[0001] 本申请涉及医疗器材领域，具体涉及一种软骨支架及其制备方法。

[0002] 关节软骨在关节活动中起重要作用，在日常关节活动中发生损伤或其他病理引起的软骨病变是常见的，而软骨的自我修复能力差，若损伤或软骨病变持续发展通常导致骨关节炎，最终导致逐渐造成全面关节破坏，严重影响生活质量，因此关节软骨治疗非常重要。

[0003] 目前临床上关节软骨的治疗可以利用恰当的组织工程生物材料取代受损区域并促进组织再生，目前已经有多种软骨支架用于软骨再生修复。然而现有的软骨支架存在结构仿生程度较低，制作程序复杂的问题。

[0034] 为了使本申请的申请目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。

[0035] 为了简便，本申请仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。

[0036] 在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中的“多种”的含义是两种及其两种以上。

[0037] 关节软骨在关节活动中起重要作用，在日常关节活动中发生损伤或其他病理引起的软骨病变是常见的，而软骨的自我修复能力差，若损伤或软骨病变持续发展通常导致骨关节炎，最终导致逐渐造成全面关节破坏，严重影响生活质量，因此关节软骨治疗非常重要。目前临床上关节软骨的治疗可以利用恰当的组织工程生物材料取代受损区域并促进组织再生，目前已经有多种软骨支架用于软骨再生修复。

[0038] 申请人注意到，现有的软骨支架存在结构仿生程度较低，制作程序复杂的问题。由此，为了解决现有技术中存在的问题，申请人提出了以下技术方案。

[0039] 第一方面，本申请提供了一种软骨支架，如图1至图2所示，软骨支架包括：层叠设置的第一软骨层10、第二软骨层20和第三软骨层30；

[0040] 其中，第一软骨层10包含多条第一孔道111，第一孔道111与第一软骨层10和第二软骨层20之间的第一结合面110大致平行，第二软骨层20包含多条第二孔道211，第二孔道211随机分布，与海绵中的孔道分布状态类似，呈无序状，第三软骨层30包含多条第三孔道
311，第三孔道311大致沿第一结合面110的法向。

[0041] 本申请的技术方案中，软骨支架具有第一软骨层、第二软骨层和第三软骨层，且各软骨层具有不同取向的孔道。本申请实施例的软骨支架包括层叠设置的第一软骨层、第二软骨层和第三软骨层，且各软骨层具有不同取向的孔道。其中，第一软骨层具有与天然软骨表层细胞外基质相似取向的孔道，第二软骨层具有与天然软骨中间层细胞外基质相似排列的孔道，第三软骨层具有与天然软骨深层细胞外基质相似取向的孔道，可以模拟正常软骨多个层次细胞外基质的结构，提高了软骨支架的仿生程度，还可以引导细胞快速沿孔隙定向迁移，最终加速软骨再生。

[0042] 需要说明的是，在本申请的技术方案中，同样的，第一软骨层包含多条与第一软骨层和第二软骨层之间的第一结合面大致平行的第一孔道，是指第一孔道的孔道方向与结合面之间的夹角不超过8°。第三软骨层包含多条大致沿第一结合面的法向的第三孔道，是指第三软骨层的孔道方向与第一结合面的法向之间的夹角不超过8°；

[0043] 在本申请的一些实施例中，第一软骨层、第二软骨层和第三软骨层的组成材料为水凝胶材料。

[0044] 根据本申请的实施例，由于软骨支架需要植入体内发挥作用，因此制作软骨支架的材料必须具有良好的生物相容性、合适的降解率以及极小的毒性；水凝胶材料单体是高分子量长链亲水聚合物，在水中可以分散、溶胀，溶胀后的水凝胶溶液经过冷冻并消除冰晶后，可以形成具有高孔隙率的空间网状材料，自然界中存在大量生物相容性好、毒性低的亲水胶体，因此可以利用其作为软骨支架的组成材料。

[0045] 本申请所用的水凝胶材料包括本领域常用的天然水凝胶材料和合成水凝胶材料，可以根据需要进行选择。

[0046] 示例性地，天然水凝胶材料包括天然蛋白、天然蛋白修饰物、天然蛋白降解物、天然蛋白降解物的修饰物、天然多糖、天然多糖修饰物、天然多糖降解物和天然多糖降解物的修饰物中的一种或多种。

