[0003] 本文提供了用于筛查卵巢癌的技术，特别是但不限于用于检测卵巢癌和卵巢癌亚型(例如，透明细胞卵巢癌、子宫内膜样卵巢癌、粘液性卵巢癌、浆液性卵巢癌)的存在的方法、组合物和相关用途。

[0004] 卵巢癌是发达国家最致命的妇科恶性肿瘤之一。在美国，每年大约有23,000名女性被诊断出患有这种疾病，并且有近14,000名女性死于这种疾病。卵巢癌主要分为三种类
型：上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌和性索间质卵巢癌。约90％的卵巢癌始于上皮组织，即卵巢外侧的内层。这类卵巢癌分为浆液性卵巢癌、粘液性卵巢癌、子宫内膜样卵巢癌、透明细胞卵巢癌、移行性卵巢癌和未分化型卵巢癌。上皮性卵巢癌的风险随着年龄的增长而增
加，尤其是在50岁之后。生殖细胞肿瘤约占卵巢癌的5％。它们从产卵细胞开始。这类卵巢癌可以发生在任何年龄的女性身上，但约80％发生在30岁以下的女性身上。主要亚型有畸胎
瘤、无性细胞瘤、内胚窦瘤和绒毛膜癌。性索间质肿瘤约占卵巢癌的5％，生长在结缔组织中，该结缔组织将卵巢固定在一起并产生雌激素和黄体酮。大多数见于老年女性。

[0005] 尽管癌症疗法取得了进展，但卵巢癌死亡率在过去二十年中实际上没有变化。鉴于相对于疾病诊断阶段的陡峭生存梯度，早期检测仍然是提高卵巢癌患者长期生存率的最
重要因素。

[0006] 需要改进的检测卵巢癌和各种卵巢癌亚型(例如，透明细胞卵巢癌、子宫内膜样卵巢癌、粘液性卵巢癌和浆液性卵巢癌)的方法。

[0007] 本发明满足了这些需要。

[0232] 在各种实施方案的详细描述中，为了解释的目的，阐述了许多具体细节以提供对所公开的实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在有或没有这些具体细节的情况下实践这些各种实施方案。在其它情况下，结构和装置以框图形式展示。此外，本领域技术人员可以容易地理解，其中呈现和执行方法的特定顺序是例示性的，并且预期这
些顺序可以变化并且仍然保持在本文公开的各种实施方案的精神和范围内。

[0233] 本文提供了用于筛查卵巢癌的技术，特别是但不限于用于检测卵巢癌和/或特定形式的卵巢癌(例如，透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性OC、浆液性OC)的存在的方法、组合物和相关用途。如这项技术在本文中所描述，使用的章节标题仅仅是出于组织的目的，而不应视为以任何方式限制主题。

[0234] 实际上，如实施例I、II和III中所述，在本发明的实施方案的鉴定过程期间进行的实验鉴定了一组560个新颖的差异甲基化区域(DMR)，用于区分源自卵巢癌的DNA与非赘生物对照DNA。从这560个新颖的DNA甲基化标志物中，进一步的实验鉴定出能够区分不同卵巢癌类型与正常组织及与血浆样品的标志物。例如，单独的DMR组被确定能够区分1)透明细胞卵巢癌组织与正常组织；2)子宫内膜样卵巢癌组织与正常组织；3)粘液性卵巢癌组织与正
常组织；4)浆液性卵巢癌组织与正常组织；以及5)血浆样品中的卵巢癌。

[0235] 尽管这里的公开内容涉及某些例示的实施方案，但是应当理解，这些实施方案是作为示例而不是作为限制来呈现的。

[0236] 在具体方面，本发明的技术提供了用于鉴定、确定和/或分类例如卵巢癌和/或卵巢癌亚型(例如，透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性OC、浆液性OC)的癌症的组合物和方法。
所述方法包括确定从受试者分离的生物样品(例如，粪便样品、卵巢组织样品、血浆样品)中至少一种甲基化标志物的甲基化状况，其中该标志物的甲基化状态的变化指示卵巢癌和/
或其亚型的存在、类别或部位。具体实施方案涉及包含差异甲基化区域(DMR，例如DMR 1‑
560，参见表1A和6A)的标志物，所述标志物用于诊断(例如筛查)卵巢癌和各种卵巢癌类型
(例如，透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性OC、浆液性OC)。

[0237] 除了分析包含本文所提供和表1A和6A中所列出的DMR(例如DMR，例如DMR 1‑560)的至少一种标志物、标志物区域或标志物的碱基的甲基化分析的实施方案以外，这项技术
还提供了包含含有DMR的至少一种标志物、标志物区域或标志物的碱基的标志物组，用于检测癌症、尤其是卵巢癌。

[0238] 这项技术的的一些实施方案是基于对包含DMR的至少一种标志物、标志物区域或标志物的碱基的CpG甲基化状况的分析。

[0239] 在一些实施方案中，本发明的技术提供了以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)的用途，所述试剂与一种或多种甲基化测定组合，用于确定包含DMR(例如DMR 1‑560，参见表1A和6A)的至少一种标志物内的CpG二核苷酸序列的甲基化状况。基因组CpG二核苷酸可以是甲基化或未甲基化的
(可替代地分别称为高甲基化和低甲基化)。然而，本发明的方法适合于分析非均质性的生
物样品，例如在偏远样品(例如血液、器官流出物或粪便)的背景内的低浓度的肿瘤细胞或
从中获得的生物材料。因此，当分析这类样品内CpG位置的甲基化状况时，可使用定量测定来确定具体CpG位置的甲基化水平(例如百分比、分数、比率、比例或程度)。

[0240] 根据本发明的技术，对包含DMR的标志物中CpG二核苷酸序列的甲基化状况的确定可用于诊断和表征例如卵巢癌的癌症。

[0241] 标志物的组合

[0242] 在一些实施方案中，这项技术涉及评估包含来自表1A和6A的DMR(例如DMR编号1‑560)的标志物的组合的甲基化状态。在一些实施方案中，评估超过一种标志物的甲基化状
态增加用于鉴定受试者中的赘生物(例如卵巢癌)的筛查或诊断法的特异性和/或灵敏度。

[0243] 利用例如如通过与预测特异性和灵敏度有关的统计技术鉴定的标志物的多种组合预测多种癌症。这项技术提供了鉴定一些癌症的预测组合和验证预测组合的方法。

[0244] 测定甲基化状态的方法

[0245] 在某些实施方案中，用于分析核酸中5‑甲基胞嘧啶的存在的方法涉及用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂处理DNA。这种试剂的实例包括(但不限于)甲基化敏感性限制
酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂。

[0246] 常用于分析核酸中5‑甲基胞嘧啶的存在的方法是基于Frommer等人描述的用于检测DNA中的5‑甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法(Frommer等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 
89:1827‑31，明确地以引用的方式整体并入本文中以达成所有目的)或其变体。定位5‑甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法是基于如下观测结果：胞嘧啶与亚硫酸氢盐离子(又名亚硫酸氢
盐)反应，而5‑甲基胞嘧啶不反应。反应通常根据以下步骤进行：首先，胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应，形成磺化胞嘧啶。然后，磺化的反应中间体自发脱氨基，产生磺化尿嘧啶。最终，磺化尿嘧啶在碱性条件下脱磺酸，形成尿嘧啶。检测是可能的原因在于尿嘧啶碱基与腺嘌呤配
对(因此，行为如胸腺嘧啶一样)，而5‑甲基胞嘧啶碱基与鸟嘌呤配对(因此，行为如胞嘧啶一样)。这使得通过例如以下区分甲基化胞嘧啶与非甲基化胞嘧啶成为可能：亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg G和Clark S,Bioessays(1994)16:431‑36；Grigg G,DNA Seq.(1996)6:
189‑98)、如例如美国专利No.5,786,146中公开的甲基化特异性PCR(MSP)或使用包含序列
特异性探针裂解的测定，例如QuARTS瓣状核酸内切酶测定(参见例如Zou等人(2010)
“Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation 
specific technology”Clin Chem 56:A199；以及美国专利No.8,361,720；8,715,937；8,
916,344；和9,212,392。

[0247] 一些常规技术涉及如下方法，所述方法包括将待分析的DNA封装在琼脂糖基质中，从而防止DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐仅与单链DNA反应)，并用快速透析代替沉淀和纯化
步骤(Olek A等人,(1996)“Amodified and improved method for bisulfite based 
cytosine methylation analysis”Nucleic Acids Res.24:5064‑6)。因此可以分析单个细胞的甲基化状况，这说明了该方法的实用性和灵敏度。Rein,T.等人,(1998)Nucleic Acids Res.26:2255概述了检测5‑甲基胞嘧啶的常规方法。

[0248] 亚硫酸氢盐技术典型地包括在亚硫酸氢盐处理后扩增已知核酸的短的特定片段，然后通过测序(Olek和Walter(1997)Nat.Genet.17:275‑6)或引物延伸反应(Gonzalgo和
Jones(1997)Nucleic Acids Res.25:2529‑31；WO 95/00669；美国专利No.6,251,594)分析产物以分析单个胞嘧啶位置。一些方法使用酶消化(Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids 
Res.25:2532‑4)。本领域也描述了通过杂交进行的检测(Olek等人,WO 99/28498)。此外，已经描述了使用亚硫酸氢盐技术检测单个基因的甲基化(Grigg和Clark(1994)Bioessays 
16:431‑6；Zeschnigk等人(1997)Hum Mol Genet.6:387‑95；Feil等人(1994)Nucleic 
Acids Res.22:695；Martin等人(1995)Gene 157:261‑4；WO 9746705；WO 9515373)。

[0249] 根据本发明的技术，各种甲基化测定程序可以与亚硫酸氢盐处理结合使用。这些测定允许确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸(例如CpG岛)的甲基化状态。这类测定
除其它技术外还涉及经过亚硫酸氢盐处理的核酸的测序、PCR(用于序列特异性扩增)、南方印迹分析(Southern blot analysis)和甲基化特异性限制酶如甲基化敏感性或甲基化依
赖性酶的使用。

