技术领域
[0001] 本发明属于药物化学技术领域，尤其是一种新型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂和应用。
相关背景技术
[0002]
[0003]
[0004] 针对各种变异新冠病毒的特点，选择病毒的保守靶点，设计具备干扰病毒复制周期中的某个环节，从而选择性地抑制其复制过程，但不影响宿主细胞的正常生理功能、具有更好安全性的、对各种变异新冠病毒都有效的广谱抗新冠病毒小分子药物是对抗毒株快速变异的稳妥之策。
[0005] 新型冠状病毒的3CL蛋白酶(3C‑like proteinase，3CLpro)底物结合位点高度保pro守，在介导病毒复制和转录方面起着关键作用。同时，人体内没有与3CL 类似切割位点的蛋白酶，因此，3CL蛋白酶可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点，针对其设计的小分子抑制剂更具广谱抗新型冠状病毒的能力。
[0006]
[0007] 无论是从经济效益来说还是从保护民众安全的角度来说，研制新的、安全的、具有广谱性、高稳定性抗新冠病毒小分子药物有着极为重要的作用。
[0008] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
具体实施方式
[0071] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0072] 具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
[0073] 一种新型冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂，所述抑制剂为β‑硝基苯乙烯类化合物，所述β‑硝基苯乙烯类化合物的结构通式如下：
[0074]
[0075] 所述R1‑R5各自独立地或共同地选自氢、氰基、硝基、羟基、羧基、酯基(‑CnH2nO2，n＝1,2)、卤素、取代或未取代的烷基(‑CnH2n+1，n＝1,2,3)、取代或未取代的烯基(‑CnH2n，n＝2,
3)、取代或未取代的炔基(‑CnH2n‑2，n＝2,3)、取代或未取代的烷氧基(‑O‑CnH2n+1,n＝1,2,
3)、取代或未取代的氨基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的苯基中的任意一种。
[0076] 较优地，所述β‑硝基苯乙烯类化合物为β‑硝基苯乙烯、对甲氧基‑β‑硝基苯乙烯、对硝基 ‑β‑硝基苯乙烯、对氰基‑β‑硝基苯乙烯、对β‑硝基乙烯基苯甲酸甲酯、对氟‑β‑硝基苯乙烯、邻溴‑β‑硝基苯乙烯；
[0077] β‑硝基苯乙烯的结构式为：
[0078] 对甲氧基‑β‑硝基苯乙烯的结构式为：
[0079] 对硝基‑β‑硝基苯乙烯的结构式为：
[0080] 对氰基‑β‑硝基苯乙烯的结构式为：
[0081] 对β‑硝基乙烯基苯甲酸甲酯的结构式为：
[0082] 对氟‑β‑硝基苯乙烯的结构式为：
[0083] 邻溴‑β‑硝基苯乙烯的结构式为：
[0084] 较优地，所述β‑硝基苯乙烯的合成方法如下：
[0085] 称取化合物苯甲醛放入圆底烧瓶，加入无水甲醇和磁力搅拌子，用胶塞将口塞上，室温搅拌溶解，用无菌注射器称取硝基甲烷加入其中，搅拌充分混匀；混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，液体变稠，补加无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min，TLC监测，直至原料反应完全；向反应体系中加入冰水，体系溶清，快速加入预先配置并预冷的HCl溶液，HCl:H2O 的体积比为2:5，快速搅拌，有黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥；柱层析，石油醚：乙酸乙酯的体积比为10：1，得到产物为亮黄色固体；
[0086] 其中，苯甲醛：无水甲醇：硝基甲烷：补加的无水甲醇：冰水：HCl溶液：无水乙醇的比例g：ml：g：ml：ml：ml：ml为3.0：6：1.89：2：30：15：3。
[0087] 较优地，所述对甲氧基‑β‑硝基苯乙烯的合成方法为：
[0088] 称取化合物对甲氧基苯甲醛放入圆底烧瓶，加入无水甲醇和磁力搅拌子，用胶塞将口塞上，室温搅拌溶解，用无菌注射器称取硝基甲烷加入其中，搅拌充分混匀；混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，液体变稠，补加无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min，TLC监测，直至原料反应完全；向反应体系中加入冰水，体系溶清，快速加入预先配置并预冷的HCl溶液， HCl:H2O的体积比为2:5，快速搅拌，有黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯的体积比为10:1，得到产物为亮黄色固体；
