例3组，模型+例4组，模型+例5组，模型+例6组，模型+例7组及模型+例8组。其中，空白对照组HaCaT细胞正常生长，加药过程中，培养基不添加其他物质；模型组中的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基不添加其他物质；对照组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基茶油原产品；模型+例1组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例1化妆品(10μg/mL)；模型+例2组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例2化妆品(10μg/mL)；模型+例3组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例3化妆品(10μg/mL)。模型+例4组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例4化妆品(10μg/mL)。模型+例5组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例5化妆品(10μg/mL)，模型+例6组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例6化妆品(10μg/mL)，模型+例7组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例7化妆品(10μg/mL)，模型+例8组的HaCaT细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例8化妆品(10μg/mL)。

[0050] (3)RNA提取：采用Trizol法进行RNA提取。首先，取出加药24h的培养皿，移除培养基，后使用4℃预冷的PBS洗涤两次。每皿加入1mL Trizol，吹下贴壁细胞，后移入无酶1.5mL离心管中，静置3min。再加入380μL的三氯甲烷，涡旋混匀，静置3min。使用冷冻离心机，设置程序4℃/12000rpm/15min，完成后小心转移上层液体(>500μL)至新的无酶1.5mL离心管中。按照转移液体的体积，1:1加入异丙醇，颠倒混匀，后放入‑20℃冰箱静置10‑15min。再离心，
4℃/12000rpm/10min，弃上清。加入1mL 75％乙醇(DEPC配制)，洗涤沉淀，后离心，4℃/
12000rpm/5min，尽可能移干液体。最后晾干沉淀RNA，待RNA略干之后，加入20μL的DEPC水溶解RNA。最后进行电泳以及OD260/OD280检测，确定RNA是否可以用于后续实验。

[0051] (4)逆转录：使用逆转录试剂盒(购自武汉赛维尔)，进行cDNA第一条链的合成。反应体系20μL，程序设置如下：

[0052]

[0053] (5)qPCR检测：使用qPCR检测试剂盒(购自武汉赛维尔)，加入引物，进行mRNA定量检测。反应体系20μL，程序设置如下：

[0054]

[0055]

[0056] 根据获得的CT值，以GAPDH为内参，使用2‑ΔΔCT法进行计算，计算结果如图1‑3所示。

[0057] 如图1所示，模型组中，受LPS诱导后，TRPV1mRNA的表达水平显著上升，而当使用不同实施例后，TRPV1 mRNA的表达水平比之模型组，明显下降，但仍高于空白对照组。TRPV1 mRNA的表达水平：模型组>对照组>模型+例5组>模型+例1组>模型+例6组>模型+例3组>模型+例2组>模型+例7组>模型+例8组>模型+例4组>空白对照组。

[0058] 如图2所示，模型组中，受LPS诱导后，SP mRNA的表达水平显著上升，而当使用不同实施例后，SP mRNA的表达水平比之模型组，明显下降，但仍高于空白对照组。SP mRNA的表达水平：模型组>对照组>模型+例5组>模型+例1组>模型+例6组>模型+例3组>模型+例2组>模型+例7组>模型+例8组>模型+例4组>空白对照组。

[0059] 如图3所示，模型组中，受LPS诱导后，IL‑1βmRNA的表达水平显著上升，而当使用不同实施例后，IL‑1βmRNA的表达水平比之模型组，明显下降，但仍高于空白对照组。IL‑1βmRNA的表达水平：模型组>对照组>模型+例1组>模型+例5组>模型+例6组>模型+例7组>模型+例3组>模型+例2组>模型+例8组>模型+例4组>空白对照组。

[0060] 实验证明，向疼痛舒缓类化妆品中添加一定量的汉防己素可以有效抑制LPS诱导后TRPV1、SP和IL‑1βmRNA的表达，起到疼痛舒缓的作用，且对于TRPV1信号通路的抑制作用添加汉防己乙素要优于汉防己甲素。通过混合添加汉防己甲素和汉防己乙素，并调整汉防己甲素和汉防己乙素的比例，以使汉防己乙素含量大于汉防己甲素，可实现在较低汉防己素添加量的同时仍能实现较为优异的舒缓效果。

[0061] 实施例10细胞内钙离子流检测

[0062] 采用流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度，进而检测疼痛舒缓化妆品添加汉防己素后疼痛舒缓的功效。具体过程为：