[0250] 例如，通过使用亚硫酸氢盐处理，已简化基因组测序供分析甲基化模式和5‑甲基胞嘧啶分布(Frommer等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827‑1831)。此外，对从经过亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化可用于评估甲基化状态，例如，如
Sadri和Hornsby(1997)Nucl.Acids Res.24:5058‑5059所述或如在称为COBRA(联合亚硫酸
氢盐限制分析)的方法中所体现(Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids Res.25:2532‑
2534)。

[0251] COBRATM分析是一种定量甲基化测定，可用于确定少量基因组DNA中特定基因座的DNA甲基化水平(Xiong和Laird,Nucleic Acids Res.25:2532‑2534,1997)。简单地说，限制酶消化用于揭示经过亚硫酸氢钠处理的DNA的PCR产物的甲基化依赖性序列差异。根据
Frommer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1827‑1831,1992)描述的程序，首先通过标准亚硫酸氢盐处理将甲基化依赖性序列差异引入基因组DNA。然后使用对感兴趣的CpG岛具有特
异性的引物对经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行PCR扩增，接着进行限制性内切酶消化、凝胶
电泳，并使用特定的标记的杂交探针进行检测。原始DNA样品中的甲基化水平由在广泛的
DNA甲基化水平范围内呈线性定量方式的消化和未消化的PCR产物的相对量表示。此外，这
项技术可以可靠地应用于从显微解剖的石蜡包埋组织样品中获得的DNA。

[0252] 用于COBRATM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于COBRATM的试剂盒中找到)可能包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、DMR、基因区域、标志物区域、经过亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；限制酶和适当的缓冲液；基因杂交寡核苷酸；对照杂交寡核苷酸；寡核苷酸探针的激酶标记试剂盒；和标记的核苷酸。此外，亚硫酸氢盐转化试剂可能包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(如沉淀、超TM
滤、亲和柱)；脱磺酸缓冲液；和DNA回收组分。如“MethyLight ”(一种基于荧光的实时PCR技TM
术)(Eads等人,Cancer Res.59:2302‑2306,1999)、Ms‑SNuPE (甲基化敏感性单核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo和Jones,Nucleic Acids Res.25:2529‑2531,1997)、甲基化特异性
PCR(“MSP”；Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821‑9826,1996；美国专利No.5,
786,146)和甲基化CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等人,Cancer Res.59:2307‑12,1999)等测定单独使用或与这些方法中的一种或多种组合使用。

[0253] “HeavyMethylTM”测定技术是一种基于经过亚硫酸氢盐处理的DNA的甲基化特异性扩增来评估甲基化差异的定量方法。覆盖扩增引物之间的CpG位置或被扩增引物覆盖的甲基化特异性阻断探针(本文也称为阻断剂)能够实现核酸样品的甲基化特异性选择性扩增。

[0254] 术语“HeavyMethylTM MethyLightTM”测定是指HeavyMethylTM MethyLightTM测定，TM TM它是MethyLight 测定的变体，其中MethyLight 测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲
TM
基化特异性阻断探针组合。HeavyMethyl 测定也可以与甲基化特异性扩增引物结合使用。

[0255] 用于HeavyMethylTM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于MethyLightTM的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经过亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛或经过亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛等)的PCR引物；阻断寡核苷酸；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。MSP(甲基化特异性PCR)允许评估CpG岛内几乎任一组CpG位点的甲基化状况，而无需使用甲基化敏感性限
制酶(Herman等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821‑9826,1996；美国专利No.5,786,
146)。简单地说，亚硫酸氢钠对DNA进行修饰，将未甲基化而非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，随后使用对甲基化与未甲基化DNA具有特异性的引物扩增产物。MSP只需要少量的DNA，对给定CpG岛基因座的0.1％甲基化等位基因敏感，并且可以对从石蜡包埋样品中提取的
DNA进行分析。用于MSP分析的典型试剂(例如，可在典型的基于MSP的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经过亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的甲基化和未甲基化PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及特定的探针。

[0256] MethyLightTM测定是一种高通量的定量甲基化测定，它利用基于荧光的实时PCR(例如 )，在PCR步骤后无需进一步操作(Eads等人,Cancer Res.59:2302‑2306,
TM
1999)。简单地说，MethyLight 过程从基因组DNA的混合样品开始，该样品在亚硫酸氢钠反应中根据标准程序转化为甲基化依赖性序列差异的混合库(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的
胞嘧啶残基转化为尿嘧啶)。然后在“偏向”反应中例如使用与已知的CpG二核苷酸重叠的
PCR引物进行基于荧光的PCR。序列区分发生在扩增过程的水平和荧光检测过程的水平下。

[0257] MethyLightTM测定用作核酸，例如基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平下。在定量型式中，PCR反应在存在与特定假定甲基化位点重叠的荧光探针的情况下提供甲基化特异性扩增。引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸的
反应提供了对所述量的输入DNA的无偏向控制。可替代地，通过使用不覆盖已知的甲基化位TM
点的对照寡核苷酸(例如，HeavyMethyl 和MSP技术的基于荧光的型式)或使用覆盖潜在甲
基化位点的寡核苷酸探测偏向的PCR池，实现基因组甲基化的定性测试。
TM

[0258] MethyLight 过程与任何合适的探针(例如 探针、 探针等)一起使用。例如，在一些应用中，双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理并使用
探针，例如使用MSP引物和/或HeavyMethyl阻断剂寡核苷酸和 探针进行两组PCR
反应中的一组。 探针使用荧光“报告基因”和“猝灭剂”分子进行双重标记，并且
设计成对相对较高GC含量的区域具有特异性，以便它在PCR循环中比正向或反向引物高约
10℃的温度下熔化。这允许 探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。当Taq
聚合酶在PCR过程中酶促合成一条新链时，它最终将到达退火的 探针。然后，Taq
聚合酶5'至3'核酸内切酶活性将置换 探针，它是通过消化探针以释放荧光报告
分子，从而使用实时荧光检测系统对其现在未淬灭的信号进行定量检测。

[0259] 用于MethyLightTM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于MethyLightTM的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经过亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物； 或 探
针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。

[0260] QMTM(定量甲基化)测定是基因组DNA样品中甲基化模式的替代定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平下。在这种定量型式中，PCR反应在存在与特定假定甲基化位点重叠的荧光探针的情况下提供无偏向的扩增。引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸的反应
提供了对所述量的输入DNA的无偏向控制。可替代地，通过使用不覆盖已知的甲基化位点的TM
对照寡核苷酸(HeavyMethyl 和MSP技术的基于荧光的型式)或使用覆盖潜在甲基化位点的
寡核苷酸探测偏向的PCR池，实现基因组甲基化的定性测试。
TM

[0261] 在扩增过程中，QM 过程可以与任何合适的探针，例如 探针、探针一起使用。例如，双链基因组DNA用亚硫酸氢钠处理，并经受无偏向引物
和 探针。 探针使用荧光“报告基因”和“猝灭剂”分子进行双重标记，
并且设计成对相对较高GC含量的区域具有特异性，以便它在PCR循环中比正向或反向引物
高约10℃的温度下熔化。这允许 探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。
当Taq聚合酶在PCR过程中酶促合成一条新链时，它最终将到达退火的 探针。然
后，Taq聚合酶5'至3'核酸内切酶活性将置换 探针，它是通过消化探针以释放荧
TM
光报告分子，从而使用实时荧光检测系统对其现在未淬灭的信号进行定量检测。用于QM 分TM
析的典型试剂(例如，可在典型的基于QM 的试剂盒中找到)可以包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经过亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物； 或 探针；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；以及
Taq聚合酶。

[0262] Ms‑SNuPETM技术是一种用于评估特定CpG位点的甲基化差异的定量方法，该方法基于DNA的亚硫酸氢盐处理，然后是单核苷酸引物延伸(Gonzalgo和Jones,Nucleic Acids Res.25:2529‑2531,1997)。简单地说，基因组DNA与亚硫酸氢钠反应，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时保持5‑甲基胞嘧啶不变。然后使用对经过亚硫酸氢盐转化的DNA具有特异性的PCR引物进行所需靶序列的扩增，并且分离所得产物并用作感兴趣CpG位点的甲基化
分析的模板。可以分析少量的DNA(例如，显微解剖病理切片)，并且避免使用限制酶来确定CpG位点的甲基化状况。

[0263] 用于Ms‑SNuPETM分析的典型试剂(例如，可在典型的基于Ms‑SNuPETM的试剂盒中找到)可能包括但不限于：针对特定基因座(例如，特定基因、标志物、基因区域、标志物区域、经过亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物；优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸；凝TM胶提取试剂盒；阳性对照引物；针对特定基因座的Ms‑SNuPE 引物；反应缓冲液(针对Ms‑SNuPE反应)；和标记的核苷酸。此外，亚硫酸氢盐转化试剂可能包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(如沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸缓冲液；和DNA回收组分。

[0264] 简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)从对核酸进行亚硫酸氢盐处理以将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶开始，然后进行限制酶消化(例如，通过识别包括CG序列的位点的酶，如MspI)以及在与接头配体偶联后对片段进行完整测序。限制酶的选择可以富集CpG
密集区域的片段，减少在分析过程中可能映射至多个基因位置的冗余序列的数目。因此，
RRBS通过选择限制性片段的子集(例如，通过使用制备型凝胶电泳的大小选择)用于测序来
降低核酸样品的复杂性。与全基因组亚硫酸氢盐测序相反，限制酶消化产生的每个片段都
含有至少一个CpG二核苷酸的DNA甲基化信息。因此，RRBS富集样品中在区域内具有高频率
的限制酶切割位点的启动子、CpG岛和其它基因组特征，从而提供了一种评估一个或多个基因组基因座的甲基化状态的测定法。

[0265] RRBS的典型方案包括使用限制酶(如MspI)消化核酸样品、填充悬垂和A尾、连接接头、亚硫酸氢盐转化和PCR的步骤。参见例如等人(2005)“Genome‑scale DNA methylation mapping of clinical samples at single‑nucleotide resolution”Nat Methods 7:
133‑6；Meissner等人(2005)“Reduced representation bisulfite sequencing for 
comparative high‑resolution DNA methylation analysis”Nucleic Acids Res.33:
5868‑77。