[0089] 其中，对甲氧基苯甲醛：无水甲醇：硝基甲烷：补加的无水甲醇：冰水：HCl溶液：无水乙醇的比例g：ml：g：ml：ml：ml：ml为1：2：0.493：0.5：10：5：0.5。
[0090] 较优地，所述对硝基‑β‑硝基苯乙烯的合成方法为：
[0091] 称取化合物4‑硝基苯甲醛放入圆底烧瓶，加入无水甲醇和磁力搅拌子，用胶塞将口塞上，室温搅拌溶解，用无菌注射器称取硝基甲烷加入其中，搅拌充分混匀；混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，液体变稠，补加无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min，TLC监测，直至原料反应完全；向反应体系中加入冰水，体系溶清，快速加入ml预先配置并预冷的HCl溶液，HCl:H2O 的体积比为2:5，快速搅拌，有黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯的体积比为7:1，得到产物为黄色固体；
[0092] 其中，4‑硝基苯甲醛：无水甲醇：硝基甲烷：补加的无水甲醇：冰水：HCl溶液：无水乙醇的比例g：ml：g：ml：ml：ml：ml为2：4：0.888：1：20：10：1。
[0093] 较优地，所述对氰基‑β‑硝基苯乙烯的合成方法为：
[0094] 称取化合物4‑氰基苯甲醛放入圆底烧瓶，加入无水甲醇和磁力搅拌子，用胶塞将口塞上，室温搅拌溶解，用无菌注射器称取硝基甲烷加入其中，搅拌充分混匀；混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，液体变稠，补加无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min，TLC监测，直至原料反应完全；向反应体系中加入冰水，体系溶清，快速加入预先配置并预冷的HCl溶液，HCl:H2O 的体积比为2:5，快速搅拌，有黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯的体积比为7:1，得到产物为淡黄色固体；
[0095] 其中，4‑氰基苯甲醛：无水甲醇：硝基甲烷：补加的无水甲醇：冰水：HCl溶液：无水乙醇的比例g：ml：g：ml：ml：ml：ml为2：4：1.024：1：20：10：1。
[0096] 较优地，所述对β‑硝基乙烯基苯甲酸甲酯的合成方法为：
[0097] 称取化合物对甲酰基苯甲酸甲酯放入圆底烧瓶，加入无水甲醇和磁力搅拌子，用胶塞将口塞上，室温搅拌溶解，用无菌注射器称取硝基甲烷加入其中，搅拌充分混匀；混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，液体变稠，补加无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min，TLC监测，直至原料反应完全；向反应体系中加入冰水，体系溶清，快速加入预先配置并预冷的HCl溶液，HCl:H2O的体积比为2:5，快速搅拌，有黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥；柱层析，石油醚：乙酸乙酯的体积比为10:1，得到产物为亮黄色固体；
[0098] 其中，对甲酰基苯甲酸甲酯：无水甲醇：硝基甲烷：补加的无水甲醇：冰水：HCl溶液：无水乙醇的比例g：ml：g：ml：ml：ml：ml为2：4：0.817：2：20：10：1。
[0099] 较优地，所述对氟‑β‑硝基苯乙烯的合成方法为：
[0100] 称取化合物对氟苯甲醛放入圆底烧瓶，加入无水甲醇和磁力搅拌子，用胶塞将口塞上，室温搅拌溶解，用无菌注射器称取硝基甲烷加入其中，搅拌充分混匀；混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，液体变稠，补加无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min，TLC监测，直至原料反应完全；向反应体系中加入冰水，体系溶清，快速加入预先配置并预冷的HCl溶液，HCl:H2O 的体积比为2:5，快速搅拌，有黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥；柱层析，石油醚：乙酸乙酯的体积比为10:1，得到产物为黄色固体；
[0101] 其中，对氟苯甲醛：无水甲醇：硝基甲烷：补加的无水甲醇：冰水：HCl溶液：无水乙醇的比例g：ml：g：ml：ml：ml：ml为1：2：0.541：0.5：10：5：1；