[0047] 示例性地，天然蛋白包括各种亲水动植物蛋白、水溶性动植物蛋白、I型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、血清蛋白、丝素蛋白和弹性蛋白中的一种或多种。天然蛋白降解物较佳地包括明胶(Gel)或多肽。天然蛋白降解物的修饰物包括甲基丙烯酰化天然蛋白降解物，更佳地为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。

[0048] 示例性地，天然多糖包括壳聚糖透明质酸(HA)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、海藻酸钠、葡聚糖、琼脂糖、肝素、硫酸软骨素(CS)、乙二醇壳聚糖、丙二醇壳聚糖、壳聚糖乳酸盐、羧甲基壳聚糖和壳聚糖季铵盐中的一种或多种。天然多糖修饰物包括甲基丙烯酰化天然多糖，例如甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)或甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)。

[0049] 示例性地，合成水凝胶材料包括合成多肽、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯中的一种或多种。

[0050] 在上述一些实施例中，列举的常用于生物医药领域的几种水凝胶材料，上述水凝胶材料均具有良好的生物相容性、合适的降解率以及极小的毒性，适用于作为软骨支架的材料。

[0051] 本申请实施例中软骨支架的各软骨层的组成材料可以相同，也可以不同。作为一种优选的实施方式，各软骨层的组成材料相同。

[0052] 在上述一些实施例中，各软骨层使用同样的水凝胶材料的目的在于，使各软骨层之间紧密连接，不易发生分离现象，由于水凝胶含有大量的亲水基团，分子之间易形成大量的氢键，当各软骨层使用的材料相同时，相互作用更好，从而使各软骨层紧密结合。

[0053] 在本申请的一些实施例中，组成材料还包括促间充质干细胞成软骨分化因子；促间充质干细胞成软骨分化因子为血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子‑β(TGF‑β)、2‑([1,1‑联苯]‑4‑基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)其中一种或几种。

[0054] 在上述一些实施例中，可以在第一、二、三软骨层中添加促间充质干细胞成软骨分化因子，有利于促间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化形成软骨细胞，从而加速软骨组织的修复。

[0055] 另外值得一提的是，由于使用水凝胶材料制备支架，条件温和，同时亲水胶体含有大量的羟基、氨基等亲水性基团，与促间充质干细胞成软骨分化因子、促间充质干细胞成骨分化因子具有良好的亲和作用，部分促间充质干细胞成软骨分化因子还可能具有提高水凝胶交联强度的效果，因此使用水凝胶材料制备的软骨支架相比现有技术中其他材料更加适合添加促间充质干细胞成软骨分化因子。

[0056] 在本申请的一些实施例中，软骨支架形状为柱状，第一孔道大致沿径向取向，第三孔道大致沿轴向取向。

[0057] 在上述一些实施例中，具体限定了软骨支架的形状，柱状支架是实际中常用的形状，支架植入于全层缺损的软骨组织处，支架与软骨组织和骨组织结合，从而充分发挥促进软骨组织修复的作用，软骨支架还可以是其他形状，可以根据需要进行剪裁。

[0058] 同样需要说明的是，在上述一些实施例中，第一软骨层的第一孔道大致沿径向取向，是指第一孔道与骨层具有多条径向取向的孔道径向线的不超过8°，第三软骨层的第三孔道大致沿轴向取向，是指第三孔道与柱状软骨支架的轴线的夹角不超过8°。

[0059] 第二方面，本申请提供了一种骨软骨支架的制备方法，包括以下步骤：

[0060] S10：将第二软骨浆料注入第一管状模具中，并使第二软骨浆料在低温环境中进行冷冻，得到具有第一结合面和第二结合面固态第二软骨层型坯，第二结合面平行于第一结合面；

[0061] S20：将第一结合面修整平并加热至开始融化，以第一结合面为底，将第一软骨浆料注入第一管状模具中，使第一软骨浆料以具有沿管状模具径向的温度梯度的方式进行冷冻，得到与固态第二软骨层型坯的第一结合面紧密结合的固态第一软骨层型坯；

[0062] S30：将第二管状模具与第一管状模具连接，以使固态第二软骨层型坯的第二结合面暴露于第二管状模具的型腔，并且第二结合面的法向大致沿第二管状模具的轴向；

[0063] S40：将第二结合面修整平并加热至开始融化，以第二结合面为底，将第三软骨浆料注入第二管状模具中，并使第三软骨浆料以具有沿第二管状模具轴向的温度梯度的方式进行冷冻，得到与固态第二软骨层型坯的第二结合面紧密结合的固态第三软骨层型坯；

