[0001] 本发明涉及用于靶标分析物检测的载体分子、包含载体分子的组合物和试剂盒以及使用载体分子检测样品中靶标分析物的方法。更具体地，本发明涉及包含对所述靶标分析物具有特异性的结合部分所结合的分子框架的载体分子。

[0002] 疾病生物标志物的快速和廉价检测在现代保健中变得日益重要，其中不断增加的注意力集中在早期诊断。由于相关生物标志物通常仅以极低浓度存在，因此这提供了巨大技术挑战。理想地，诊断测定将能够检测小体积复杂临床样品中极少生物标志物的存在。当前金标准临床诊断测定通常基于整体平均免疫测定，如ELISA(酶联免疫吸附测定)。在这些中，结合部分，如抗体或抗体模拟物用于捕获样品中的相关生物标志物，并且通常，每个抗体‑生物标志物相互作用促使较小的量达到积累的测定信号。然而，不再能够识别个体免疫相互作用，并且仅将它们自身显示为这种整体平均信号。有争议地，以单一实体分辨率，而不是通过整体平均技术检测生物标志物的能力为超低生物标志物浓度的检测提供了显著优势。

[0003] 在近些年已发展的多种单分子方法中，其中跨纳米孔施加电压并将电压以随时间变化的电化学电流的形式脉冲的纳米孔用于检测单个蛋白的用途是有前景的方法。在本文中，移位通过纳米孔的单一蛋白在否则将稳定的离子电流中引起短暂调节。该方法已在一些单分子蛋白和DNA检测研究中使用。

[0004] 然而，除了这些进步之外，仍存在显著困难。从复杂混合物检测特定分子是非常困难的，因为当纳米孔直径大于分子尺寸时，单一实体的移位速度通常较高，并因此移位仅导致产生弱信号和相应低的信噪比。此外，由不同蛋白所产生的信号通常非常类似并且难以区分。为了解决这些限制，已实施了多种策略，包括通过小心选择电解质和开发高带宽电子设备来减缓蛋白移位。另外，已研究了纳米孔的化学和生物学改性(修饰，modification)以及混合纳米孔的使用来提高灵敏性和选择性。最近，已利用大载体分子，包括纳米颗粒、抗体和长直链dsDNA分子来容纳受试者分子并借此提高质量，并因此降低受试者分子的移位速度。

[0005] 尽管由于修饰和工程化系统的容易性，已成功使用了DNA基(DNA‑based)载体并且提供了适合的载体系统，但是长直链DNA载体不是无限制的—它们倾向于形成结(knots)和扭结(kinks)，这些已知在纳米孔移位期间提供假阳性信号。此外，由于多个DNA分子通过纳米孔，基于移位取向和高堵塞率，已注意到信号中的显著变化。为了试图克服这些限制，近期的工作已将单分子荧光与纳米孔检测组合以实施单分子结合测定。尽管精巧，但是与不需要标记的简单电学读取系统相反，这种方法通过引入标记和复杂光学装置消除了纳米孔传感的关键优势。

[0196] 实施例

[0197] 材料和方法

[0198] DNA折纸设计

[0199] 使用9073bp、8515bp和6307bp的定制单链DNA(ssDNA)支架设计了3个同心正方形折纸，然而从来自Tillibit(Garching,Germany)的7249bp m13mp18 ssDNA设计了在本项目中用作载体的DNA纳米结构。以下提供了定制支架的程序。用于各个纳米结构设计的所有短订书钉链购自IDT(Coralville,IA,USA)。

[0200] 使用caDNAno软件设计所有DNA折纸纳米结构。对于折纸折叠，将ssDNA支架与十倍摩尔过量的订书钉链的混合物在含有10nM TrisAc(pH 7.4)、10mM MgAc和1mM EDTA(Sigma Aldrich,USA)的折叠缓冲液中加热至95℃，然后以1℃/分钟的降低速率冷却至室温。然后，通过Sephacryl S400(GE healthcare,UK)尺寸排阻柱，通过除去过量订书钉纯化折叠结构并洗脱到相同折叠缓冲液中。

[0201] 在第二热退火步骤(加热至35℃，随后以0.5℃每分钟降低至室温)中，在纯化步骤之前在存在订书钉的情况下，或者作为另外一种选择，在纯化步骤之后立即，将含有具有5'(适体1)和3'(适体2)胺连接的修饰的末端序列的适体序列引入载体设计。任一种方式致使产生了插入适体的准确折叠的框架DNA折纸载体。