[0102] 所述邻溴‑β‑硝基苯乙烯的合成方法为：
[0103] 称取化合物邻溴苯甲醛放入圆底烧瓶，加入无水甲醇和磁力搅拌子，用胶塞将口塞上，室温搅拌溶解，用无菌注射器称取硝基甲烷加入其中，搅拌充分混匀；混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，液体变稠，补加无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min，TLC监测，直至原料反应完全；向反应体系中加入冰水，体系溶清，快速加入预先配置并预冷的HCl溶液，HCl:H2O 的体积比为2:5，快速搅拌，有黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥；柱层析，石油醚：乙酸乙酯的体积比为8:1，得到产物为淡黄色固体；
[0104] 其中，邻溴苯甲醛：无水甲醇：硝基甲烷：补加的无水甲醇：冰水：HCl溶液：无水乙醇的比例g：ml：g：ml：ml：ml：ml为1：2：0.363：0.5：10：5：1。
[0105] 如上所述的抑制剂在制备抑制新型冠状病毒2019‑nCoV 3CL蛋白酶(3C‑like proproteinase， 3CL )药物中的应用。
[0106] 如上所述的抑制剂在制备抗新型冠状病毒2019‑nCoV感染的小分子药物中的应用。
[0107] 具体地，相关制备及检测如下：
[0108] 实施例1半数抑制浓度IC50值的测定实验
[0109] 本实验采用新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(中国碧云天P0312S)，采用荧光共振能量转移(FRET)的方法，通过以下步骤对实施例2‑8进行了抑制活性、IC50测定。
[0110] (1)测定原理
[0111] Edans是荧光供体，Dabcyl是荧光受体(淬灭基团)，当这两个荧光基团间的距离7‑10nm 时，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子荧光强度衰减。Edans和Dabcyl被连接到2019‑nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶的天然底物上的两端，即 Dabcyl‑KTSAVLQSGFRKME‑Edans。当2019‑nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶没有切割该底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dabcyl可淬灭Edans的荧光而导致检测不到荧光；当该底物被2019‑nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，Edans的荧光不再被Dabcyl淬灭，即可检测到Edans的荧光。荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出2019‑nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶抑制剂的抑制效果，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测2019‑nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶的酶活性。
[0112] (2)试剂
[0113] ①抑制剂溶液
[0114] 称取10mg合成的硝基苯乙烯类化合物溶于1ml DMSO中，终浓度10mg/ml，对其进行5 倍梯度稀释，使抑制剂在体系中的终浓度分别为150μM、30μM、6μM、1.2μM、0.24μM。
[0115] ②阳性对照抑制剂
[0116] DMSO溶解的Ebselen(10mM,中国碧云天)。Ebselen结构如下式Ⅱ：
[0117]
[0118] ③酶体系
[0119] 92.5μL Essay Buffer(中国碧云天)
[0120] 0.5μL SARS‑CoV‑2的3CL蛋白酶(中国碧云天)
[0121] ④底物
[0122] 2μL Dabcyl‑KTSAVLQSGFRKME‑Edans荧光底物(中国碧云天)
[0123] (3)实验体系
[0124] 本实验采用96孔黑板，每孔体系100μL，其中包括：93μL酶体系、5μL抑制剂溶液(阳性对照抑制剂溶液)、2μL荧光底物。
[0125] (4)实验步骤
[0126] 取93μL酶体系于96孔黑板中，加入5μL不同浓度的抑制剂溶液，体系中抑制剂的终浓度分别为150μM、30μM、6μM、1.2μM、0.24μM、0μM(阴性对照)，每个浓度做两个复孔。混合30s，室温下孵育10min；低温下每孔迅速加入2μL底物(避光)，放入SpectraMax M2酶标仪中，激发波长340nm，发射波长490nm，读取20min内，每30s荧光值变化。
