技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种产丁酸的益生菌及其构建方法和其在化工、食品、医药、动物饲料或化妆品领域中的应用。
相关背景技术
[0002] 益生菌是通过定殖在人体内,改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡,促进营养吸收保持肠道健康的作用,从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。
[0003] 目前,益生菌被广泛应用于化工、食品、医药、动物饲料或化妆品领域。例如,专利CN113968758A公开了益生菌在制作肥料中的应用。专利CN113908251A公开了一种包含益生菌的酸奶。专利CN114053310A、CN114129707A、CN114107122A、CN113999805A分别公开了益生菌在降脂、抗过敏、缓解通风及治疗高尿酸血症中的应用。专利CN114027397A公开了一种包含益生菌的饲料添加剂。专利CN113827521A公开了益生菌在化妆品领域的应用。
[0004] 进一步的,通过对益生菌的改造进而治疗疾病。例如专利CN113604493A公开了一种高效表达LDH的益生菌能够有效的抑制细胞死亡、改善脑梗死体积、增强改善粘膜完整度、促进组织形态改善,对消化性溃疡、炎症性肠病和心脑血管疾病疗效。
[0005] 但是现有技术中并没有公开本申请改造的益生菌,也没有公开其在改善溃疡性结肠炎、抑郁症、肥胖和脂肪肝症状。
具体实施方式
[0102] 下面详细叙述本发明的实施方式,需要说明的是,本实施例是叙述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
[0103] 本发明中所使用的原料,如无特殊说明,均为常规的市售产品;本发明中所使用的方法,如无特殊说明,均为本领域的常规方法。
[0104] 实施例中利用自杀质粒同源重组构建大肠杆菌的方法如下:
[0105] 以敲入、或敲除、或替换基因组位点上下游~1000bp为同源臂,在大肠杆菌S17‑1中构建以pRE112为骨架,含有“目标插入位点上游同源臂‑插入片段‑目标插入位点下游同源臂”(敲入),或“目标敲除位点上游同源臂‑目标敲除位点下游同源臂”(敲除),或“目标替换位点上游同源臂‑替换片段‑目标替换位点下游同源臂”(替换)片段的自杀质粒(suicide plasmid)。将含该自杀质粒的菌株接合转化至Escherichia coli Nissle 1917(简称EcN)或缺失隐秘质粒pMUT1和/或pMUT2的EcN,其NCBI Taxonomy ID为316435,然后利用含有氯霉素的基本培养基平板进行第一轮单交换单克隆的筛选,PCR验证后得到第一轮交换阳性菌株。在含有10g/L蔗糖的LB培养基中过夜培养上述阳性菌株,促进第二轮双交换,再取菌液涂布含有10g/L蔗糖的LB平板得到单克隆,利用PCR验证和DNA测序得到最终基因组编辑成功菌株。
[0106] 实施例中大肠杆菌的发酵培养条件:
[0107] 挑取生长良好的单菌落接种于含LB液体培养基的摇瓶中,37℃,200r/min培养10h。再将种子液在装满培养基(M9基本培养基+15g/L葡萄糖+5g/L酵母粉)的14mL密封摇管中静置培养48h,检测培养基上清中丁酸含量。
[0108] 实施例中HPLC测定丁酸产量的方法:
[0109] HPLC条件:Aminex HPX‑87H(Bio‑Rad,USA)色谱柱,5mmol/L稀硫酸流动相,紫外检测器,210nm检测波长,柱温50℃,流速0.6mL/min,20μL进样量。
[0110] 实施例1益生菌的制备
[0111] 以缺失隐秘质粒pMUT1和pMUT2的EcN(参考文献:CRISPR‑based curing and analysis of metabolic burden of cryptic plasmids in Escherichia coliNissle 1917,Eng Life Sci.2019Jun 3;19(6):478‑485.)为出发菌株。利用自杀质粒同源重组构建大肠杆菌,具体为:
[0112] 首先敲除EcN菌株adhE和ldhA基因,并在基因组malEK(malE:糖ABC转运蛋白底物结合蛋白,malK:糖转运蛋白ATP结合蛋白,参见Development of a synthetic live bacterial therapeutic for the human metabolic disease phenylketonuria,Nat Biotechnol.2018Oct;36(9):857‑864)位点插入Pfnrs‑phaA‑hbd‑Pfnrs‑crt‑ter‑Pfnrs‑tesB(见SEQ ID NO:1,其中,第93至1274位为phaA,第1301至2149位为hbd,第2177至2962位为crt,第2989至4182位为ter,第4280至5140位为tesB),测序正确后得到产丁酸益生菌M3。替换M3菌株malEK位点hbd‑crt为phaB‑phaJ基因,得到产丁酸益生菌M2。以M3为出发菌株,在adhE和ldhA两个位点分别插入Pfnrs‑ter(见SEQ ID NO:2),得到含有三拷贝ter的产丁酸益生菌M3A8L8;替换M3A8L8菌株malEK位点phaA为thl基因,得到产丁酸益生菌M3A8L8T;替换M3A8L8菌株malEK位点phaA为atoB基因,得到产丁酸益生菌eEcN。替换eEcN菌株malEK位点tesB为yciA基因,得到产丁酸益生菌M3A8L8Y;替换eEcN菌株malEK位点tesB为cat1基因,得到产丁酸益生菌M3A8L8C;敲除EcN菌株adhE基因,malEK位点插入Pfnrs‑atoB‑hbd‑Pfnrs‑crt‑ter‑Pfnrs‑tesB,adhE位点插入Pfnrs‑ter,得到产丁酸益生菌M3A8;以eEcN为出发菌株,敲除frdA,得到产丁酸益生菌M3A9。表1汇总了实施例1构建菌株。
[0113] 表1:本实施例构建的菌株
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[0115] 其中,atoB(见SEQ ID NO:4)、tesB和yciA(见SEQ ID NO:6)为EcN(GenBank:CP007799.1)来源序列,phaA(Uniprot Entry:P14611)为Cupriavidusnecator来源经大肠杆菌密码子优化后序列,thl(来源于Uniprot Entry:E3VJQ0,见SEQ ID NO:3)和cat1(来源于Uniprot Entry:W6N7A7,见SEQ ID NO:5)为Clostridium tyrobutyricum来源经大肠杆菌密码子优化后序列,hbd(Uniprot Entry:P52041)和crt(Uniprot Entry:P52046)为Clostridium acetobutylicum来源经大肠杆菌密码子优化后序列,phaB(来源于文献:
Cloning and nucleotide sequences of genes relevant for biosynthesis of poly(3‑hydroxybutyric acid)in Chromatiumvinosum strain D,Eur J Biochem.1992Oct 1;
209(1):135‑50,见SEQIDNO:42)为Chromatiumvinosum来源经大肠杆菌密码子优化后序列,phaJ(来源于Uniprot Entry:O32472,见SEQIDNO:43)为Aeromonas caviae来源经大肠杆菌密码子优化后序列,ter(Uniprot Entry:Q73Q47)为Treponema denticola来源经大肠杆菌密码子优化后序列。表2引物用于构建包含目的基因的自杀质粒。
[0116] 如图2所示,野生型EcN不生产丁酸,改造后的益生菌发酵48h丁酸产量0.3~1.6g/L,选取中间产量菌株eEcN(1.4g/L)应用于后续研究。
[0117] 表2:实施例1中应用的引物
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[0120] 实施例2eEcN在缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结直肠炎小鼠疾病症状中的应用[0121] 取体重18‑22g的健康雄性C57BL/6J小鼠24只,每组6只小鼠随机分为4组:空白组(常规饮水+灌胃生理盐水)、模型组(2%DSS饮水+灌胃生理盐水)、eEcN干预组(2%DSS饮水+灌胃eEcN)、EcN对照组(2%DSS饮水+灌胃EcN)。以2%DSS饮水5天+常规饮水7天为一个循环,共循环三次,模型组、eEcN干预组和EcN对照组小鼠产生慢性肠炎症状。每两天灌胃一9