[0202] 特异性hCRP适体1：

[0203] NH2‑AAGCCTTTATTTCAACGGCAGGAAGACAAACACGATGGGGGGGTATGATTTGATGTGGTTGTTGCATGATCGTGGTCTGTGGTGCTGT(SEQ ID NO.1)

[0204] 特异性hCRP适体2：

[0205] CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTGTTTTTTTTTTTTGCAAGGATAAAAATTT‑NH2(SEQ ID NO.2)

[0206] 非特异性随机适体：

[0207] NH2‑CTGAACAAGAAAAATAGCAGAACTTACGAGCCAGGGGAAACAGTAAGGCCTAATTAGGTAAAGGAGTAAGTGCTCGAACGCTTCAGA(SEQ ID NO.3)

[0208] SPR研究

[0209] 通过来自Metrohm Autolab B.V(Utrecht,The Netherlands)的ESPRIT SPR仪进行适体‑蛋白结合研究。为此，通过EDC(1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳二亚胺)NHS(N‑羟基琥珀酰亚胺)偶联化学，将连接胺基的末端修饰的适体锚定在用C11PEG6COOH的自组装单分子层(SAM)官能化的金SPR表面上。通过在丙酮中超声处理两次，每次10分钟来清洁来自XanTec bioanalytics的金SPR表面，然后将其浸没在含有5％乙酸的乙醇1mM SAM溶液中并使其在室温静置48小时。在温育后，用100％乙醇漂洗表面，用氮气快速干燥并固定在SPR系统上。为了将DNA适体连接至金表面，用50mM EDC和200mM NHS在100mM MES缓冲液中的溶液，在pH5.5激活COOH‑封端的SAM表面约15min。用MES缓冲液清洗表面，随后与5μM DNA适体在10mM乙酸钠缓冲液中，在pH5.5温育30分钟。通过将所述表面暴露于100mM乙醇胺的水溶液约10min，使任何剩余的激活的COOH位点淬灭。然后，用结合缓冲液(10mM TrisAc、10mM MgAc、2mM CaCl2和1mM EDTA的水溶液)清洗表面，然后用不同浓度的人CRP进行激发。作为共振角变化测量结合。

[0210] 同心正方形折纸的产生

[0211] 将修饰的噬粒(具有m13区的质粒)用于产生具有不同长度的3个支架以产生具有类似外部尺寸，但是不同腔体尺寸的DNA折纸。从来源于λ噬菌体DNA的两个不同的片段以及pBluescript II SK(+)噬粒(PBS)，将3种DNA折纸(同心正方形(Con)A、B和C)所需的支架连接在一起。PBS(+)是含有噬菌体复制起点(f1 ori)和抗生素抗性基因的质粒，其允许通过辅助噬菌体的有义链挽救(sense strand rescue)。通过将作为来自λ噬菌体的两个不同的片段所获得的6.1kb序列插入2.9kb噬粒，产生了DNA折纸ConA所需的9kb常规支架。选择缺少蛋白编码区的这两个片段(约1.8kb和4.2kb)以消除噬菌体生长和下游过程中的任何干扰。

[0212] 使用适当引物，分别从λ噬菌体DNA和PBS质粒PCR扩增了称为f1、f2和f3的组成支架的这3种片段。设计在扩增程序中所使用的引物以引入侧接f2的限制性位点EcoRI和NspI，和侧接f3的NcoI和NspI。然后，用各个酶限制性水解这两个片段以形成相容性悬突，然后连接以获得一个长片段(f23)。然后，使用HiFi DNA组装克隆(NEB,UK)将片段f1与片段f23组合，从而产生了双链环形f123 dsDNA。

[0213] 随后，在感受态大肠杆菌(E.coli)细胞中化学转化环形dsDNA(f123)以生产常规支架。使用它们的抗生素抗性基因选择具有f123质粒的转化细胞并通过miniprep回收，从而与辅助质粒(m13cp细胞)共转化以产生ssDNA f123。最终的ssDNA f123产物具有9073bp并且构成了用于最大DNA构建体ConA的支架。