[0266] 在一些实施方案中，使用定量等位基因特异性实时靶标和信号放大(QuARTS)测定来评估甲基化状态。在每个QuARTS测定中依次发生三个反应，包括初级反应中的扩增(反应
1)和靶探针裂解(反应2)；以及次级反应中的FRET裂解和荧光信号生成(反应3)。当使用特
定引物扩增目标核酸时，带有瓣序列的特定检测探针与扩增子松散地结合。靶结合位点处
特定侵入性寡核苷酸的存在引起5'核酸酶，例如FEN‑1核酸内切酶，通过在检测探针和瓣序列之间切割来释放瓣序列。瓣序列与相应FRET盒的非发夹部分互补。因此，瓣序列充当FRET盒上的侵入性寡核苷酸，并在FRET盒荧光团与猝灭剂之间实现裂解，产生荧光信号。裂解反应可以每个靶标切割多个探针，从而每个瓣释放多个荧光团，提供指数信号放大。QuARTS可以通过使用带有不同染料的FRET盒来检测单个反应孔中的多个靶标。参见例如Zou等人
(2010)“Sensitive quantification of methylated markers with a novel 
methylation specific technology”Clin Chem 56:A199)，和美国专利No.8,361,720；8,
715,937；8,916,344；以及9,212,392，每一个都通过引用的方式并入本文中，以达成所有目的。

[0267] 术语“亚硫酸氢盐试剂”是指包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，如本文所公开，其用于区分甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸序列。所述处理方法是本领域已知的(例如PCT/
EP2004/011715和WO 2013/116375，各自通过引用的方式整体并入)。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐处理在变性溶剂例如但不限于正烷二醇或二乙二醇二甲醚(DME)的存在下，或在
二噁烷或二噁烷衍生物的存在下进行。在一些实施方案中，变性溶剂以介于1％与35％(v/
v)之间的浓度使用。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，所述清除剂例如但不限于色烷衍生物，例如6‑羟基‑2,5,7,8,‑四甲基色烷2‑甲酸或三羟基苯甲酸和其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，以引用的方式整体并入)。在某些优选的实施方案中，亚硫酸氢盐反应包括用亚硫酸氢铵处理，例如，如WO 2013/116375中所述。

[0268] 在一些实施方案中，使用根据本发明的引物寡核苷酸组(例如参见表1C和6B)和扩增酶扩增处理过的DNA的片段。几个DNA区段的扩增可以在同一个反应容器中同时进行。通
常，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。扩增子的长度通常为100至2000个碱基对。

[0269] 在该方法的另一个实施方案中，可以通过使用甲基化特异性引物寡核苷酸来检测在包含DMR(例如DMR 1‑560，表1A和6A)的标志物内或附近的CpG位置的甲基化状况。这种技术(MSP)已在Herman的美国专利No.6,265,171中描述。使用甲基化状况特异性引物扩增经
过亚硫酸氢盐处理的DNA可以区分甲基化与未甲基化的核酸。MSP引物对含有至少一种与经
过亚硫酸氢盐处理的CpG二核苷酸杂交的引物。因此，所述引物的序列包含至少一个CpG二
核苷酸。对未甲基化的DNA具有特异性的MSP引物在CpG的C位置处含有“T”。

[0270] 通过扩增获得的片段可以带有直接或间接的可检测标记。在一些实施方案中，标记是荧光标记、放射性核素或具有可在质谱仪中检测到的典型质量的可分离分子片段。在
所述标记是质量标记的情况下，一些实施方案提供标记的扩增子具有单个正或负净电荷，
从而允许在质谱仪中具有更好的可检测性。可以通过例如基质辅助激光解吸/电离质谱法
(MALDI)或使用电喷雾质谱法(ESI)来进行检测和可视化。

[0271] 适用于这些测定技术的分离DNA的方法是本领域已知的。具体地说，一些实施方案包括分离核酸，如通过引用的方式整体并入本文中的美国专利申请序列号13/470,251
(“Isolation of Nucleic Acids”)中所述。

[0272] 在一些实施方案中，本文所述的标志物可用于对粪便样品进行的QUARTS测定。在一些实施方案中，提供了产生DNA样品的方法，特别是产生如下DNA样品的方法，所述DNA样品包含小体积(例如，小于100微升、小于60微升)的高度纯化的低丰度核酸并且基本上和/
或实际上不含抑制用于测试DNA样品的测定(例如，PCR、INVADER、QuARTS测定等)的物质。这类DNA样品可在定性检测在取自患者的样品中存在的基因、基因变体(例如等位基因)或基
因修饰(例如甲基化)的存在或定量测量其活性、表达或数量的诊断分析中使用。例如，一些癌症与特定突变等位基因或特定甲基化状态的存在相关，因此检测和/或定量这类突变等
位基因或甲基化状态在癌症的诊断和治疗中具有预测价值。许多有价值的遗传标志物以极
低的量存在于样品中，并且产生这类标志物的许多事件非常罕见。因此，即使是灵敏的检测方法(例如PCR)也需要大量DNA来提供足够的低丰度靶标，以满足或代替测定的检测阈值。
此外，即使是少量抑制物质的存在也会损害这些旨在检测如此少量靶标的测定的准确性和
精确度。因此，本文提供了对体积和浓度提供必要管理以产生这类DNA样品的方法。

[0273] 在一些实施方案中，样品包含血液、血清、白细胞、血浆或唾液。在一些实施方案中，受试者是人。这类样品可以通过本领域已知的，例如熟练技术人员显而易见的多种方法获得。可以通过使样品经受本领域技术人员已知的各种技术，包括但不限于离心和过滤来获得无细胞或基本上无细胞的样品。尽管通常优选不使用侵入性技术来获得样品，但获得
样品例如组织匀浆、组织切片和活检标本仍可能是优选的。这项技术不限于用于制备样品
和提供用于测试的核酸的方法。例如，在一些实施方案中，使用直接基因捕获，例如，如美国专利No.8,808,990和9,169,511以及WO 2012/155072中所详述，或通过相关方法，从粪便样品或血液或血浆样品中分离DNA。

[0274] 标志物的分析可以单独或与一个测试样品中的另外的标志物同时进行。例如，可以将几种标志物组合到一个测试中以有效处理多个样品并潜在地提供更高的诊断和/或预
后准确性。此外，本领域技术人员会认识到测试来自同一受试者的多个样品(例如，在连续时间点)的价值。这类系列样品测试可以鉴定标志物甲基化状态随时间的变化。甲基化状态的变化以及甲基化状态没有变化可以提供有关疾病状态的有用信息，包括但不限于鉴定事
件发生的大致时间、可挽救组织的存在和数量、药物疗法的适当性、各种疗法的有效性以及对受试者结果的鉴定，包括未来事件的风险。生物标志物的分析可以呈多种物理格式进行。
例如，可以使用微量滴定板或自动化来促进大量测试样品的处理。可替代地，可以开发单一样品格式以促进以及时方式进行即刻治疗和诊断，例如在非卧床运输或急诊室环境中。

[0275] 预期以试剂盒的形式提供这项技术的实施方案。试剂盒包含本文所述的组合物、装置、设备等的实施方案，以及试剂盒的使用说明书。这类说明书描述了用于从样品制备分析物，例如用于收集样品和从样品制备核酸的合适方法。试剂盒的各个组分被包装在合适
的容器和包装(例如，小瓶、盒子、泡罩包装、安瓿、广口瓶、瓶子、管等)中并且这些组分被一起包装在合适的容器(例如，一个盒子或多个盒子)中以方便试剂盒的用户存储、运输和/或使用。应当理解，液体组分(例如，缓冲液)可以呈冻干形式提供以供用户复原。试剂盒可以包括用于评估、验证和/或确保试剂盒性能的对照或参考。例如，用于测定样品中存在的核酸量的试剂盒可以包括对照，其包含已知浓度的用于比较的相同或另一种核酸，并且在一
些实施方案中，对对照核酸具有特异性的检测试剂(例如引物)。试剂盒适用于临床环境，并且在一些实施方案中，适用于用户家中。在一些实施方案中，试剂盒的组件提供用于从样品制备核酸溶液的系统的功能。在一些实施方案中，系统的某些组件由用户提供。

[0276] 方法

[0277] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0278] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物包含DMR(例如，如例如表1A和6A中提供的DMR 1‑560)，以及[0279] 2)检测卵巢癌，透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性OC或浆液性OC(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0280] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0281] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：AGRN_A、ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、BCAT1、CCND2_D、CMTM3_A、ELMO1_A、ELMO1_B、ELMO1_C、EMX1、EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D、FAIM2_A、FLJ34208_A、GPRIN1、GYPC_A、INA_A、ITGA4_B、KCNA3_A、KCNA3_C、LBH、LIME1_A、LIME1_B、LOC646278、LRRC4、LRRC41_A、MAX.chr1.110626771‑110626832、MAX.chr1.147790358‑147790381、
MAX.chr1.161591532‑161591608、MAX.chr15.28351937‑28352173、MAX.chr15.28352203‑
28352671、MAX.chr15.29131258‑29131734、MAX.chr4.8859995‑8860062、
MAX.chr5.42952182‑42952292、MDFI、NCOR2、NKX2‑6、OPLAH_A、PARP15、PDE10A、PPP1R16B、RASSF1_B、SEPTIN9、SKI、SLC12A8、SRC_A、SSBP4_B、ST8SIA1、TACC2_A、TSHZ3、UBTF、VIM、VIPR2_A、ZBED4、ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZNF382_A、ZNF469_B、ATP6V1B1_A、BZRAP1、GDF6、IFFO1_A、IFFO1_B、KCNAB2、LIMD2、MAML3_B、MAX.chr14.102172350‑102172770、MAX.chr16.85482307‑85482494、MAX.chr17.76254728‑76254841、MAX.chr5.42993898‑
42994179和RASAL3，以及

[0282] 2)检测卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0283] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0284] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、SIM2(例如，SIM2_A、SIM2_B)、AGRN(例如，AGRN_A、AGRN_B、AGRN_C、AGRN_8794)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、DSCR6、GYPC(例如，GYPC_A、GYPC_B、GYPC_C)、CAPN2(例如，CAPN2_A、CAPN2_B)和BCAT1，以及

[0285] 2)检测卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0286] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0287] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
ATP10A(例如，ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI、SIM2_A、AGRN_8794、BCAT1_6015、KCNA3_7518、KCNA3_7320、LOC10013136、GYPC_C、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、NR2F6、TSHZ3、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、TACC2(例如，TACC2_A、TACC2_B)、VIPR2(例如，VIPR2_A、VIPR2_B)和SPOCK2_74333，以及