[0127] (5)抑制率计算
[0128] 酶的催化反应初速度ν以单位时间荧光值的增加值计算，阴性对照(不含抑制剂)酶的催化反应初速度为ν0，抑制剂浓度为c(μM)时酶的催化反应初速度为νc，则一定浓度的样品对酶的抑制率采用下式计算：
[0129]
[0130] (6)IC50曲线绘制
[0131] 以化合物浓度对数为横坐标，SARS‑CoV‑23CL蛋白酶抑制率为纵坐标绘制曲线。根据曲线，采用GraphPadPrism version9.0软件计算IC50值。
[0132] 实验结果：抑制剂存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间变化如图8～图14 所示，结果显示，随着不同浓度β‑硝基苯乙烯类小分子化合物抑制剂的加入，该底物肽被酶催化产生的荧光增强可以被β‑硝基苯乙烯类小分子化合物所抑制，并且这种抑制强弱是浓度相关的。表明硝基苯乙烯类化合物对新型冠状病毒3CL蛋白酶具有抑制作用。
[0133] 实施例2β‑硝基苯乙烯的制备、抑制活性测定
[0134] 2.1合成路线
[0135]
[0136] 2.2合成方法
[0137] 取干燥的100ml圆底烧瓶，称取化合物苯甲醛(3.0g,28.27mol)放入其中，加入无水甲醇6ml，室温溶解搅拌，用无菌注射器称取硝基甲烷(1.89g,31.097mol)加入其中，搅拌充分混匀。混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，搅拌粘稠，补加2ml无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min,TLC监测，直至原料反应完全。向反应体系中加入30ml冰水，体系溶清，快速加入
15ml预先配置并预冷的HCl溶液(VHCl:VH2O＝2:5)，快速搅拌，有大量黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇3ml打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤
1
饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝10：1，得到产物为亮黄色固体420mg，收率10％。H核磁共振谱图如图1。
[0138] 2.3实验结果
[0139] 采用布鲁克光谱仪器公司AV400型核磁共振仪，CDCl3作为溶剂进行了产物的1HNMR 1
分析，图谱见图1，其中：H NMR(400MHz,Chloroform‑d)δ8.01(d,J＝13.7Hz,1H),7.63–
7.53(m,3H),7.53–7.48(m,1H),7.46(dd,J＝8.0,6.2Hz,2H)
[0140] 按照实施例1方法进行活性测定，其抑制活性曲线见图8，其IC50曲线见图15，通过实施例(1)‑(6)方法处理，可得β‑硝基苯乙烯IC50＝1.763μM。
[0141] 实施例3对甲氧基‑β‑硝基苯乙烯的制备、抑制活性测定
[0142] 3.1合成路线
[0143]
[0144] 3.2合成方法
[0145] 取干燥的50ml圆底烧瓶，称取化合物对甲氧基苯甲醛(1g,7.3mol)放入其中，加入无水甲醇2ml，室温溶解搅拌，用无菌注射器称取硝基甲烷(0.493g,8.1mol)加入其中，搅拌充分混匀。混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH 水溶液，滴加过程中有固体析出，搅拌粘稠，补加0.5ml无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min,TLC监测，直至原料反应完全。向反应体系中加入10ml冰水，体系溶清，快速加入5ml预先配置并预冷的HCl溶液(VHCl:VH2O＝2:5)，快速搅拌，有大量黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇0.5ml打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝10:1，得到产物为亮黄色固体956mg，收率73％。
[0146] 3.3实验结果
[0147] 采用布鲁克光谱仪器公司AV400型核磁共振仪，CDCl3作为溶剂进行了产物的1HNMR 1
分析，图谱见图2，其中：H NMR(400MHz,Chloroform‑d)δ7.98(d,J＝13.6Hz,1H),7.55–
7.50(m,2H),7.50(d,J＝2.1Hz,1H),6.98–6.94(m,2H),3.87(s,3H)