[0064] S50：将固态第一软骨层型坯、固态第二软骨层型坯和固态第三软骨层型坯消除冰晶，得到软骨支架。

[0065] 在本申请的技术方案中，通过控制对第一软骨浆料、第二软骨浆料和第三软骨浆料的冷冻方式，从而得到具有不同孔道取向的各软骨层的软骨支架，本申请提供的骨软骨支架的制备方法步骤简单，成本较低，且不需要使用复杂的技术和仪器，适合于工业化生产。

[0066] 在本申请的技术方案中，步骤S10中，对第二软骨浆料的冷冻方式是使第二软骨浆料各面接触的环境温度相近，如此设置是为了使第二软骨浆料在冷冻过程中，冰晶从各个方向形成，在消除冰晶后，形成的孔道是随机分布的像海绵一样的无序孔道。

[0067] 步骤S20中，将第一结合面修整平并加热至开始融化是使浇筑时第一软骨浆料与第二软骨浆料在第一结合面上紧密连接，对第一软骨浆料的冷冻方式是使第一软骨浆料具有沿管状模具径向的温度梯度，由于在冷冻过程中，冰晶形成的方向是沿温度梯度的方向，因此得到的固态第一软骨层型坯中冰晶的方向是径向的，由此消除冰晶后得到具有径向取向的孔道。

[0068] 步骤S30中，将第二管状模具与第一管状模具连接，以使固态第二软骨层型坯的第二结合面暴露于第二管状模具的型腔，并且第二结合面的法向大致沿第二管状模具的轴向，是为了使冷冻后第一管状模具和第二管状模具中软骨层型坯在同一轴线上。

[0069] 步骤S40中，第二结合面修整平并加热至开始融化，是使浇筑时第三软骨浆料与第二软骨浆料在第二结合面上紧密连接，对第三软骨浆料的冷冻方式是使第三软骨浆料具有沿管状模具轴向的温度梯度，同样由于在冷冻过程中，冰晶形成的方向是沿温度梯度的方向，因此得到的固态第三软骨层型坯中冰晶的方向是轴向的，由此冰晶消除后得到具有轴向取向的孔道。

[0070] 固态第一软骨层型坯和固态第二软骨层型坯可以通过同一个管状模具制备，以减少模具数量，简化操作步骤。也可以在形成固态第二软骨层型坯后，使用第三管状模具与第一管状模具相接，在第三管状模具内形成固态第一软骨层型坯，再将第二管状模具与所述第一管状模具连接，以得到固态第三软骨层型坯，冷冻方式相同。

[0071] 步骤S50中，去除各软骨层型坯的冰晶，即得到了由具有径向取向孔道的第一软骨层、具有随机分布的孔道的第二软骨层和具有轴向取向孔道的第三软骨层层叠在一起的软骨支架。

[0072] 在一些实施例中，冰晶消除的方式可以为冷冻干燥。

[0073] 在一些实施例中，冰晶消除的方式可以为低温辅助液体替代，包括：将固态各软骨层型坯在低温的乙醇溶液中保存预设时间，以使冰晶溶解于所述乙醇溶液。

[0074] 乙醇溶液在低温下不会凝固，本申请用低温的乙醇溶液将固态各软骨层型坯中的冰晶融化，方式更温和，而不影响各软骨层结构及孔道结构。示例性地，将95％乙醇溶液中置于‑20℃保存24h，将固态各软骨层型坯置于上述低温乙醇溶液中，于‑20℃保存72h，可以在消除冰晶的同时避免软骨层融化。

[0075] 在本申请的一些实施例中，第一软骨浆料、第二软骨浆料和第三软骨浆料为壳聚糖水溶液，由于壳聚糖不溶于水，易溶于酸性溶液，因此固态各软骨层型坯中可能还含有酸性成分，则配置乙醇溶液时，还可以在乙醇溶液中溶解适量碱性物质，例如NaOH。使用含碱的低温溶液进行替代后，可以用PBS缓冲液洗后得到软骨支架。

[0076] 在本申请的一些实施例中，步骤S10、S20和S40中，第一软骨浆料、第二软骨浆料和第三软骨浆料为水凝胶溶液；水凝胶溶液中水凝胶单体的质量分数为1～10％。