[0288] 2)检测卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0289] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0290] 1)测量从受试者获得的血液样品(例如，血浆样品、全血样品、白细胞样品、血清样品)内的CA‑125水平；

[0291] 2)使核酸(例如，例如从获自受试者的血液样品(例如，血浆样品、全血样品、白细胞样品、血清样品)分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注
释的染色体区域：ATP10A(例如，ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI和SIM2_A，以及

[0292] 3)检测卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0293] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0294] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
MAX.chr16.85482307‑85482494、GDF6、IFFO_A、MAX.chr5.42993898‑42994179、
MAX.chr17.76254728‑76254841、MAX.chr14.102172350‑102172770、RASAL3、BZRAP1和
LIMD2，以及

[0295] 2)检测卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0296] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0297] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAML3_A、SKI、DNMT3A_A和C2CD4D，以及

[0298] 2)检测卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0299] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0300] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
TACC2_A、LRRC41_A、EPS8L2、LBH、LIME1_B、MDFI、FAIM2_A、GYPC_A、AGRN_B和ZBED4，以及[0301] 2)检测透明细胞卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的
特异性提供)。

[0302] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0303] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：MT1A_A、CELF2_A、KCNA3_A、MDFI、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑
147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、MAX.chr6.10382190‑
10382225、DSCR6、MAML3_A、MAX.chr14.105512178‑105512224、EPS8L2_E、SKI、GPRIN1_A、MAX.chr8.142215938‑142216298、CDO1_A、DNMT3A_A、SIM2_A、SKI、MT1A_B、GYPC_A、
BCL2L11、PISD和C2CD4D，以及

[0304] 2)检测透明细胞卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0305] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0306] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
NCOR2、MT1A_B、CELF2_A、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑
147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、MAX.chr6.10382190‑
10382225、DSCR6、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A、MT1A_B、GYPC_A、BCL2L11、GDF6和C2CD4D，以及

[0307] 2)检测透明细胞卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0308] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0309] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：AGRN_
8794、BHLHE23_8339、EPS8L2_F、RASSF1_8293、MDFI_6321、SKI、GYPC_C、NKX2‑6_4159、LOC100131366、FAIM2_B、GPRIN1_B、LRRC41_B、TACC2_B、LBH、SIM2_B、CDO1_A和DSCR6，以及[0310] 2)检测透明细胞卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的
特异性提供)。

[0311] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0312] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
PARP15、GPRIN1_A、GYPC1_A、FLJ34208、MAX.chr1.147790358‑147790381、FAIM2_A、SH2B3、KCNQ5、IRF4和BCAT1，以及

[0313] 2)检测子宫内膜样卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0314] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0315] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
NCOR2、CELF2_A、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、
MAX.chr11.14926602‑14926671、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、SKI、BCL2L11和C2CD4D，以及[0316] 2)检测子宫内膜样卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％
的特异性提供)。

[0317] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0318] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
NCOR2、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr11.14926602‑14926671、DSCR6、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A和C2CD4D，以及

[0319] 2)检测子宫内膜样卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0320] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0321] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
BCAT1_6015、EPS8L2_F、SKI、NKX2‑6_4159、C1QL3_B、GPRIN1_B、PARP15、OXT_C、SIM2_B、DNMT3A_A和CELF2_A，以及

[0322] 2)检测子宫内膜样卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0323] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0324] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
CMTM3_A、ATP10A_C、TSHZ3、ZMIZ1_B、ATP10A_B、ELMO1_B、TACC2_A、LRRC4、VIM和ZNF382_A，以及

[0325] 2)检测粘液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0326] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0327] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
NCOR2、MT1A_A、KCNA3_A、ZMIZ1_C、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B、BCL2L11和GATA2，以及

[0328] 2)检测粘液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0329] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0330] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
NCOR2、PALLD、TACC2_A、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B和BCL2L11，以及

[0331] 2)检测粘液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0332] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0333] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
BCAT1_6015、ELMO1_9100、KCNA3_7518、KCNA3_7320、MDFI_6321、SKI、VIPR_B、ZNF382_B、ATP10A_E、CMTM3_B、ZMIZ1_D、SRC_B、HDGFRP3、TACC2_B、TSHZ3、LBH、DNMT3A_A，以及[0334] 2)检测粘液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特
异性提供)。

[0335] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0336] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
MAX.chr1.147790358‑147790381、MAML3、NR2F6、DNMT3A_A、SKI、SOBP、UBTF、AGRN_C、MAX.chr12.30975740‑30975780和CAPN2_A，以及

[0337] 2)检测浆液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0338] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0339] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、CAPN2_A、MAX.chr6.10382190‑10382225、SKI、NR2F6、IFFO1_A、MT1A_B、IFFO1_B、GDF6和C2CD4D，以及

[0340] 2)检测浆液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0341] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0342] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：
NCOR2、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr6.10382190‑10382225、IFFO1_A、GDF6和C2CD4D，以及

[0343] 2)检测浆液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0344] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0345] 1)使从受试者获得的核酸(例如，例如从例如血液或血浆之体液或卵巢组织分离的基因组DNA)与区分至少一种标志物内的甲基化与非甲基化CpG二核苷酸的至少一种试剂
或一系列试剂接触，所述标志物选自具有选自由以下组成的组的注释的染色体区域：SKI、PEAR1_B、CAPN2_B、SIM2_B、DNMT3A_A、CDO1_A和NR2F6，以及

[0346] 2)检测浆液性卵巢癌(例如，以大于或等于80％的灵敏度和大于或等于80％的特异性提供)。

[0347] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0348] 1)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品中的基因组
DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0349] ·AGRN_A、ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、BCAT1、CCND2_D、CMTM3_A、ELMO1_A、ELMO1_B、ELMO1_C、EMX1、EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D、FAIM2_A、FLJ34208_A、GPRIN1、GYPC_A、INA_A、ITGA4_B、KCNA3_A、KCNA3_C、LBH、LIME1_A、LIME1_B、LOC646278、LRRC4、LRRC41_A、MAX.chr1.110626771‑110626832、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr1.161591532‑161591608、MAX.chr15.28351937‑28352173、
MAX.chr15.28352203‑28352671、MAX.chr15.29131258‑29131734、MAX.chr4.8859995‑
8860062、MAX.chr5.42952182‑42952292、MDFI、NCOR2、NKX2‑6、OPLAH_A、PARP15、PDE10A、PPP1R16B、RASSF1_B、SEPTIN9、SKI、SLC12A8、SRC_A、SSBP4_B、ST8SIA1、TACC2_A、TSHZ3、UBTF、VIM、VIPR2_A、ZBED4、ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZNF382_A、ZNF469_B、ATP6V1B1_A、BZRAP1、GDF6、IFFO1_A、IFFO1_B、KCNAB2、LIMD2、MAML3_B、MAX.chr14.102172350‑
102172770、MAX.chr16.85482307‑85482494、MAX.chr17.76254728‑76254841、
MAX.chr5.42993898‑42994179和RASAL3(参见表1A、1B、6A、6B；实施例I)；

[0350] ·MAX.chr16.85482307‑85482494、GDF6、IFFO_A、MAX.chr5.42993898‑42994179、MAX.chr17.76254728‑76254841、MAX.chr14.102172350‑102172770、RASAL3、BZRAP1和LIMD2(参见表3；实施例I)；

[0351] ·PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAML3_A、SKI、DNMT3A_A和C2CD4D(参见表4A；实施例I)；以及

[0352] ·BCAT1_6015、SKI、SIM2_B、DNMT3A_A、CDO1_A和DSCR6(参见表8A；实施例II)；

[0353] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0354] 3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0355] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0356] 1)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品(例如，血液
样品、血浆样品)中的基因组DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、SIM2(例如，SIM2_A、SIM2_B)、AGRN(例如，AGRN_A、AGRN_B、AGRN_C、AGRN_8794)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、DSCR6、GYPC(例如，GYPC_A、GYPC_B、GYPC_C)、CAPN2(例如，CAPN2_A、CAPN2_B)和BCAT1；

[0357] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0358] 3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0359] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0360] 1)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品(例如，血液
样品、血浆样品)中的基因组DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自ATP10A(例如，ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI、SIM2_A、AGRN_8794、BCAT1_6015、KCNA3_7518、KCNA3_
7320、LOC10013136、GYPC_C、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、NR2F6、TSHZ3、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、TACC2(例如，TACC2_A、TACC2_B)、VIPR2(例如，VIPR2_A、VIPR2_B)和SPOCK2_
74333；

[0361] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0362] 3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0363] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0364] 1)测量从人类个体获得的血液样品(例如，血浆样品、全血样品、白细胞样品、血清样品)内的CA‑125水平；

[0365] 2)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品血液样品(例
如，血浆样品、全血样品、白细胞样品、血清样品)中的基因组DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI和SIM2_A；

[0366] 3)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0367] 4)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0368] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0369] 1)测量来自样品的DNA中至少一种甲基化标志基因的量，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0370] ·AGRN_A、ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、BCAT1、CCND2_D、CMTM3_A、ELMO1_A、ELMO1_B、ELMO1_C、EMX1、EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D、FAIM2_A、FLJ34208_A、GPRIN1、GYPC_A、INA_A、ITGA4_B、KCNA3_A、KCNA3_C、LBH、LIME1_A、LIME1_B、LOC646278、LRRC4、LRRC41_A、MAX.chr1.110626771‑110626832、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr1.161591532‑161591608、MAX.chr15.28351937‑28352173、
MAX.chr15.28352203‑28352671、MAX.chr15.29131258‑29131734、MAX.chr4.8859995‑
8860062、MAX.chr5.42952182‑42952292、MDFI、NCOR2、NKX2‑6、OPLAH_A、PARP15、PDE10A、PPP1R16B、RASSF1_B、SEPTIN9、SKI、SLC12A8、SRC_A、SSBP4_B、ST8SIA1、TACC2_A、TSHZ3、UBTF、VIM、VIPR2_A、ZBED4、ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZNF382_A、ZNF469_B、ATP6V1B1_A、BZRAP1、GDF6、IFFO1_A、IFFO1_B、KCNAB2、LIMD2、MAML3_B、MAX.chr14.102172350‑
102172770、MAX.chr16.85482307‑85482494、MAX.chr17.76254728‑76254841、
MAX.chr5.42993898‑42994179和RASAL3(参见表1A、1B、6A、6B；实施例I)；