[0063] (1)选取SH‑SY5Y细胞(购自中国细胞资源库)。选用DMEM培养基，培养基的配制中需加入10％的血清+1％的双抗。选用细胞培养瓶进行培养，每瓶加入5‑6mL培养基，每2‑3天传代一次。待细胞生长至培养瓶底面80％‑90％时，使用0.25％的胰酶消化，吹匀细胞，并稀6
释至10个/mL。后将细胞悬液转移至60mm培养皿中，每皿加入3mL细胞悬液，混匀后静置。待细胞全部沉底后，置于37℃，5％CO2培养箱培养，培养24h后加药。

[0064] (2)实验组别设置：共分成11组，分别为空白对照组，模型组，对照组，模型+例1组，模型+例2组，模型+例3组，模型+例4组，模型+例5组，模型+例6组，模型+例7组及模型+例8组。其中，空白对照组SH‑SY5Y细胞正常生长，加药过程中，培养基不添加其他物质；模型组中的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基不添加其他物质；对照组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加茶油原产品；模型+例1组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例1化妆品(10μg/mL)；模型+例2组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例2化妆品(10μg/mL)；模型+例3组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例3化妆品(10μg/mL)。模型+例4组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例4化妆品(10μg/mL)，模型+例5组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例5化妆品(10μg/mL)，模型+例6组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例6化妆品(10μg/mL)，模型+例7组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例7化妆品(10μg/mL)，模型+例8组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例8化妆品(10μg/mL)。

[0065] 外界或内源性刺激都会激活TRPV1，从而引起Ca2+内流，导致皮肤渗透性增加，产生刺痛、烧灼的感觉。同时，TRPV1还会促进释放包括P物质在内的神经源性炎症因子，进一步2+
诱导炎症因子的分子，导致局部毛细血管扩张。细胞内Ca 浓度检测，根据流式细胞术的结
2+
果，进行分析，所得结果如图4所示。模型组细胞收到LPS诱导后，Ca 浓度明显上升，而使用
2+
不同的实施例后，与模型组相比，荧光强度降低较为明显。Ca 浓度：模型组>对照组>模型+例5组>模型+例1组>模型+例6组>模型+例3组>模型+例7组>模型+例2组>模型+例4组>模型+
2+
例8组>空白对照组。实验表明，汉防己素可以抑制因LPS诱导刺激产生的Ca 内流。

[0066] 实施例11ROS水平检测

[0067] 选取SH‑SY5Y细胞(购自中国细胞资源库)。选用DMEM培养基，培养基的配制中需加入10％的血清+1％的双抗。选用细胞培养瓶进行培养，每瓶加入5‑6mL培养基，每2‑3天传代一次。待细胞生长至培养瓶底面80％‑90％时，使用0.25％的胰酶消化，吹匀细胞，并稀释至6
10个/mL。后将细胞悬液转移至60mm培养皿中，每皿加入3mL细胞悬液，混匀后静置。待细胞全部沉底后，置于37℃，5％CO2培养箱培养，培养24h后加药。

[0068] 实验组别设置：共分成10组，分别为空白对照组，模型组，对照组，模型+例1组，模型+例2组，模型+例3组，模型+例4组，模型+例5组，模型+例6组，模型+例7组及模型+例8组。其中，空白对照组SH‑SY5Y细胞正常生长，加药过程中，培养基不添加其他物质；模型组中的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基不添加其他物质；对照组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加茶油原产品；模型+例1组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例1化妆品(10μg/mL)；模型+例2组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例2化妆品(10μg/mL)；模型+例3组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例3化妆品(10μg/mL)。模型+例4组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例4化妆品(10μg/mL)，模型+例5组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例5化妆品(10μg/mL)，模型+例6组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例6化妆品(10μg/mL)，模型+例7组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例7化妆品(10μg/mL)，模型+例8组的SH‑SY5Y细胞受LPS诱导，加药过程中，培养基添加实施例8化妆品(10μg/mL)。

[0069] ROS水平检测：给加药24h后的6孔板取出，加入DCFH‑DA染料，孵育30min。后取出，使用4℃的PBC洗涤2‑3次，置于荧光显微镜下观察，拍照，如图5所示。

[0070] ROS水平检测实验，根据拍摄的结果，进行image J分析，所得结果如图6所示。模型组细胞收到LPS诱导后，ROS水平明显上升，而使用不同的实施例后，与模型组相比，荧光强度降低程度明显高于对照组。ROS水平：模型组>对照组>模型+例5组>模型+例1组>模型+例6组>模型+例3组>模型+例7组>模型+例2组>模型+例4组>模型+例8组>空白对照组。实验表明，汉防己素可以抑制LPS诱导后产生的氧化应激。

[0071] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。