[0077] 在上述一些实施例中，使用水凝胶溶液作为各软骨层浆料，具有成本低、制备方法简单、生物相容性好等优点，同时将水凝胶单体质量分数控制在1～10％范围内，浓度过低会导致制备的支架机械强度过低，浓度过高则会导致支架的孔隙率过低，因此需要将水凝胶单体质量分数控制在合适范围内。

[0078] 在本申请的一些实施例中，步骤S10、S20和S40中，第一软骨浆料、第二软骨浆料和第三软骨浆料还含有促间充质干细胞成软骨分化因子；促间充质干细胞成软骨分化因子在软骨层浆料的质量分数为0.1～5％；

[0079] 在上述一些实施例中，在浆料混匀前即加入促间充质干细胞成软骨分化因子在静置过程中，水凝胶溶液充分溶胀，同时促间充质干细胞成软骨分化因子通过分子间作用力或氢键与水凝胶分子紧密结合，同时还能提高水凝胶在水中的交联程度。

[0080] 另外，将促间充质干细胞成软骨分化因子的质量分数均控制在0.1～5％，过低会导致促分化效果不明显，过高会影响亲水胶体水溶液的交联程度，或导致支架的孔隙率降低，因此需要将促间充质干细胞成软骨分化因子质量分数控制在合适范围内。

[0081] 在本申请的一些实施例中，第一管状模具和第二管状模具的截面形状为圆形、椭圆形、正方形、长方形其中一种；

[0082] 优选的，第一管状模具和第二管状模具的截面形状为圆形。

[0083] 在上述一些实施例中，更具体限定了第一管状模具和所述第二管状模具的截面形状，其中圆形是更优选的，在第二管状模具形成的是轴向的温度差，因此截面形状对冰晶形成方向影响不大，因此截面形状主要影响的是在第一管状模具中形成的径向的温度差，由于椭圆形、正方形、长方形的四周离几何中心的距离不等，对冰晶形成方向可能有一定的影响，而圆形的四周与几何中心的距离相等，因此得到的径向孔道更加规整。

[0084] 由此，若实际需要其他不规整的软骨支架，可以制作面积更大的圆柱形骨软骨支架后沿轴向进行切割，得到不同形状的软骨支架进行使用。

[0085] 在本申请的一些实施例中，步骤S10包括：

[0086] 将第二软骨浆料注入第一管状模具中，保持环境温度‑15～‑25℃，对第二软骨层浆料冷冻10～30min得到固态第二软骨层型坯；

[0087] 其中，第一管状模具的导热系数≥10W/(m·K)；

[0088] 步骤S20包括：将第一结合面修整平并加热至开始融化，将20～30℃的第一软骨浆料注入第一管状模具中，保持第一管状模具温度为‑25～‑35℃，对第一软骨浆料冷冻10～30min得到固态第一软骨层型坯。步骤S40包括：

[0089] 将第二结合面修整平并加热至开始融化，将20～30℃的第三软骨浆料注入第二管状模具中，保持第一管状模具为‑25～‑35℃，对第三软骨浆料冷冻10～30min得到固态第三软骨层型坯；

[0090] 其中，第二管状模具的导热系数≤0.5W/(m·K)。

[0091] 在上述一些实施例中，提供了一种更具体的软骨支架的制备方法，步骤S10中，将环境温度预冷至‑15～‑25℃，是为了使第二软骨浆料从各个方向都开始形成冰晶，从而冰晶消除后形成的孔道呈无序状。

[0092] 步骤S20中，将第二软骨浆料的第一结合面加热至刚好融化，再向其中快速浇筑第一软骨浆料，并通过将第一管状模具控制在‑25～‑35℃对管内第一软骨浆料进行冷冻，这是为了使靠近管状模具的第一软骨浆料与管中心的第一软骨浆料形成径向的温度差，由于冰晶形成的方向是沿温度差的方向，因此冷冻后骨层浆料中冰晶的方向为径向，并且以管中心呈放射状分布，由此冻干后得到具有径向取向的孔道；另外，第一管状模具温度不宜过低，过低会导致冰晶的粒径较小，不能形成连续的孔道；且第一管状模具的导热系数应≥10W/(m·K)，导热性较好可以保证在冷冻过程中靠近管状模具的第一软骨浆料与管中心的第一软骨浆料一直保持径向的温度差；示例性地，可以通过冰台控制第一管状模具的温度。