[0214] 通过作为模板的双链f123的PCR扩增产生了两种较小的DNA构建体ConB和ConC的支架。如前所述，设计引物以引入产物ConB的限制性消化位点KasI和产物ConC的BmtI。如上所述，后续限制和连接，以及随后与辅助质粒的类似的共转化规程分别对Con B和C产生了8515bp和6307bp的ssDNA支架。首先，在5ml培养物中产生支架，随后通过按比例放大至1升培养物收获大规模支架。通过从噬菌体分离细菌以及后续的酚氯仿DNA提取，收获培养物。

[0215] 纳米移液器的制造和离子电流测量

[0216] 使用Sutter instrument的P‑2000型激光拉伸仪(laser puller)，从内径0.5mm的玻璃毛细管(QF100‑50‑7.5,World precision Instruments,UK)制造具有约100nm孔径的纳米移液器。拉伸规程包括使用参数HEAT 575FIL 3VEL 35DEL 145PULL 75和HEA T900 FIL 2VEL 15DEL 128PULL 150的两条不同的线。所述规程显示出高度一致的玻璃纳米移液器，在不同天拉伸移液管时，标准偏差小于±12nm。将Ag/AgCl丝(0.25mm直径,Sigma Aldrich,UK)作为工作电极插入纳米移液器。

[0217] 对于移位实验，将具有工作电极的纳米移液器充满含有最终浓度500pM的DNA折纸和(在适用情况下)分析物的移位缓冲液(具有10mM TrisAc、10mM MgAc、2mM CaCl2和1mM EDTA的0.1M KCl)。Mg是维持DNA折纸稳定性所需的，以及Ca，匹配用于选择用作结合部分的DNA适体的缓冲条件。将接地反电极浸没在0.1M KCl溶液中，从而接通电路。在向纳米移液器内部的工作电极应用负电势时，来自纳米移液器内部的DNA折纸移位出来并进入电解质溶液，从而致使离子电流的调节。使用Axon instruments‑膜片箝制系统(Molecular devices,USA)采集离子电流数据。使用Axopatch 700b放大器记录测量，并以100kHz和20kHz的低通过滤采集数据。通过常规MATLAB脚本(由Joshua Edel教授提供，Imperial College,London,UK)进行原始数据分析并且使用Pro FIT(QuanSoft,Switzerland)进行了进一步数据分析。

[0218] AFM

[0219] 将DNA折纸样品在室温下在新切割的云母片上沉积10‑15分钟，并且装满含有10mM TrisAc(pH 7.4)和10mM MgAc、1mM EDTA的扫描缓冲液。对于观察对载体的蛋白结合，类似于纳米移液器移位实验，在扫描缓冲液中包括2mM CaCl2。使用Bruker  Dimension Fastscan(Santa Barbara,CA,USA)，以含有Si尖头的Fastscan D Si3N4悬臂，以轻敲模式在液体中对DNA折纸样品成像。以20kHz(256×256像素)的扫描速率获得图像。

[0220] 实施例1：同心正方形

[0221] 假设如果设计DNA折纸以包括所关注的分析物可以特异性结合至其中的中心腔体，则可以通过观察特征移位离子电流峰，使用纳米孔由所述折纸检测分析物的存在或不存在。可以根据观察到的大量单独峰计算两个特征不同的峰的频率以获得分析物‑浓度相关信号。

[0222] 为了获得对DNA折纸中腔体设计参数的进一步理解，我们设计了具有相同外部尺寸，但具有不同腔体尺寸的3种不同的DNA纳米结构。3种DNA纳米结构类似于一组3个同心正方形并且对于实体纳米结构(100nm长×85nm高)称为ConA，对于具有相同外部尺寸，但含有30nm长×12nm高和65nm长×35nm高的中央腔体的纳米结构，分别称为ConB和ConC，如图1a所示。

[0223] 所述同心正方形纳米结构均设计以根据所建立的DNA折纸原理折叠。3种瓦片均由相同DNA制成，即通过支架的简单缩短并省略适当的订书钉的相同组的DNA寡核苷酸订书钉和DNA支架，以产生具有不同尺寸的腔体。例如，用于组装ConB的支架DNA与用于组装ConA的那种支架DNA相同，但是除去折叠成中心部分的部分。这确保在改变腔体尺寸时，所述结构尽可能在DNA折纸之间保持相同，从而我们可以将离子电流特征与腔体体积直接关联。

[0224] 通过原子力显微镜(AFM)对折叠的DNA纳米结构成像以确认成功组装。图1b显示了代表性AFM图像，并且可以看出如所预期，形成了全部3种结构。据发现ConA为107×86nm，并且ConB和ConC具有107×86nm的类似外部尺寸，并且腔体分别为29×11nm和65×38nm。