[0371] ·MAX.chr16.85482307‑85482494、GDF6、IFFO_A、MAX.chr5.42993898‑42994179、MAX.chr17.76254728‑76254841、MAX.chr14.102172350‑102172770、RASAL3、BZRAP1和LIMD2(参见表3；实施例I)；

[0372] ·GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、SIM2(例如，SIM2_A、SIM2_B)、AGRN(例如，AGRN_A、AGRN_B、AGRN_C、AGRN_8794)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、DSCR6、GYPC(例如，GYPC_A、GYPC_B、GYPC_C)、CAPN2(例如，CAPN2_A、CAPN2_B)和BCAT1(参见表9；实施例III)；

[0373] ·ATP10A(例如，ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI、SIM2_A、AGRN_8794、BCAT1_6015、KCNA3_7518、KCNA3_7320、LOC10013136、GYPC_C、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、NR2F6、TSHZ3、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、TACC2(例如，TACC2_A、TACC2_B)、VIPR2(例如，VIPR2_A、VIPR2_B)和SPOCK2_74333(参见表10，实施例III)；

[0374] ·PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAML3_A、SKI、DNMT3A_A和C2CD4D(参见表4A；实施例I)；以及

[0375] ·BCAT1_6015、SKI、SIM2_B、DNMT3A_A、CDO1_A和DSCR6(参见表8A；实施例II)；

[0376] 2)测量所述DNA中的至少一种参考标志物的量；以及

[0377] 3)将在所述DNA中测量的所述至少一种甲基化标志基因的量的值计算为在所述DNA中测量的所述参考标志基因的量的百分比，其中所述值指示在所述样品中测量的所述
至少一种甲基化标志DNA的量。

[0378] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0379] 1)通过用亚硫酸氢盐以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理人类个体的生物样品中的基因组DNA，
测量所述生物样品中一种或多种基因的CpG位点的甲基化水平；

[0380] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过修饰的基因组DNA；以及

[0381] 3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；

[0382] 其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0383] ·AGRN_A、ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、BCAT1、CCND2_D、CMTM3_A、ELMO1_A、ELMO1_B、ELMO1_C、EMX1、EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D、FAIM2_A、FLJ34208_A、GPRIN1、GYPC_A、INA_A、ITGA4_B、KCNA3_A、KCNA3_C、LBH、LIME1_A、LIME1_B、LOC646278、LRRC4、LRRC41_A、MAX.chr1.110626771‑110626832、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr1.161591532‑161591608、MAX.chr15.28351937‑28352173、
MAX.chr15.28352203‑28352671、MAX.chr15.29131258‑29131734、MAX.chr4.8859995‑
8860062、MAX.chr5.42952182‑42952292、MDFI、NCOR2、NKX2‑6、OPLAH_A、PARP15、PDE10A、PPP1R16B、RASSF1_B、SEPTIN9、SKI、SLC12A8、SRC_A、SSBP4_B、ST8SIA1、TACC2_A、TSHZ3、UBTF、VIM、VIPR2_A、ZBED4、ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZNF382_A、ZNF469_B、ATP6V1B1_A、BZRAP1、GDF6、IFFO1_A、IFFO1_B、KCNAB2、LIMD2、MAML3_B、MAX.chr14.102172350‑
102172770、MAX.chr16.85482307‑85482494、MAX.chr17.76254728‑76254841、
MAX.chr5.42993898‑42994179和RASAL3(参见表1A、1B、6A、6B；实施例I)；

[0384] ·GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、SIM2(例如，SIM2_A、SIM2_B)、AGRN(例如，AGRN_A、AGRN_B、AGRN_C、AGRN_8794)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、DSCR6、GYPC(例如，GYPC_A、GYPC_B、GYPC_C)、CAPN2(例如，CAPN2_A、CAPN2_B)和BCAT1(参见表9；实施例III)；

[0385] ·ATP10A(例如，ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI、SIM2_A、AGRN_8794、BCAT1_6015、KCNA3_7518、KCNA3_7320、LOC10013136、GYPC_C、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、NR2F6、TSHZ3、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、TACC2(例如，TACC2_A、TACC2_B)、VIPR2(例如，VIPR2_A、VIPR2_B)和SPOCK2_74333(参见表10，实施例III)；

[0386] ·MAX.chr16.85482307‑85482494、GDF6、IFFO_A、MAX.chr5.42993898‑42994179、MAX.chr17.76254728‑76254841、MAX.chr14.102172350‑102172770、RASAL3、BZRAP1和LIMD2(参见表3；实施例I)；

[0387] ·PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAML3_A、SKI、DNMT3A_A和C2CD4D(参见表4A；实施例I)；以及

[0388] ·BCAT1_6015、SKI、SIM2_B、DNMT3A_A、CDO1_A和DSCR6(参见表8A；实施例II)。

[0389] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0390] 1)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品中的基因组
DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0391] ·TACC2_A、LRRC41_A、EPS8L2、LBH、LIME1_B、MDFI、FAIM2_A、GYPC_A、AGRN_B和ZBED4(参见表2A；实施例I)；

[0392] ·MT1A_A、CELF2_A、KCNA3_A、MDFI、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、
MAX.chr6.10382190‑10382225、DSCR6、MAML3_A、MAX.chr14.105512178‑105512224、
EPS8L2_E、SKI、GPRIN1_A、MAX.chr8.142215938‑142216298、CDO1_A、DNMT3A_A、SIM2_A、SKI、MT1A_B、GYPC_A、BCL2L11、PISD和C2CD4D(参见表4B；实施例I)；

[0393] ·NCOR2、MT1A_B、CELF2_A、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、
MAX.chr6.10382190‑10382225、DSCR6、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A、MT1A_B、GYPC_A、BCL2L11、GDF6和C2CD4D(参见表5B；实施例I)；以及

[0394] ·AGRN_8794、BHLHE23_8339、EPS8L2_F、RASSF1_8293、MDFI_6321、SKI、GYPC_C、NKX2‑6_4159、LOC100131366、FAIM2_B、GPRIN1_B、LRRC41_B、TACC2_B、LBH、SIM2_B、CDO1_A和DSCR6(参见表8B；实施例II)；

[0395] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0396] 3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0397] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0398] 1)测量来自样品的DNA中至少一种甲基化标志基因的量，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0399] ·TACC2_A、LRRC41_A、EPS8L2、LBH、LIME1_B、MDFI、FAIM2_A、GYPC_A、AGRN_B和ZBED4(参见表2A；实施例I)；

[0400] ·MT1A_A、CELF2_A、KCNA3_A、MDFI、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、
MAX.chr6.10382190‑10382225、DSCR6、MAML3_A、MAX.chr14.105512178‑105512224、
EPS8L2_E、SKI、GPRIN1_A、MAX.chr8.142215938‑142216298、CDO1_A、DNMT3A_A、SIM2_A、SKI、MT1A_B、GYPC_A、BCL2L11、PISD和C2CD4D(参见表4B；实施例I)；

[0401] ·NCOR2、MT1A_B、CELF2_A、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、
MAX.chr6.10382190‑10382225、DSCR6、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A、MT1A_B、GYPC_A、BCL2L11、GDF6和C2CD4D(参见表5B；实施例I)；以及

[0402] ·AGRN_8794、BHLHE23_8339、EPS8L2_F、RASSF1_8293、MDFI_6321、SKI、GYPC_C、NKX2‑6_4159、LOC100131366、FAIM2_B、GPRIN1_B、LRRC41_B、TACC2_B、LBH、SIM2_B、CDO1_A和DSCR6(参见表8B；实施例II)；

[0403] 2)测量所述DNA中的至少一种参考标志物的量；以及

[0404] 3)将在所述DNA中测量的所述至少一种甲基化标志基因的量的值计算为在所述DNA中测量的所述参考标志基因的量的百分比，其中所述值指示在所述样品中测量的所述
至少一种甲基化标志DNA的量。

[0405] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0406] 1)通过用亚硫酸氢盐以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理人类个体的生物样品中的基因组DNA，
测量所述生物样品中一种或多种基因的CpG位点的甲基化水平；

[0407] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过修饰的基因组DNA；以及

[0408] 3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；

[0409] 其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0410] ·TACC2_A、LRRC41_A、EPS8L2、LBH、LIME1_B、MDFI、FAIM2_A、GYPC_A、AGRN_B和ZBED4(参见表2A；实施例I)；

[0411] ·MT1A_A、CELF2_A、KCNA3_A、MDFI、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、
MAX.chr6.10382190‑10382225、DSCR6、MAML3_A、MAX.chr14.105512178‑105512224、
EPS8L2_E、SKI、GPRIN1_A、MAX.chr8.142215938‑142216298、CDO1_A、DNMT3A_A、SIM2_A、SKI、MT1A_B、GYPC_A、BCL2L11、PISD和C2CD4D(参见表4B；实施例I)；

[0412] ·NCOR2、MT1A_B、CELF2_A、PALLD、PRDM14、PARP15、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、AGRN_B、
MAX.chr6.10382190‑10382225、DSCR6、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A、MT1A_B、GYPC_A、BCL2L11、GDF6和C2CD4D(参见表5B；实施例I)；以及

[0413] ·AGRN_8794、BHLHE23_8339、EPS8L2_F、RASSF1_8293、MDFI_6321、SKI、GYPC_C、NKX2‑6_4159、LOC100131366、FAIM2_B、GPRIN1_B、LRRC41_B、TACC2_B、LBH、SIM2_B、CDO1_A和DSCR6(参见表8B；实施例II)。

[0414] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0415] 1)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品中的基因组
DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0416] ·PARP15、GPRIN1_A、GYPC1_A、FLJ34208、MAX.chr1.147790358‑147790381、FAIM2_A、SH2B3、KCNQ5、IRF4和BCAT1(参见表2B；实施例I)；

[0417] ·NCOR2、CELF2_A、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、SKI、BCL2L11和C2CD4D(参见表
4C；实施例I)；