[0093] 步骤S40中，将第二软骨浆料的第二结合面加热至刚好融化，再向其中快速浇筑第三软骨浆料，保持第一管状模具温度为‑25～‑35℃，对第三软骨浆料冷冻10～30min，且第二管状模具的导热系数应≤0.5W/(m·K)，这是为了保证在第二管状模具中第三软骨浆料在冷冻过程中具有轴向的温度差，第三软骨浆料的下表面温度为‑25～‑35℃，在第三软骨浆料中形成自上而下温度差，因此冷冻后第三软骨浆料的冰晶方向为轴向，由此消除冰晶后得到具有轴向取向的孔道；同样的，冷冻温度不宜过低，过低会导致冰晶的粒径较小，不能形成连续的孔道，过高则会影响冷冻效率；第二管状模具的导热系数较小，为不易导热材料制成，是为了防止环境通过模具影响第三软骨浆料中间层的温度，从而防止破坏形成的轴向温度差。

[0094] 在本申请的一些实施例中，第一管状模具为黄铜管状模具或不锈钢管状模具；

[0095] 可选的，第二管状模具为聚乙烯管状模具、聚丙烯管状模具、聚碳酸酯管状模具、聚二甲基硅氧烷管状模具其中一种。

[0096] 在上述一些实施例中，列举了一些导热性能较好的管状模具以及隔热性能较好的管状模具，可以根据实际情况以及成分方面的考虑选择合适的第一管状模具和第二管状模具。

[0097] 在本申请的一些实施例中，步骤S40、S50之间还包括：

[0098] 将固态第一软骨层型坯、固态第二软骨层型坯与固态第三软骨层型坯在‑15～‑25℃下冷冻6～24h。

[0099] 在上述一些实施例中，将固态第一软骨层型坯、固态第二软骨层型坯与固态第三软骨层型坯继续冷冻6～24h，可以继续促进不同取向的冰晶进行生长，使后续冰晶消除后得到的孔道更加完整。

[0100] 以下，通过实施例更详细地说明本申请的一种软骨支架及其制备方法，但本申请丝毫不限于这些实施例。

[0101] 实施例1

[0102] 将壳聚糖粉末通过磁力搅拌溶于溶解在1％乙酸水溶液中制备第一软骨浆料、第二软骨浆料和第三软骨浆料，软骨层浆料中壳聚糖质量分数为3％；

[0103] 将以培养皿为底的空心圆柱不锈钢模具及其中的第二软骨层浆料一起置于‑20℃冰箱，冷冻20min，使第二软骨层浆料凝固。

[0104] 将凝固的第二软骨层浆料上表面修整平并加热至开始融化，立即在上方浇筑第一软骨浆料，去除培养皿，用冰台将空心圆柱不锈钢模具保持在‑30℃20min，使第一软骨层浆料凝固于第二软骨层上方；

[0105] 将空心圆柱不锈钢模具倒置于‑30℃冰台上，上方连接空心圆柱PDMS(聚二甲基硅氧烷)模具，使其通道对齐，空心圆柱不锈钢模具与空心圆柱PDMS模具为同一内径；

[0106] 将此时的第二软骨层上表面修整平并加热至开始融化，立即在其上方即PDMS模具管腔内浇筑第三软骨浆料，保持20min至第三软骨层浆料凝固。

[0107] 冷冻后装有浆料的模具放置于‑20℃的冰箱中冷冻24h；

[0108] 将NaOH颗粒溶解于95％乙醇中制备0.1mol/L的碱性溶液并置于‑20℃冷冻24h；

[0109] 将冷冻好的浆料置于上述低温碱性溶液中，于‑20℃保存72h；

[0110] 将碱性溶液替代后的浆料于室温用PBS浸泡清洗3次，每次20分钟；

[0111] 得到具有多层结构的软骨水凝胶支架。

[0112] 通过本申请提供的技术方案制备得到的软骨支架仿生了天然软骨的层次结构；其中，第一软骨层具有与天然软骨表层细胞外基质相似取向的孔道，第二软骨层具有与天然软骨中间层细胞外基质相似排列的孔道，第三软骨层具有与天然软骨深层细胞外基质相似取向的孔道，可以模拟正常软骨多个层次细胞外基质的结构，提高了软骨支架的仿生程度，还可以引导细胞快速沿孔隙定向迁移，粘附和增殖，最终加速软骨再生。

[0113] 本申请的上述申请内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。

[0114] 以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。