技术领域
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一种根癌农杆菌及应用。
相关背景技术
[0002] 六氯丁二烯(hexachlorobutadiene,POPs)是氯代烯烃的一种，主要用作人造橡胶、传热液体、变压器及液压油等的溶剂，也是三氯乙烯、四氯乙烯和四氯甲烷等氯代烃生产过程中的副产品。随着近年来化工企业的发展，六氯丁二烯及其氯代衍生物的种类及用量逐年增加，但是由于其毒性、致癌性及在沉积物中的持久性，已被多个国家列为优先污染物，且该化合物已被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》的全球监管名单并被划归为一种新型POPs。
[0003] 六氯丁二烯的水溶性很低且具有亲脂性，辛醇‑水对数系数log/LKow为4.78。它具3
有较高的亨利定律常数(1044Pa m/mol)，可从水中和潮湿物体表面挥发。由于其疏水性和挥发性，六氯丁二烯不会在水中停留很长时间，且会分散到大气中或吸附到沉积物表面。
Jennifer等对无脊椎动物和鱼类的几项实验研究表明，六氯丁二烯具有生物累积的潜力，排放到环境中六氯丁二烯可通过呼吸、摄入、直接接触等方式被生物体吸收，久而久之可导致人体内肝脏、肾脏、中枢神经等发生病变。因此，为了修复被六氯丁二烯污染的环境以及保护人类健康，寻找一种高效的六氯丁二烯降解方法是非常有必要的。
[0004] 目前报道的六氯丁二烯的处理方法有物理、化学和生物方法，其中物化处理方法开始于上世纪90年代，Baillet等对六氯丁二烯进行了热学实验研究，结果表明，空气中浓度为1000ppmV的六氯丁二烯在700‑850℃发生热降解，可检测到约30种从C1到C8的分子氯代产物，主要有二氧化碳、一氧化碳、四氯化碳和光气，其中光气是主要的氯化产物。微生物降解研究方面，Li等通过富集培养的方法从污泥中分离并纯化了一株能够以六氯丁二烯为唯一碳源和能源生长的细菌Serratia marcescens HL1，结果表明，该菌的静息细胞可以去除六氯丁二烯，并在有氧条件下释放氯离子，20mg/L/L(即76.69μM)的六氯丁二烯可在4天内被降解完全，当六氯丁二烯浓度高达160mg/L/L(0.61mM)时，会对HL1的降解产生抑制作用，因此该菌株对于浓度较高的六氯丁二烯的处理效率不高。
[0005] 六氯丁二烯因其高毒性、致癌性及在沉积物中的持久性且不溶于水，难降解，故很有必要找到一种快速且高效的六氯丁二烯微生物降解方法。
具体实施方式
[0020] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0021] 需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 鉴于现有技术中，对于高浓度六氯二丁烯难以降解的技术问题，本发明提供发明提供一种根癌农杆菌，所述根癌农杆菌分类命名为根癌农杆菌(Agrobacterium sp.)BJ‑04，保藏号为CCTCC No:M 2022213，保藏时间为2022年3月08日；保藏中心为中国典型培养物保藏中心，保藏地点为武汉大学。
[0023] 现有技术中，大多数降解有机物的菌株，是基于生物底物培育下的降解，即需要生物碳源，这对于工业领域生成的六氯丁二烯，该类微生物显然是受到使用限制的。在本发明中，通过筛选培育出的菌株，可降解六氯二丁烯,并且以六氯丁二烯为唯一碳源生长,且在高浓度六氯丁二烯存在的情况下，依旧保持高的降解效率。
[0024] 需要说明的是，本发明中，通过采用通用引物对所述根癌农杆菌的16S rRNA基因的序列进行检测，最终获得如SEQ.ID.NO.1所示。
[0025] 此外，本发明提供一种上述根癌农杆菌在降解有机物上的应用，所述有机物包括己烷、环己烷、苯和六氯丁二烯中的至少一种。本发明研究团队发现，上述有机类物质，均可以作为本发明根癌农杆菌的单独碳源，这使得本发明菌株对于工业类产生的有毒有机物质的降解更加广泛。
[0026] 可选地，所述有机物包括六氯丁二烯。本发明研究发现，在含有2mM六氯丁二烯的条件下，本发明筛选出的根癌农杆菌依旧具有较高的降解效果。
[0027] 此外，本发明还提工一种降解有机物的方法，所述降解有机物的方法包括将上述根癌农杆菌接种在含有有机物的底物上，对所述有机物进行发酵降解，其中，所述有机物包括己烷、环己烷、苯、正丁醇和六氯丁二烯中的至少一种。
[0028] 可选地，所述底物还包括无机盐化合物。在底物中含有无机盐时，作为营养物可进一步提高降解效率。无机盐化合物可以是 KH2PO4、FeSO4、H3BO3、CuSO4、MnSO4·、ZnSO4以及 中的一种或多种。
[0029] 需要说明的是，本发明菌株涉及的菌株处理环境在可生长的情况下，其降解可在溶液、土壤、乳液、凝胶或气体中进行，具体可以通过调节相应的培育方式加以限制。
[0030] 实施例1
[0031] 本实施例提供一种根癌农杆菌，根癌农杆菌分类命名为根癌农杆菌(Agrobacterium sp.)BJ‑04，保藏号为CCTCC No:M 2022213，保藏时间为2022年3月08日。