[0225] 实施了各个同心正方形样品通过约100nm孔径的玻璃纳米移液器的纳米孔移位研究。通过激光器拉伸制造了纳米移液器并且显示在0.1M KCl中86±10MΩ的电阻。通过将500pM浓度的样品溶液加载到纳米移液器中并记录离子电流，同时在纳米孔间施加‑350mV的恒定电压来实施同心正方形移位。

[0226] 图1c显示了移位通过纳米孔的各个纳米结构的代表性离子电流特征。当将腔体引入纳米结构中时，所观察到的峰结构从单峰(无腔体存在)变化为双峰(存在腔体)，其中双峰变得更明显，腔尺寸增加(ConC的双峰高度为37pA vs ConB的14pA，图2)。对于每个纳米结构，至少100个离子电流峰的更详细的定量分析显示对于不同纳米结构，平均峰幅度和停留时间差异显著(图3)。

[0227] ConC(大腔体)显著更缓慢地移位通过纳米孔(停留时间＝0.31±0.14ms)并且当与ConB相比时(小腔体；停留时间＝0.22±0.06ms和峰值幅度＝97±13pA)，产生了较小的离子电流升高(峰幅度＝86±19pA)。相反，ConA(无腔体)纳米结构产生了最大的离子电流升高(峰值度＝121±23pA)，以及最短的停留时间(0.15±0.01ms)。当综合时，这些参数允许我们识别不同的群(图1d)。

[0228] 实施例2：生物传感中作为移位载体的DNA纳米结构

[0229] 移位离子电流峰特征与这些DNA纳米结构内腔体几何形状的关系提供了检测小得多的分子存在的唯一机会。如果将对所关注的分子特异的结合部分置于DNA纳米结构空腔内，则靶标分析物与结合部分的结合部分填充了空腔，其进而致使特征转变为离子电流特征(图4a)。

[0230] 为了研究这种现象并且作为原理验证，我们显示了C‑反应蛋白(CRP)的定量检测，它是确立的炎症生物标志物。在健康成年人中，中值CRP浓度为0.8mg/L，并且其血液浓度由于炎症反应超过1mg/mL(8μM)。CRP作为五聚物存在，其分子量为约125kDa并且尺寸为约11nm。我们设计了具有中央腔体的DNA纳米结构，所述中央腔体对于CRP分子足够大以进行配合，同时足够小，从而CRP在腔体中的存在将造成移位离子电流可测量的差异。如通过使用同心正方形的研究所报告的(实施例1)，设计了具有35长×35nm宽的中央腔体的纳米结构以提供稳健的双峰特征(图4b)。

[0231] 在所述中央腔体内引入内部锚定柱，从而可以通过DNA杂交将特异性捕获部分置于空腔内部(图4b)。为了能够进行选择性CRP检测，我们从文献中选择了两种良好表征的CRP DNA适体(适体1和适体2)作为潜在捕获部分。我们注意到尽管本文所使用的DNA适体序列与发表的那些相同，但是对于本发明申请，适体必须分别在它们的5'和3'末端延伸，从而它们可以杂交到腔体内。为了确保DNA适体仍以预期发挥作用，我们通过表面等离子共振(SPR)确认CRP结合至延伸的适体。如所期望的，两种DNA适体继续结合CRP。适体1显示出比适体2更快速的结合动力学，并因此将其选择用于生物传感器概念的详细验证。

[0232] 在DNA折纸的一个角落还包括了凹口以起到极性标志物的作用以识别AFM图像中折纸的取向(图4b)。将完整的DNA纳米结构和适体组装体称为载体。

[0233] 通过凝胶阻滞测定研究了载体环境内DNA适体的表现(即DNA纳米结构内杂交的适体，图4b)。将9nM载体溶液与逐渐升高的浓度的CRP(9、18、27、36nM)在移位缓冲液中(0.1M KCl，含有10mM MgAc、2mM CaCl2和10mM TrisAc和1mM EDTA)在室温下一起温育30分钟。凝胶显示载体条带的浓度依赖性改变，其证明了CRP与载体的成功结合。在如上所述的类似缓冲条件下，通过AFM进一步确认了结合至载体(9nM)的CRP(36nM)，其中在结合至适体的腔体中清楚地观察到了CPR，它与嵌入的极性标志物相反。