[0418] ·NCOR2、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr11.14926602‑14926671、DSCR6、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A和C2CD4D(参见表5C；实施例I)；以及[0419] ·BCAT1_6015、EPS8L2_F、SKI、NKX2‑6_4159、C1QL3_B、GPRIN1_B、PARP15、OXT_C、SIM2_B、DNMT3A_A和CELF2_A(参见表8C；实施例II)；

[0420] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0421] 3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0422] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0423] 1)测量来自样品的DNA中至少一种甲基化标志基因的量，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0424] ·PARP15、GPRIN1_A、GYPC1_A、FLJ34208、MAX.chr1.147790358‑147790381、FAIM2_A、SH2B3、KCNQ5、IRF4和BCAT1(参见表2B；实施例I)；

[0425] ·NCOR2、CELF2_A、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、SKI、BCL2L11和C2CD4D(参见表
4C；实施例I)；

[0426] ·NCOR2、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr11.14926602‑14926671、DSCR6、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A和C2CD4D(参见表5C；实施例I)；以及[0427] ·BCAT1_6015、EPS8L2_F、SKI、NKX2‑6_4159、C1QL3_B、GPRIN1_B、PARP15、OXT_C、SIM2_B、DNMT3A_A和CELF2_A(参见表8C；实施例II)；

[0428] 2)测量所述DNA中的至少一种参考标志物的量；以及

[0429] 3)将在所述DNA中测量的所述至少一种甲基化标志基因的量的值计算为在所述DNA中测量的所述参考标志基因的量的百分比，其中所述值指示在所述样品中测量的所述
至少一种甲基化标志DNA的量。

[0430] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0431] 1)通过用亚硫酸氢盐以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理人类个体的生物样品中的基因组DNA，
测量所述生物样品中一种或多种基因的CpG位点的甲基化水平；

[0432] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过修饰的基因组DNA；以及

[0433] 3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；

[0434] 其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0435] ·PARP15、GPRIN1_A、GYPC1_A、FLJ34208、MAX.chr1.147790358‑147790381、FAIM2_A、SH2B3、KCNQ5、IRF4和BCAT1(参见表2B；实施例I)；

[0436] ·NCOR2、CELF2_A、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、MAX.chr11.14926602‑14926671、MAML3_A、SKI、GPRIN1_A、SKI、BCL2L11和C2CD4D(参见表
4C；实施例I)；

[0437] ·NCOR2、PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr11.14926602‑14926671、DSCR6、GPRIN1_A、CDO1_A、SIM2_A、IFFO1_A和C2CD4D(参见表5C；实施例I)；以及[0438] ·BCAT1_6015、EPS8L2_F、SKI、NKX2‑6_4159、C1QL3_B、GPRIN1_B、PARP15、OXT_C、SIM2_B、DNMT3A_A和CELF2_A(参见表8C；实施例II)。

[0439] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0440] 1)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品中的基因组
DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0441] ·CMTM3_A、ATP10A_C、TSHZ3、ZMIZ1_B、ATP10A_B、ELMO1_B、TACC2_A、LRRC4、VIM和ZNF382_A(参见表2C；实施例I)；

[0442] ·NCOR2、MT1A_A、KCNA3_A、ZMIZ1_C、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B、BCL2L11和GATA2(参见表4D；实施例I)；

[0443] ·NCOR2、PALLD、TACC2_A、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B和BCL2L11(参见表5D；实施例I)；以及

[0444] ·BCAT1_6015、ELMO1_9100、KCNA3_7518、KCNA3_7320、MDFI_6321、SKI、VIPR_B、ZNF382_B、ATP10A_E、CMTM3_B、ZMIZ1_D、SRC_B、HDGFRP3、TACC2_B、TSHZ3、LBH、DNMT3A_A(参见表8D；实施例II)；

[0445] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0446] 3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0447] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0448] 1)测量来自样品的DNA中至少一种甲基化标志基因的量，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0449] ·CMTM3_A、ATP10A_C、TSHZ3、ZMIZ1_B、ATP10A_B、ELMO1_B、TACC2_A、LRRC4、VIM和ZNF382_A(参见表2C；实施例I)；

[0450] ·NCOR2、MT1A_A、KCNA3_A、ZMIZ1_C、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B、BCL2L11和GATA2(参见表4D；实施例I)；

[0451] ·NCOR2、PALLD、TACC2_A、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B和BCL2L11(参见表5D；实施例I)；以及

[0452] ·BCAT1_6015、ELMO1_9100、KCNA3_7518、KCNA3_7320、MDFI_6321、SKI、VIPR_B、ZNF382_B、ATP10A_E、CMTM3_B、ZMIZ1_D、SRC_B、HDGFRP3、TACC2_B、TSHZ3、LBH、DNMT3A_A(参见表8D；实施例II)；

[0453] 2)测量所述DNA中的至少一种参考标志物的量；以及

[0454] 3)将在所述DNA中测量的所述至少一种甲基化标志基因的量的值计算为在所述DNA中测量的所述参考标志基因的量的百分比，其中所述值指示在所述样品中测量的所述
至少一种甲基化标志DNA的量。

[0455] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0456] 1)通过用亚硫酸氢盐以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理人类个体的生物样品中的基因组DNA，
测量所述生物样品中一种或多种基因的CpG位点的甲基化水平；

[0457] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过修饰的基因组DNA；以及

[0458] 3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；

[0459] 其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0460] ·CMTM3_A、ATP10A_C、TSHZ3、ZMIZ1_B、ATP10A_B、ELMO1_B、TACC2_A、LRRC4、VIM和ZNF382_A(参见表2C；实施例I)；

[0461] ·NCOR2、MT1A_A、KCNA3_A、ZMIZ1_C、TACC2_A、MAX.chr1.147790358‑147790381、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B、BCL2L11和GATA2(参见表4D；实施例I)；

[0462] ·NCOR2、PALLD、TACC2_A、BCAT1、AGRN_B、SKI、SLC12A8、ZMIZ1_B和BCL2L11(参见表5D；实施例I)；以及

[0463] ·BCAT1_6015、ELMO1_9100、KCNA3_7518、KCNA3_7320、MDFI_6321、SKI、VIPR_B、ZNF382_B、ATP10A_E、CMTM3_B、ZMIZ1_D、SRC_B、HDGFRP3、TACC2_B、TSHZ3、LBH、DNMT3A_A(参见表8D；实施例II)。

[0464] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0465] 1)通过用以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，其中所述试剂是亚硫酸氢盐试剂、甲基化敏感性限制酶或甲基化依赖性限制酶)处理人类个体的生物样品中的基因组
DNA，测量所述生物样品中一种或多种基因的甲基化水平，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0466] ·MAX.chr1.147790358‑147790381、MAML3、NR2F6、DNMT3A_A、SKI、SOBP、UBTF、AGRN_C、MAX.chr12.30975740‑30975780和CAPN2_A(参见表2D；实施例I)；

[0467] ·PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、CAPN2_A、MAX.chr6.10382190‑10382225、SKI、NR2F6、IFFO1_A、MT1A_B、IFFO1_B、GDF6和C2CD4D(参见表4E；实施例I)；

[0468] ·NCOR2、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr6.10382190‑10382225、IFFO1_A、GDF6和C2CD4D(参见表5A；实施例I)；以及

[0469] ·SKI、PEAR1_B、CAPN2_B、SIM2_B、DNMT3A_A、CDO1_A和NR2F6(参见表8E；实施例II)；

[0470] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过处理的基因组DNA；以及

[0471] 3)通过聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离以及靶标捕获确定所述一种或多种基因的甲基化水平。

[0472] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0473] 1)测量来自样品的DNA中至少一种甲基化标志基因的量，其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0474] ·MAX.chr1.147790358‑147790381、MAML3、NR2F6、DNMT3A_A、SKI、SOBP、UBTF、AGRN_C、MAX.chr12.30975740‑30975780和CAPN2_A(参见表2D；实施例I)；

[0475] ·PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、CAPN2_A、MAX.chr6.10382190‑10382225、SKI、NR2F6、IFFO1_A、MT1A_B、IFFO1_B、GDF6和C2CD4D(参见表4E；实施例I)；

[0476] ·NCOR2、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr6.10382190‑10382225、IFFO1_A、GDF6和C2CD4D(参见表5A；实施例I)；以及

[0477] ·SKI、PEAR1_B、CAPN2_B、SIM2_B、DNMT3A_A、CDO1_A和NR2F6(参见表8E；实施例II)；

[0478] 2)测量所述DNA中的至少一种参考标志物的量；以及

[0479] 3)将在所述DNA中测量的所述至少一种甲基化标志基因的量的值计算为在所述DNA中测量的所述参考标志基因的量的百分比，其中所述值指示在所述样品中测量的所述
至少一种甲基化标志DNA的量。

[0480] 在这项技术的一些实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：

[0481] 1)通过用亚硫酸氢盐以甲基化特异性方式修饰DNA的试剂(例如，甲基化敏感性限制酶、甲基化依赖性限制酶和亚硫酸氢盐试剂)处理人类个体的生物样品中的基因组DNA，
测量所述生物样品中一种或多种基因的CpG位点的甲基化水平；

[0482] 2)使用一组针对所选择的一种或多种基因的引物扩增经过修饰的基因组DNA；以及

[0483] 3)通过甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序或亚硫酸氢盐基因组测序PCR确定所述CpG位点的甲基化水平；

[0484] 其中所述一种或多种基因选自以下组中的一组：

[0485] ·MAX.chr1.147790358‑147790381、MAML3、NR2F6、DNMT3A_A、SKI、SOBP、UBTF、AGRN_C、MAX.chr12.30975740‑30975780和CAPN2_A(参见表2D；实施例I)；

[0486] ·PALLD、PRDM14、MAX.chr1.147790358‑147790381、CAPN2_A、MAX.chr6.10382190‑10382225、SKI、NR2F6、IFFO1_A、MT1A_B、IFFO1_B、GDF6和C2CD4D(参见表4E；实施例I)；

[0487] ·NCOR2、MAX.chr1.147790358‑147790381、MAX.chr6.10382190‑10382225、IFFO1_A、GDF6和C2CD4D(参见表5A；实施例I)；以及

[0488] ·SKI、PEAR1_B、CAPN2_B、SIM2_B、DNMT3A_A、CDO1_A和NR2F6(参见表8E；实施例II)。

[0489] 在任何此类方法中，确定任何此类标志物的甲基化水平是使用表1C或6B中列举的引物完成的。

[0490] 优选地，这类方法的灵敏度为约70％至约100％，或约80％至约90％，或约80％至约85％。优选地，特异性为约70％至约100％，或约80％至约90％，或约80％至约85％。