[0148] 按照实施例1方法进行活性测定，其抑制活性曲线见图9，其IC50曲线见图16，通过实施例(1)‑(6)方法处理，可得对甲氧基‑β‑硝基苯乙烯IC50＝6.648μM。
[0149] 实施例4对硝基‑β‑硝基苯乙烯的制备、抑制活性测定
[0150] 4.1合成路线
[0151]
[0152] 4.2合成方法
[0153] 取干燥的100ml圆底烧瓶，称取化合物4‑硝基苯甲醛(2g,13.23mol)放入其中，加入无水甲醇4ml，室温溶解搅拌，用无菌注射器称取硝基甲烷(0.888g,14.553mol)加入其中，搅拌充分混匀。混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的 NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，搅拌粘稠，补加1ml无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min,TLC监测，直至原料反应完全。向反应体系中加入20ml冰水，体系溶清，快速加入10ml预先配置并预冷的HCl溶液(VHCl:VH2O＝2:5)，快速搅拌，有大量黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇1ml打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝7:1，得到产物为黄色固体175mg，收率6.8％。
[0154] 4.3实验结果
[0155] 采用布鲁克光谱仪器公司AV400型核磁共振仪，CDCl3作为溶剂进行了产物的1HNMR 1
分析，图谱见图3，其中：HNMR(400MHz,Chloroform‑d)δ8.32(d,J＝8.4Hz,2H),8.04(d, J＝13.8Hz,1H),7.73(d,J＝8.4Hz,2H),7.64(d,J＝13.8Hz,1H)
[0156] 按照实施例1方法进行活性测定，其抑制活性曲线见图10，其IC50曲线见图17，通过实施例(1)‑(6)方法处理，可得对硝基‑β‑硝基苯乙烯IC50＝0.7297μM。
[0157] 实施例5对氰基‑β‑硝基苯乙烯的制备、抑制活性测定
[0158] 5.1合成路线
[0159]
[0160] 5.2合成方法
[0161] 取干燥的50ml圆底烧瓶，称取化合物4‑氰基苯甲醛(2g,15.25mol)放入其中，加入无水甲醇4ml，室温溶解搅拌，用无菌注射器称取硝基甲烷(1.024g,16.78mol)加入其中，搅拌充分混匀。混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH 水溶液，滴加过程中有固体析出，搅拌粘稠，补加1ml无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min,TLC监测，直至原料反应完全。向反应体系中加入20ml冰水，体系溶清，快速加入10ml预先配置并预冷的HCl溶液(VHCl:VH2O＝2:5)，快速搅拌，有大量黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇1ml打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝7:1，得到产物为淡黄色固体380mg，收率 12％。
[0162] 5.3实验结果
[0163] 采用布鲁克光谱仪器公司AV400型核磁共振仪，CDCl3作为溶剂进行了产物的1HNMR 1
分析，谱图见图4，其中：H NMR(400MHz,Chloroform‑d)δ7.99(d,J＝13.7Hz,1H),7.77–
7.73(m,2H),7.66(d,J＝8.3Hz,2H),7.61(d,J＝13.7Hz,1H)
[0164] 按照实施例1方法进行活性测定，其抑制活性曲线见图11，其IC50曲线见图18，通过实施例(1)‑(6)方法处理，可得对氰基‑β‑硝基苯乙烯IC50＝2.043μM。
[0165] 实施例6对β‑硝基乙烯基苯甲酸甲酯的制备、抑制活性测定
[0166] 6.1合成路线
[0167]
[0168] 6.2合成方法
[0169] 取干燥的100ml圆底烧瓶，称取化合物对甲酰基苯甲酸甲酯(2g,12.18mol)放入其中，加入无水甲醇4ml，室温溶解搅拌，用无菌注射器称取硝基甲烷(0.817g,13.398mol)加入其中，搅拌充分混匀。混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L 的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，搅拌粘稠，补加2ml无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min,TLC监测，直至原料反应完全。向反应体系中加入20ml冰水，体系溶清，快速加入10ml预先配置并预冷的HCl溶液(VHCl:VH2O＝2:5)，快速搅拌，有大量黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇1ml打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝10:1得到产物为亮黄色固体