[0234] 为了在单分子纳米孔传感中利用DNA纳米结构载体，占位和空位载体需要具有与载体内CRP的存在相关的独特指纹(由离子电流峰的停留时间、幅度和形状组成)。如上实施了使用玻璃纳米移液器的载体(浓度500pM)的纳米孔移位研究。超过100个移位峰的定量分析显示出65±6pA的峰值幅度和0.29±0.1ms的停留时间(图4c，上部)，其与含有腔体的类似尺寸的DNA纳米结构的上述观察结果相当。

[0235] 类似地，为了分析CRP占位载体，我们为了具有占位和空位载体的混合群，使用了CRP的等摩尔溶液和9nM的载体。将溶液在室温下在移位缓冲液中温育30min并在500pM浓度下进行纳米移液器移位，其产生了离子电流的单峰和双峰混合群。两类峰的峰幅度和停留时间的分析显示出双极性分布。双峰具有62±4pA的平均峰幅度和0.33±0.03ms的停留时间(图4c，底部；n>100)。相反，超过50个单峰的分析显示出分别为0.15±0.05ms和90±9pA的平均停留时间和峰幅度，其证实了由于CRP结合所造成的两个量的显著改变(图4c，下部)。我们注意到较低的峰幅度和更长的停留时间非常类似于对于空位载体所观察到的那些。

[0236] 与显示当中央腔体填充时，峰形从双峰变为单峰的同心正方形研究结果结合，我们推测单峰事件对应于占位载体，即具有结合至特异性适体的CRP的载体。此外，双峰占所观察事件总数的约30％。这与基于得自SPR实验的Kd所预期的占位载体的百分比一致，其表明如所期望的，所述百分比是浓度相关的。

[0237] 然而，为了使用这种方法进行高灵敏度生物传感，需要对不同离子电流事件进行分类的可靠方式。图5a(i)显示了对于空位载体移位所观察到的离子电流峰的峰幅度相对于停留时间的散点图。将类似于双峰形状的所有事件显示为空心圆形和空心倒置三角形。实心三角形代表了无法分类的事件。为了消除异常值并确保稳健分类，如果所测量的峰幅度和停留时间在图中所示的95％置信椭圆内，则仅将离子电流事件分类为表示空位载体的真实双峰(通过空心圆形表示)。通过空心倒置三角形表示在该边界以外的峰并且其将不会被认为是代表空位载体的事件。

[0238] 类似地，图5a(ii)显示了对于与预期导致大多数载体占位的10倍过量的CRP温育的载体移位所观察到的离子电流事件的峰幅度相对于停留时间的散点图。将类似于双峰形状的所有事件显示为空心圆形和空心倒置三角形。将单峰显示为实心圆形和空心三角形。将所有其它事件显示为实心三角形，其表明它们不可以分类。如上所示，为了确保单峰的稳健分类以表示CRP占位载体，将95％置信椭圆(表示为浅灰色(左手)椭圆)用作进出过滤器(in‑out filter)。仅属于该95％置信区域的单峰被认为是由CRP占位载体(通过实心圆形表示)的移位所产生的，所有其它单峰被认为是无法分类的(通过空心三角形表示)。为了分类双峰并借此建立表示空位载体的事件数，显示了来自示图(i)的置信椭圆(作为深灰色(右侧)椭圆)，并且目前仅属于该区域的双峰事件被认为代表空位载体(空心圆形)，同时排除了该区域以外的那些(空心倒置三角形)。

[0239] 目前，这使得能够将所观察到的离子电流峰分类为3类，表示空位载体的双峰，表示CRP占位载体的单峰，和既不是双峰也不是单峰的未分类峰。这种多参数分类允许以稳健方式丢弃模糊的移位事件，例如，由破碎载体所产生的事件。这些事件将可能类似于单峰，2+
并因此代表假阳性。为了说明这种情况，在移位前通过在10mM CaCl2中温育30min以用Ca
2+
置换成分Mg 来故意破坏所述DNA纳米结构。AFM显微照片显示所述载体已显著降解。在移位实验期间，仅记录了极少事件，并且峰幅度vs停留时间的散点图显示所记录的峰均不在相关置信椭圆(图5b和c)中，从而证实了分类方法的稳健性。照此，通过以上所讨论的分类程序，通过过滤单峰有效限制了样品中来自破碎或截短载体的假阳性计数。我们注意到移位
2+
缓冲液中Ca 的低浓度不显著影响载体。即使将载体在移位缓冲液中温育4小时之后，通过以上分类方法仅少数(约10％)移位事件将分类为CRP占位载体。