[0491] 基因组DNA可以通过任何方式分离，包括使用市售试剂盒。简单地说，当感兴趣的DNA被细胞膜包裹时，生物样品必须通过酶促、化学或机械方式进行破坏和溶解。然后可以例如通过用蛋白酶K消化来清除DNA溶液中的蛋白质和其它污染物。然后从溶液中回收基因
组DNA。这可以通过多种方法进行，包括盐析、有机萃取或将DNA结合到固相载体上。方法的选择将受到几种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA数量。包含赘生物或肿瘤发生前物质的所有临床样品类型都适用于本发明的方法，例如细胞系、组织切片、活检、石蜡包埋组织、体液、粪便、卵巢组织、结肠流出物、尿液、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞以及它们的组合。

[0492] 这项技术不限于用于制备样品和提供用于测试的核酸的方法。例如，在一些实施方案中，使用直接基因捕获，例如，如美国专利申请序列号61/485386中所详述，或通过相关方法，从粪便样品或血液或血浆样品中分离DNA。

[0493] 然后用至少一种试剂或一系列试剂处理基因组DNA样品，所述试剂区分包含DMR(例如DMR 1‑560，如表1A和6A所提供)的至少一种标志物内的甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸。

[0494] 在一些实施方案中，试剂将在5'‑位置未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面与胞嘧啶不同的另一碱基。然而，在一些实施方案中，试剂可以是甲基化敏感性限制酶。

[0495] 在一些实施方案中，基因组DNA样品通过如下方式进行处理，使得将在5'‑位置未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面与胞嘧啶不同的另一碱
基。在一些实施方案中，这种处理是用亚硫酸氢盐(亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐)，然后碱水解进行的。

[0496] 然后分析处理过的核酸以确定靶基因序列(来自包含DMR，例如至少一种选自DMR 1‑560(例如，如表1A和6A中提供)的DMR的标志物的至少一种基因、基因组序列或核苷酸)的甲基化状态。分析方法可选自本领域已知的那些，包括本文所列的那些，例如本文所述的
QuARTS和MSP。

[0497] 异常甲基化，更具体地，包含DMR(例如，DMR 1‑560，例如，如表1A和6A所提供)的标志物的高甲基化与卵巢癌相关。

[0498] 这项技术涉及与卵巢癌相关的任何样品的分析。例如，在一些实施方案中，样品包含从患者获得的组织和/或生物流体。在一些实施方案中，样品包含分泌物。在一些实施方案中，样品包含血液、血清、血浆、胃分泌物、胰液、胃肠活检样品、来自卵巢组织活检的显微解剖细胞和/或从粪便中回收的细胞。在一些实施方案中，样品包含卵巢组织。在一些实施方案中，受试者是人。样品可以包括来自卵巢、乳房、肝脏、胆管、胰腺、胃、结肠、直肠、食道、小肠、阑尾、十二指肠、息肉、胆囊、肛门和/或腹膜的细胞、分泌物或组织。在一些实施方案中，样品包含细胞液、腹水、尿液、粪便、胰液、在内窥镜检查期间获得的流体、血液、粘液或唾液。在一些实施方案中，样品是粪便样品。

[0499] 这类样品可以通过本领域已知的，例如熟练技术人员显而易见的多种方法获得。例如，尿液和粪便样品很容易获得，而血液、腹水、血清或胰液样品可以通过使用例如针头和注射器以肠胃外方式获得。可以通过使样品经受本领域技术人员已知的各种技术，包括
但不限于离心和过滤来获得无细胞或基本上无细胞的样品。尽管通常优选不使用侵入性技
术来获得样品，但获得样品例如组织匀浆、组织切片和活检标本仍可能是优选的。

[0500] 在一些实施方案中，这项技术涉及一种治疗患者(例如，患有卵巢癌的患者)(例如，患有透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性OC、浆液性OC的患者)的方法，该方法包括确定如本文提供的一种或多种DMR的甲基化状态并基于确定甲基化状态的结果对患者进行治
疗。治疗可以是施用药物化合物、疫苗、进行手术、对患者进行成像、进行另一测试。优选地，所述使用是在临床筛查方法、预后评估方法、监测疗法结果的方法、鉴定最可能对特定治疗性治疗有反应的患者的方法、对患者或受试者进行成像的方法以及药物筛查和开发的方法
中。

[0501] 在这项技术的一些实施方案中，提供了一种用于诊断受试者中的卵巢癌的方法。如本文所用，术语“诊断(diagnosing)”和“诊断(diagnosis)”是指熟练技术人员可以估计甚至确定受试者是否患有给定疾病或疾患或将来是否可能显现给定疾病或疾患的方法。熟
练技术人员通常基于一种或多种诊断指标做出诊断，所述诊断指标例如生物标志物(例如，如本文公开的DMR)，其甲基化状态指示疾患存在、严重性或不存在。

[0502] 连同诊断一起，临床癌症预后涉及确定癌症的侵袭性和肿瘤复发的可能性，以规划最有效的疗法。如果可以做出更准确的预后，或者甚至可以评估显现癌症的潜在风险，则可以为患者选择适当的疗法，在某些情况下，可以选择不太严重的疗法。癌症生物标志物的评估(例如，确定甲基化状态)可用于将不需要疗法或需要有限疗法的具有良好预后和/或
显现癌症风险低的受试者与更可能显现癌症或遭受癌症复发的受益于更深入的治疗的受
试者分开。

[0503] 因此，如本文所用，“做出诊断”或“诊断”还包括确定显现癌症的风险或确定预后，这可以基于本文公开的诊断生物标志物(例如，DMR)的测量预测临床结果(有或没有医学治疗)、选择适当的治疗(或治疗是否有效)或监测当前治疗并可能改变治疗。此外，在本公开主题的一些实施方案中，可以随时间对生物标志物进行多次测定以促进诊断和/或预后。生物标志物的时间变化可用于预测临床结果、监测卵巢癌的进展和/或监测针对癌症的适当
疗法的功效。例如，在这样的实施方案中，可能期望在有效疗法过程期间的时间内看到生物样品中的一种或多种本文公开的生物标志物(例如DMR)(以及可能的一种或多种额外生物
标志物，如果被监测)的甲基化状态的变化。

[0504] 在一些实施方案中，本发明公开的主题还提供了一种用于确定是否在受试者中开始或继续癌症的预防或治疗的方法。在一些实施方案中，该方法包括在一段时间内提供来
自受试者的一系列生物样品；分析该系列生物样品以确定每个生物样品中至少一种本文公
开的生物标志物的甲基化状态；以及比较每个生物样品中一种或多种生物标志物的甲基化
状态的任何可测量变化。一段时间内生物标志物甲基化状态的任何变化都可用于预测显现
癌症的风险、预测临床结果、确定是否开始或继续癌症的预防或疗法，以及当前疗法是否有效治疗癌症。例如，可以在开始治疗之前选择第一时间点并且可以在开始治疗之后的某个
时间选择第二时间点。甲基化状态可以在取自不同时间点的每个样品中测量，并记录定性
和/或定量差异。来自不同样品的生物标志物水平的甲基化状态的变化可与受试者中的卵
巢癌风险、预后、确定治疗功效和/或癌症进展相关。

[0505] 在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物用于在早期阶段，例如在疾病症状出现之前治疗或诊断疾病。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物用于在临床阶段治
疗或诊断疾病。

[0506] 如所述，在一些实施方案中，可以对一种或多种诊断或预后生物标志物进行多次测定，并且可以使用标志物的时间变化来确定诊断或预后。例如，可以在初始时间确定诊断标志物，并在第二时间再次确定。在这样的实施方案中，标志物从初始时间到第二时间的增加可以诊断癌症的特定类型或严重程度，或给定的预后。同样，标志物从初始时间到第二时间的减少可以指示癌症的特定类型或严重程度，或给定的预后。此外，一种或多种标志物的变化程度可能与癌症的严重程度和未来的不良事件有关。技术人员将理解，虽然在某些实
施方案中可以在多个时间点对相同的生物标志物进行比较测量，但也可以在一个时间点测
量给定的生物标志物，并在第二个时间点测量第二种生物标志物，并且比较这些标志物可
以提供诊断信息。

[0507] 如本文所用，短语“确定预后”是指熟练技术人员可以预测受试者的疾患的进程或结果的方法。术语“预后”并不是指能够以100％的准确度预测疾患的进程或结果，甚至不是基于生物标志物(例如DMR)的甲基化状态大概预测给定的进程或结果发生的可能性。相反，熟练技术人员会理解，术语“预后”是指某个过程或结果发生的可能性增加；也就是说，与未表现出给定疾患的那些个体相比，表现出疾患的受试者更可能发生过程或结果。例如，在未表现出疾患(例如，具有一种或多种DMR的正常甲基化状态)的个体中，给定结果(例如，患有卵巢癌)的机会可能非常低。

[0508] 在一些实施方案中，统计分析将预后指标与不利结果的倾向相关联。例如，在一些实施方案中，与从未患癌症的患者获得的正常对照样品中的甲基化状态不同的甲基化状态可以表示受试者比水平更类似于对照样品中的甲基化状态的受试者更可能患上癌症，如由
统计显著性水平确定。此外，甲基化状态相对于基线(例如，“正常”)水平的变化可以反映受试者的预后，并且甲基化状态的变化程度可以与不良事件的严重程度相关。通常通过比较
两个或更多个群体并确定置信区间和/或p值来确定统计显著性。参见例如Dowdy和
Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,1983，以引用的方式整
体并入本文中。本发明主题的示例性置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、
99.9％和99.99％，而示例性p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。

[0509] 在其它实施方案中，可以建立本文公开的预后或诊断生物标志物(例如，DMR)的甲基化状态变化的阈值程度，并且简单地比较生物样品中生物标志物的甲基化状态变化程度
与甲基化状态变化的阈值程度。本文提供的生物标志物的甲基化状态的优选阈值变化为约
5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％和约150％。在其它实施方案中，可以建立“列线图”，通过该“列线图”，预后或诊断指标(生物标志物或生物标志物的组合)的甲基化状态与给定结果的相关倾向直接相关。熟练技术人员熟悉使用这类
列线图来关联两个数值，并理解该测量中的不确定度与标志物浓度中的不确定度相同，因
为参考的是单个样品测量值，而不是总体平均值。