490mg，收率19％。
[0170] 6.3实验结果
[0171] 采用布鲁克光谱仪器公司AV400型核磁共振仪，CDCl3作为溶剂进行了产物的1HNMR 1
分析，图谱见图5，其中：H NMR(400MHz,Chloroform‑d)δ8.14–8.07(m,2H),8.01(d,J＝
13.7Hz,1H),7.65–7.60(m,3H),3.94(s,3H)
[0172] 按照实施例1方法进行活性测定，其抑制活性曲线见图12，其IC50曲线见图19，通过实施例(1)‑(6)方法处理，可得对β‑硝基乙烯基苯甲酸甲酯IC50＝4.263μM。
[0173] 实施例7对氟‑β‑硝基苯乙烯的制备、抑制活性测定
[0174] 7.1合成路线
[0175]
[0176] 7.2合成方法
[0177] 取干燥的50ml圆底烧瓶，称取化合物对氟苯甲醛(1g,124.11mol)放入其中，加入无水甲醇2ml，室温溶解搅拌，用无菌注射器称取硝基甲烷(0.541g,8.9mol)加入其中，搅拌充分混匀。混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，搅拌粘稠，补加0.5ml无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min,TLC监测，直至原料反应完全。向反应体系中加入10ml冰水，体系溶清，快速加入5ml预先配置并预冷的HCl溶液(VHCl:VH2O＝2:5)，快速搅拌，有大量黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇1ml打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝10:1，得到产物为黄色固体523mg，收率 38％。
[0178] 7.3实验结果
[0179] 采用布鲁克光谱仪器公司AV400型核磁共振仪，CDCl3作为溶剂进行了产物的1HNMR 1
分析，图谱见图6，其中：HNMR(400MHz,Chloroform‑d)δ7.98(d,J＝13.7Hz,1H),7.57(dd, J＝5.1,1.8Hz,1H),7.56–7.50(m,2H),7.19–7.12(m,2H)
[0180] 按照实施例1方法进行活性测定，其抑制活性曲线见图13，其IC50曲线见图20，通过实施例(1)‑(6)方法处理，可得对氟‑β‑硝基苯乙烯IC50＝7.596μM
[0181] 实施例8邻溴‑β‑硝基苯乙烯的制备、抑制活性测定
[0182] 8.1合成路线
[0183]
[0184] 8.2合成方法
[0185] 取干燥的50ml圆底烧瓶，称取化合物邻溴苯甲醛(1g,5.4mol)放入其中，加入无水甲醇2ml，室温溶解搅拌，用无菌注射器称取硝基甲烷(0.363g,5.9mol)加入其中，搅拌充分混匀。混合体系在冰盐浴中冷冻充分，缓慢滴加预先配置并预冷的10.5mol/L的NaOH水溶液，滴加过程中有固体析出，搅拌粘稠，补加0.5ml无水甲醇稀释并充分搅拌，冰盐浴中反应5‑10min,TLC监测，直至原料反应完全。向反应体系中加入10ml冰水，体系溶清，快速加入
5ml预先配置并预冷的HCl溶液(VHCl:VH2O＝2:5)，快速搅拌，有大量黄色固体析出，静置，随后抽滤，用冰水淋洗滤饼，滤饼干燥后用无水乙醇1ml打浆2.0h，抽滤，用无水乙醇淋洗，滤
1
饼干燥。柱层析，石油醚：乙酸乙酯＝8:1，得到产物为淡黄色固体340mg，收率 27％。H核磁共振谱图如图7。
[0186] 8.3实验结果
[0187] 采用布鲁克光谱仪器公司AV400型核磁共振仪，CDCl3作为溶剂进行了产物的1HNMR 1
分析，图谱见图7，其中：HNMR(400MHz,Chloroform‑d)δ8.40(d,J＝13.6Hz,1H),7.69(dd, J＝7.7,1.5Hz,1H),7.58(dd,J＝7.6,1.9Hz,1H),7.54(d,J＝13.7Hz,1H),7.36(dtd,J＝
18.5, 7.4,1.6Hz,2H)。
[0188] 按照实施例1方法进行活性测定，其抑制活性曲线见图14，其IC50曲线见图21，通过实施例(1)‑(6)方法处理，可得邻溴‑β‑硝基苯乙烯IC50＝1.051μM。
[0189] 尽管为说明本发明的目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