其筛选过程如下：
[0032] (1)六氯丁二烯降解菌的筛选
[0033] 从武汉市东西湖区马池桥下沉积污泥多点采样，在超净工作台中取5g/L污泥加入到含2mM六氯丁二烯的100mL无机盐培养基( 14.3g/L、KH2PO4 3g/L、FeSO4 0.03g/L、H3BO3 0.0125g/L、CuSO4 0.125g/L、 ZnSO4
0.0125g/L、 于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min)中，并添
加终浓度为2mM的(NH4)2SO4，在200rpm、28℃的恒温摇床中震荡培养，每隔7天传代一次，传代时将培养液静止30min，取上清10mL接入新鲜的含2mM六氯丁二烯的100mL无机盐培养基中，继续富集培养，传代4‑5次，直到获得具有稳定降解效果的富集培养液。
[0034] (2)降解菌的分离与纯化
[0035] 将培养液梯度稀释后涂布于含2mM六氯丁二烯的无机盐固体培养基(无机盐培养基+15g/L/L琼脂粉)，用微量的甲醇溶解后再加入到已熔的固体培养基倒平板。将平板上长出的单菌落再次接入到含六氯丁二烯的无机盐液体培养基中，再次将培养液梯度稀释涂布于六氯丁二烯的平板上，此分离纯化的过程重复3‑4次，直到平板上出现单一的菌落。最终分离到一株能够利用六氯丁二烯为唯一碳源生长的降解菌，该菌株单克隆颜色浅蓝且形状扁平，分离后的菌落图，如图1所示。
[0036] (3)16S rRNA基因测序鉴定菌株
[0037] 采用菌落PCR技术对降解菌株进行16S rRNA基因扩增，所用通用引物序列如SEQ.ID.NO.2～SEQ.ID.NO.3所示。扩增体系：2*Taq Master Mix 25μL，引物27F和1492R各1μL，模板4μL(菌体加少量无菌水100℃煮15min，离心后取上清为模板)，用无菌水补足50μL。PCR反应条件：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，30个循环，最后
72℃5min。将PCR产物取少量进行琼脂糖凝胶电泳检测，将剩余PCR产物送样到上海生工生物股份有限公司进行测序，将测序得到的序列用“Lasergene”相关软件进行拼接后在NCBI数据库中在线比对，并将该菌株测序的16S rRNA基因序列与其一致性较高的序列运用MEGA7.0软件构建系统发育树。
[0038] PCR结果见图2，电泳条带与DNA Marker比较，其中，CK为空白对照，1检测通道，其片段大小为1500bp左右，将PCR产物进行测序，将正反向测序序列进行拼接，得到1478bp的基因片段，经BLAST比对分析，发现菌株与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)一致性高达99％，故初步判定该降解菌为农杆菌属(Agrobacterium sp.)，并将其命名为BJ‑04。将BJ‑04的16S rRNA基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，与RDP数据库中该属的数条同源序列比对构建系统发育树，结果见图3，降解菌BJ‑04与Agrobacterium tumefaciens聚为一支，结合16S rRNA基因比对结果，证实该降解菌为农杆菌属(Agrobacterium sp.)。
[0039] (4)菌株BJ‑04的抗生素抗性探究
[0040] 不同微生物对不同种类的抗生素的敏感程度不同，为了后续对菌株基因敲除，筛选突变体需要了解抗性以及环境释放等方面考虑，有必要对降解菌BJ‑04抗生素抗性谱进行探究。将新活化的菌株BJ‑04单克隆接种于1/4LB液体培养基过夜培养，取培养液1mL离心后去上清，沉淀的菌体用无机盐液体培养基洗涤3次，然后用100μL无菌水进行悬浮，将悬浮菌液按照0.1％的接种量接种于5mL LB液体培养基中，并分别补加抗生素氨苄霉素、氯霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素、链霉素、及萘啶酸至终浓度分别为50、34、10、15、10、10、20mg/L/mL，对照组不接菌。实验组与对照组均设3重复，于28℃，200rpm摇床震荡培养，7天内观察生长情况，用分光光度计测定菌液OD600。结果见表1，菌株BJ‑04对氨苄霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、及萘啶酸均具有抗性，对四环素没有抗性。
[0041] 表1菌株BJ‑04的抗生素抗性
[0042]
[0043] 注：与对照(OD600调零)相比，‘+’表示菌体生长(OD600＞0.05)；‘‑’表示菌体不生长。
[0044] 实施例2
[0045] 本实施例提供将实施例1筛选菌株用于对苯的降解，具体操作如下：
[0046] 将新活化的BJ‑04单克隆接种到含有2mM苯的5mL无机盐液体培养基(KH2PO4 3g/L、FeSO4 0.03g/L、H3BO3 0.0125g/L、CuSO4