[0240] 重要地，由于与CRP直径(11nm)相比，纳米移液器孔(100nm)的大尺寸，单独的CRP的移位不导致可检测的离子电流特征并因此不可以通过我们的纳米移液器传感器检测(图4d)。类似地，溶液中任何其它分子也将不导致任何信号，借此既不造成噪音，也不造成假阴性或阳性。

[0241] 实施例3：定量单分子生物传感

[0242] 为了证实使用具有特异性DNA适体的载体移位的定量传感以及对通过3参数法分类的单一各个载体分子计数的概念(峰停留时间、幅度和形状)，我们分析了不同CRP浓度下一定范围的移位实验的离子电流。

[0243] 图6a显示了不同CRP浓度范围的一系列代表性离子电流峰。对于每个浓度，如以上所述分类所观察到的离子电流事件。当单峰或双峰不满足过滤标准时，将它们标记为“未分类的”并且不考虑浓度分析(图6b)。这种未分类的峰代表了2分钟迹线中事件总数的9‑36％。

[0244] 图6c显示了对于3nM至90nM的不同的CRP浓度，归一化的单峰计数，即分类的单峰相对于分类峰总数。如所期望的，归一化的单峰计数随着CRP浓度升高而升高。使用解离常数Kd作为唯一拟合参数，通过郎格缪尔等温线拟合数据，并且作为实线显示结果。得自拟合的Kd为11±2nM。

[0245] 为了研究我们的传感系统的特异性并且具体地载体对CRP靶标的特异性，选择随机DNA序列以起到非特异性适体的作用，并且对于9nM的载体浓度和90nM的CRP浓度(即图6中报道的最高浓度)测量了移位离子电流。图7显示了离子电流事件的分析。发现了平均值分别为69±5pA和0.3±13ms的峰幅度和停留时间的单一分布，这与对于空位载体所测量的值一致。散点图清楚地显示仅识别了双峰，并且无单峰，从而证实了非特异性适体不导致产生任何检测信号。

[0246] 此外，对CRP特异性载体(浓度9nM)进行90nM具有与CRP类似尺寸的对照蛋白(MupB)，并且图7显示了离子电流分析结果。类似于非特异性适体，观察到停留时间和峰幅度(平均值为0.25±0.1ms和60±7pA)的单一分布，这与空位载体的那些一致。散点图清楚地显示未识别单峰(n>50)，从而证实无MupB结合至CRP载体。

[0247] 在2分钟采样窗口内，在约5μl样品中实现了低至3nM CRP的使用3参数分类(幅度、停留时间和离子电流特征)的定量检测。

[0248] 重要地，实施了类似的研究，但是在载体中引入了不同的CRP特异性适体(适体2)。获得了与具有CRP适体1的载体形式非常类似的结果，从而证实了生物传感方法的稳健性。

[0249] 对于在临床诊断学中的应用，重要的是还可以在复杂生物流体中进行分析物，如CRP的定量检测。为了证实使用这些流体的这种传感系统的表现，用在0.1M KCl中稀释的5％人血浆溶液填充纳米移液器，并且用在3nM至36nM的范围内的所期望的CRP浓度加标(spike)。类似于缓冲液中的情况，无CRP的5％血浆中的载体产生了离子电流双峰事件，但是具有稍低的停留时间0.26±0.06ms和峰幅度55±6pA(图8a，n>50)。相反，据发现对于占位载体，在5％血浆(峰幅度0.12±0.04ms且停留时间98±1pA，n>30，图8b)和缓冲液(0.15±0.05ms和90±9pA)中实验之间的峰特征，即在加标CRP的5％血浆中所观察到的单峰一致。

[0250] 以与缓冲液中相同的方式，在具有5％血浆的移位实验期间所观察到的不同的离子电流事件可以分为单峰、双峰和未分类峰。图9显示了对于所有CRP浓度的峰幅度相对于停留时间的散点图，其中以与缓冲液实验中相同的方式表示分别选择为代表CRP占位和空位载体的单峰和双峰。

[0251] 图8c显示了作为CRP浓度的函数的归一化单峰计数，即单峰vs总分类的峰之比。类似于缓冲液中的结果，归一化的单峰计数随CRP浓度而升高并且符合类似的行为。估计检测限为9nM(与纯缓冲液中的3nM相比)。我们注意到对于血浆样品中多种CRP浓度所观察到的未分类事件数目(9至25％)类似于纯缓冲液中所观察到的那些。