次,eEcN和EcN灌胃剂量为5×10CFU/只,其它组灌胃等体积生理盐水。
[0122] 造模期间(即用DSS处理期间),每两天根据小鼠体重、粪便性状和便血情况,计算得出小鼠的疾病活动指数(Disease activity index,DAI)。具体为:疾病活动指数结合动物的体重下降百分率(体重不变为0,1‑5为1分,5‑10为2分,10‑15为3分,大于15为4分)、大便黏稠度(正常为0,松散的大便为2分,腹泻为4分)和大便出血(正常0分,隐血阳性为2分,显性出血为4分)三种情况进行综合评分,将3项结果的总分除以3即得到DAI值。即DAI=(体重指数+大便形状+出血情况)/3。
[0123] 在第36天处死小鼠后,测量小鼠结肠长度并记录。取结直肠组织,利用RT‑PCR检测促炎因子含量,制作结肠石蜡切片并进行HE染色。
[0124] 实验结果如图3所示,eEcN可以减轻小鼠的肠炎症状,包括降低粘膜损伤(图3A),减轻结肠缩短(图3B),减少促炎细胞因子(图3C)以及减少DAI疾病评分(图3D)。
[0125] 实施例3eEcN在缓解慢性不可预知温和应激(CUMS)诱导的抑郁样行为小鼠中的应用
[0126] 取八周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠60只,随机分配10只作为对照组,剩余50只进行为期4周的CUMS造模。造模4周后进行行为学测试,将造模成功的小鼠随机平均分配成3组。进而,目前小鼠被分为4组:对照组(正常饲养8周);模型组(CUMS造模8周,第5周开始灌胃生理盐水)、eEcN干预组(CUMS造模8周,第5周开始灌胃eEcN)、EcN对照组(CUMS造模8周,9
第5周开始灌胃EcN)。每天灌胃一次,eEcN和EcN灌胃剂量为1×10CFU/只,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。
[0127] 在第8周灌胃结束的第二天进行行为学测试,测试的同时仍灌胃。当行为学测试结束后,处死小鼠,心脏灌流4%多聚甲醛后取小鼠全脑,剥离海马,利用RT‑PCR检测促炎因子含量。
[0128] 实验结果如图4所示,eEcN可以增加强迫游泳(图A)的抑郁小鼠挣扎时长,缓解其抑郁表型,并减少抑郁小鼠海马中IL‑1β(图B)和消皮素D(GSDMD,图C)含量。
[0129] 实施例4eEcN在改善小鼠肥胖和脂肪肝表型的应用
[0130] 取4‑5周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠(体重18‑22g)22只,随机分配6只作为对照组,剩余16只用60%(kcal)高脂纯化饲料(HFD)进行肥胖造模。持续8‑12周直至小鼠肥胖模型诱导成功,将造模成功的小鼠随机平均分配成3组。至此,小鼠被分为4组:对照组(正常饮食组,和模型组同步灌胃生理盐水,简称ND);模型组(HFD造模,造模成功后灌胃生理盐水,简称HFD)、eEcN干预组(HFD造模,造模成功后灌胃eEcN,简称HFD+eEcN)、EcN对照组(HFD造9
模,造模成功后灌胃EcN,简称HFD+EcN。每四天灌胃一次,eEcN和EcN灌胃剂量为1×10CFU/只,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。
[0131] 灌胃期间每四天定时称体重并记录体重数据,灌胃32天后,将全部小鼠置于EchoMRI小动物体成分分析仪中进行体脂成分检测,记录小鼠瘦肉量(Lean mass)和脂肪量(Fat mass)。接着对小鼠进行安乐死和采血,全血样本检测白细胞和中性粒细胞水平,取肝脏组织进行HE染色,以观察脂肪肝表型。
[0132] 实验结果如图5所示,eEcN可以减轻肥胖小鼠体重及其脂肪量,同时改善小鼠肥胖病理情况下的脂肪肝表型,降低肥胖小鼠全身炎症水平。
[0133] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。