0.125g/L、 ZnSO4 0.0125g/L、 于高
压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min)中，并补加终浓度为2mM的(NH4)2SO4；
[0047] 同时设有对照组(不接菌)，实验组与对照组均为3重复，于28℃，200rpm摇床震荡培养，7天内观察生长情况，用分光光度计测定菌液OD600。
[0048] 实施例3
[0049] 本实施例提供一种实施例1筛选菌株对环己烷的降解应用，具体操作如下：
[0050] 将新活化的BJ‑04单克隆接种到含有2mM环己烷的5mL无机盐液体培养基(KH2PO4 3g/L、FeSO4 0.03g/L、H3BO3 0.0125g/L、CuSO4 0.125g/L、 ZnSO4 0.0125g/L、 于高
压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min)中，并补加终浓度为2mM的(NH4)2SO4；
[0051] 同时设有对照组(不接菌)，实验组与对照组均为3重复，于28℃，200rpm摇床震荡培养，7天内观察生长情况，用分光光度计测定菌液OD600。
[0052] 实施例4
[0053] 本实施例提供将实施例1筛选菌株用于对己烷的降解，具体操作如下：
[0054] 将新活化的BJ‑04单克隆接种到含有2mM己烷的5mL无机盐液体培养基(KH2PO4 3g/L、FeSO4 0.03g/L、H3BO3 0.0125g/L、CuSO4 0.125g/L、 ZnSO4 0.0125g/L、 于高
压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min)中，并补加终浓度为2mM的(NH4)2SO4；
[0055] 同时设有对照组(不接菌)，实验组与对照组均为3重复，于28℃，200rpm摇床震荡培养，7天内观察生长情况，用分光光度计测定菌液OD600。
[0056] 实施例5
[0057] 本实施例将实施例1筛选菌株用于降解正丁醇，具体操作如下：
[0058] 将新活化的BJ‑04单克隆接种到含有2mM正丁醇的5mL无机盐液体培养基(KH2PO43g/L、FeSO4 0.03g/L、H3BO3 0.0125g/L、CuSO4 0.125g/L、 ZnSO4 0.0125g/L、 于高
压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min)中，并补加终浓度为2mM的(NH4)2SO4；
[0059] 同时设有对照组(不接菌)，实验组与对照组均为3重复，于28℃，200rpm摇床震荡培养，7天内观察生长情况，用分光光度计测定菌液OD600。
[0060] 实施例6～实施例7
[0061] 实施例6～实施例7将实施例1筛选菌株用于降解六氯丁二烯，具体操作如下：
[0062] 将新活化的BJ‑04单克隆接种到含有六氯丁二烯的5mL无机盐液体培养基(KH2PO43g/L、FeSO4 0.03g/L、H3BO3 0.0125g/L、CuSO4 0.125g/L、 ZnSO4 0.0125g/L、 于高
压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min)中，并补加终浓度为2mM的(NH4)2SO4；，其中，实施例5～6培养基中六氯丁二烯含量如表2所示。
[0063] 同时设有对照组(不接菌)，实验组与对照组均为3重复，于28℃，200rpm摇床震荡培养，7天内观察生长情况，用分光光度计测定菌液OD600。
[0064] 表2实施例5～6中培养基中六氯丁二烯含量
[0065]
[0066] 实施例2～7中，通过OD检测的菌落生长情况如表3所示。
[0067] 表3实施例2～5 OD检测的菌落生长结果
[0068] 是否生长实施例2 +
实施例3 +
实施例4 +
实施例5 +
实施例6 +
实施例7 +
[0069] 注：与对照(oD600调零)相比.‘+’表示菌体生长(OD600＞0.05)：‘‑’表示菌体不生长[0070] 检测结果显示，苯、环己烷以及六氯丁二烯均可作为实施例1筛选菌株的单一碳源，因此，实施例1筛选菌株可作为苯、环己烷、六氯丁二烯、正丁醇的生物降解菌株。
[0071] 试验实施例
[0072] 本试验实施例将实施例7中的六氯丁二烯降解情况进行检测，检测方法如下：
[0073] 将含有六氯丁二烯的培养基每12h取样一次，样品经正己烷萃取，无水硫酸钠干燥，有机膜过滤后GC检测，同时对菌株BJ‑04的生长情况采用稀释平板涂布法计数，结果见图4；结果显示：菌株BJ‑04在12‑24h内为对数生长期，且在24h细胞浓度最大，且菌株BJ‑04在72h内将初始浓度为1mM的六氯丁二烯降解后仅剩下0.1mM左右，以此可证，实施例1所筛选菌株在降解六氯丁二烯方面的效果优异。
[0074] 以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