[0252] 实施例4：载体多路检测和标识条型码

[0253] 为了多路实施生物传感技术，我们可以通过将多个DNA纳米结构连接在一起形成“带”或聚合物。这些带可以含有两种功能元件；1)分析物检测区和2)条型码区。

[0254] 分析物检测区包含采取已描述的载体分子的形式的结构，其包含核酸框架和结合部分。空的或空位框架在离子电流信号中产生双峰，然而结合的分析物的存在产生单峰。

[0255] 条型码区用于识别所述带，并且正是该区域能够检测单一样品中的多个分析物。条型码区利用了在离子电流特征和纳米结构几何形状之间所识别的关系，例如，实体瓦片结构产生单峰，而框架样结构产生双峰。这种情况更精细的实施包括框架腔体尺寸的改变以提供额外的信号。条型码区可以包括以特定顺序连接在一起的两个或更多个亚基以提供独特的离子电流指纹。这些布置是固有模块化的，并因此提供了灵活且经济的方法。

[0256] 图10a显示了多路带状结构10的实施方式。使用实体核酸瓦片14和核酸框架16的具体组合产生了身份条型码区12。实体‑框架‑实体的布置将提供单峰‑双峰‑单峰的离子电流指纹。

[0257] 将条型码区12连接至包含含有第一适体A1的第一检测框架20和含有第二适体A2的第二检测框架22的检测区18。在所示实施方式中，第二适体A2对不同于第一适体A1的分析物特异，尽管将理解在替代实施方式中，所述适体可以是相同的。3个其它核酸框架16、24分别缺少结合部分，其构成检测区18。然而，将理解该方法是固有模块化的并且可以以任何方式重新布置纳米结构亚基以出于所期望的目的，提供独特的条型码/分析物带。

[0258] 通过间臂26将图10a所示的带结构10的框架和瓦片连接在一起。

[0259] 可以通过伸出的DNA接头的相互作用实现DNA纳米结构亚基一起与带的连接。图10b显示了其可以如何实施的实例，但是将理解可以以一些不同方式实现使用DNA接头对邻近结构的连接。通过位于这些接头末端的特异性DNA序列的互补碱基配对决定了这些相互作用的特异性以及因此哪个亚基与哪个结合。用于指明这些相互作用的DNA序列是可变且可调节的。这使得能够设计接合的特异性和调节相互作用的强度(即整个DNA配对的熔融温度)。这种相互作用强度也是通过改变亚基间的DNA接头数目可调节的(例如，在一些实施方式中，可以为1至6)。

[0260] 结论

[0261] 我们已证实了使用对所关注的靶标分析物具有选择性且敏感的核酸框架，具体地DNA折纸纳米结构的替代载体分子方法。通过使用DNA折纸对移位离子电流的确定结构特性，我们使用框架DNA纳米结构结合玻璃纳米移液器作为可以检测和定量单一分析物分子的生物传感平台。我们表明通过折叠通常作为对于纳米孔实验所选的载体的长直链DNA，可以克服多种阻碍。DNA折纸载体的特异性离子电流特征不仅去除了由于结和折叠所造成的假阳性事件，而且还消除了使用修饰的长直链DNA链相对于其移位方向所遇到的“尾至头”和“头至尾”事件。这意味着我们的载体显示出可以通过特异性离子电流特征，而不是对于直链DNA所产生的多种离子电流导电事件来进一步验证的类似的峰幅度和停留时间移位数据。

[0262] 此外，本发明的载体的空间可寻址性有助于DNA纳米结构中结合部分，如适体在可以影响离子电流的特定位置的并入。

[0263] 另外，除峰幅度和停留时间差异外，离子电流特征相对于靶标分析物(CRP)位置的变化提供了对靶标捕获的目视指示(双峰向单峰)。通过这种3因素技术，我们可以以低浓度、高特异性地定量检测单一分析物分子。重要地，实验证明了载体以如简单的KCl缓冲液中所示的类似的灵敏性和信噪比检测复杂血浆样品中靶标分析物的能力。

[0264] 核酸框架载体的另一个优势在于可以使用显微镜技术使靶标捕获现象。此外，可以对于多路检测容易地修饰载体分子，从而使得能够同时检测不同靶标分子。