[0510] 在一些实施方案中，对照样品与生物样品同时分析，使得从生物样品获得的结果可以与从对照样品获得的结果进行比较。此外，预期可提供标准曲线，生物样品的测定结果可与之进行比较。如果使用荧光标记，则这类标准曲线将生物标志物的甲基化状态呈现为
测定单位的函数，例如荧光信号强度。使用取自多个供体的样品，可以提供正常组织中一种或多种生物标志物的对照甲基化状态，以及取自具有化生的供体或患有卵巢癌的供体的组
织中一种或多种生物标志物的“风险”水平的标准曲线。在该方法的某些实施方案中，在从受试者获得的生物样品中鉴定本文提供的一种或多种DMR的异常甲基化状态后，受试者被
鉴定为具有化生。在该方法的其它实施方案中，在从受试者获得的生物样品中检测到一种
或多种这类生物标志物的异常甲基化状态引起该受试者被鉴定为患有癌症。

[0511] 标志物的分析可以单独或与一个测试样品中的另外的标志物同时进行。例如，可以将几种标志物组合到一个测试中以有效处理多个样品并潜在地提供更高的诊断和/或预
后准确性。此外，本领域技术人员会认识到测试来自同一受试者的多个样品(例如，在连续时间点)的价值。这类系列样品测试可以鉴定标志物甲基化状态随时间的变化。甲基化状态的变化以及甲基化状态没有变化可以提供有关疾病状态的有用信息，包括但不限于鉴定事
件发生的大致时间、可挽救组织的存在和数量、药物疗法的适当性、各种疗法的有效性以及对受试者结果的鉴定，包括未来事件的风险。

[0512] 生物标志物的分析可以呈多种物理格式进行。例如，可以使用微量滴定板或自动化来促进大量测试样品的处理。可替代地，可以开发单一样品格式以促进以及时方式进行
即刻治疗和诊断，例如在非卧床运输或急诊室环境中。

[0513] 在一些实施方案中，如果与对照甲基化状态相比，样品中至少一种生物标志物的甲基化状态存在可测量的差异，则受试者被诊断为患有卵巢癌。相反，当在生物样品中未鉴定出甲基化状态的变化时，可以鉴定受试者为未患卵巢癌、没有患癌症的风险或具有低的
患癌症的风险。在这点上，患有癌症或其风险的受试者可以与患有低至基本上没有癌症或
其风险的受试者相区分。那些有显现卵巢癌风险的受试者可以进行更密集和/或定期的筛
查计划，包括内窥镜监测。另一方面，那些具有低至基本上没有风险的受试者可以避免接受额外的卵巢癌测试(例如，侵入性程序)，直到例如未来的筛查，例如根据本发明的技术进行的筛查表明在那些受试者中出现了卵巢癌风险的时间。

[0514] 如上所述，根据本发明的技术方法的实施方案，检测一种或多种生物标志物的甲基化状态的变化可以是定性测定，也可以是定量测定。因此，将受试者诊断为患有卵巢癌或有显现卵巢癌风险的步骤表明进行了某些阈值测量，例如，生物样品中一种或多种生物标
志物的甲基化状态不同于预定的对照甲基化状态。在该方法的一些实施方案中，对照甲基
化状态是生物标志物的任何可检测的甲基化状态。在对照样品与生物样品同时测试的方法
的其它实施方案中，预定甲基化状态是对照样品中的甲基化状态。在该方法的其它实施方
案中，预定甲基化状态基于标准曲线和/或由标准曲线鉴定。在该方法的其它实施方案中，预定甲基化状态是特定状态或状态范围。因此，可以在本领域技术人员显而易见的可接受
限度内，部分地基于所实践的方法的实施方案和期望的特异性等来选择预定甲基化状态。

[0515] 进一步关于诊断方法，优选的受试者是脊椎动物受试者。优选的脊椎动物是温血动物；优选的温血脊椎动物是哺乳动物。优选的哺乳动物最优选是人。如本文所用，术语“受试者”包括人和动物受试者。因此，本文提供了兽医治疗用途。因此，本发明的技术提供了对哺乳动物(例如人类)以及以下动物的诊断：那些因濒危而重要的哺乳动物(例如东北虎)；
具有经济重要性的动物，例如在农场饲养供人类食用的动物；和/或对人类具有社会重要性的动物，例如作为宠物或在动物园饲养的动物。这种动物的实例包括但不限于：食肉动物，例如猫和狗；猪科动物，包括猪、肉猪和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物，如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；和马。因此，还提供了家畜的诊断和治疗，包括但不限于家养猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)等。

[0516] 本发明公开的主题还包括用于诊断受试者中的卵巢癌和/或特定形式的卵巢癌(例如，透明细胞OC、子宫内膜样EC、粘液性OC、浆液性EC)的系统。例如，该系统可作为市售试剂盒提供，该试剂盒可用于筛查已收集生物样品的受试者患卵巢癌的风险或诊断其患卵
巢癌。根据本发明的技术提供的示例性系统包括评估如表1A和6A中提供的DMR的甲基化状
态。

[0517] 实施例

[0518] 实施例I.

[0519] 组织和血液从Mayo Clinic生物样本库获得，并接受机构IRB监督。样本的选择严格遵守主题研究授权和纳入/排除标准。癌症亚型包括1)浆液性OC，2)透明细胞OC，3)粘液性OC，和4)子宫内膜样OC。对照物包括非赘生物输卵管组织和全血来源的白细胞。对组织进行宏观解剖并由专门的妇科学病理学家审查组织学。样品经过年龄匹配，随机化并且是盲
样。分别使用QIAamp DNA Tissue Mini试剂盒和QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen,
Valencia CA)纯化来自77个冷冻组织(18个浆液性OC、15个透明细胞OC、6个粘液性OC、18个子宫内膜样OC、6个良性输卵管、14个良性输卵管刷取物)和19个无癌女性的血沉棕黄层的
样品DNA。DNA用AMPure XP珠(Beckman‑Coulter,Brea CA)再纯化，并通过PicoGreen
(Thermo‑Fisher,Waltham MA)定量。使用qPCR评估DNA完整性。还对4个卵巢癌细胞系进行测序(TOV21G、SKOV3、OVCAR3、CAOV3)。

[0520] RRBS测序文库是按照Meissner协议(Gu等人Nature Protocols 2011年4月；6(4):468‑81)并经过修改制备的。样品以4重形式合并，并通过Mayo Genomics Facility在
Illumina HiSeq 2500仪器(Illumina,San Diego CA)上进行测序。读数由Illumina管道模
块处理，用于图像分析和碱基判读。使用Mayo开发的生物信息学套件SAAP‑RRBS进行二次分析。简单地说，使用Trim‑Galore清理读数，并与使用BSMAP构建的GRCh37/hg19参考基因组比对。对于覆盖率≥10X并且碱基质量得分≥20的CpG，甲基化比率通过计算C/(C+T)或对于映射到反向链的读数，相反地，计算G/(G+A)来确定。

[0521] 单个CpG按高甲基化比率排序，即给定基因座的甲基化胞嘧啶数量占该基因座总胞嘧啶计数的比率。对于病例，要求比率≥0.20(20％)；对于组织对照，≤0.05(5％)；对于血沉棕黄层对照，≤0.01(1％)。不符合这些标准的CpG被丢弃。随后，候选CpG通过基因组定位被分入DMR(差异甲基化区域)，范围在大约60‑200bp，每个区域的最小截止值为5个CpG。
CpG密度过高(>30％)的DMR被排除在外，以避免在验证阶段出现GC相关的扩增问题。对于每个候选区域，创建了一个2D矩阵，它针对病例和对照物，以样品间的方式对单个CpG进行比较。分析总体OC与所有良性卵巢组织和/或无癌血沉棕黄层，以及亚型比较。然后将这些CpG矩阵与参考序列进行比较，以评估在初始过滤过程中是否丢弃了基因组连续的甲基化位
点。从这个区域子集中，最终选择要求在每个样品水平上跨DMR序列的单个CpG协调和连续
的高甲基化(在病例下)。相反，对照样品的甲基化程度必须至少比病例低10倍，并且CpG模式必须更加随机且不那么协调。要求亚型队列中至少10％的癌症样品对DMR内的每个CpG位
点具有至少50％的高甲基化比率。

[0522] 在单独的分析中，利用专有的DMR鉴定管道和回归包，根据CpG的平均甲基化值推导出DMR。比较OC病例、组织对照和血沉棕黄层对照之间平均甲基化百分比的差异；每个映射的CpG的100个碱基对内的平铺阅读框用于鉴定对照甲基化<5％的DMR；仅当覆盖的总深
度为每个受试者平均10个读数并且亚组间的差异>0时才分析DMR。假设比值比的生物学相
关增加>3x并且覆盖深度为10个读数，在双侧检验中，在5％的显著性水平和假设二项式方
差膨胀因子为1下，每组需要≥18个样品才能达到80％的功效。

[0523] 回归后，DMR按p值、接受者操作特征曲线下面积(AUC)和病例与所有对照之间的变化倍数差异排序。由于事先计划了独立验证，因此在此阶段没有对错误发现进行调整。

[0524] 使用样品制备、测序、分析管道和过滤器的专有方法来鉴定差异甲基化区域(DMR)并将其缩小到那些可以精确定位这些妇科癌症并在临床测试环境中表现出色的DMR。从组
织到组织分析，鉴定了471个高甲基化卵巢癌(OC)DMR(表1A和1B)。它们包括OC特定区域、OC亚型特定区域以及针对更通用癌症谱的那些区域。表2A、2B、2C和2D中列出了排名最高的亚型DMR。组织对白细胞(血沉棕黄层)分析产生了55个高甲基化卵巢组织DMR，其中WBC中的噪音小于1％(表1A和1B中所示的DMR 472‑525)。表3中列出了最高的总体血沉棕黄层DMR。从组织和血沉棕黄层标志物组中，选择了68种候选标志物作为初始试点。开发了甲基化特异
性PCR测定并在两轮组织样品上进行了测试；那些被测序的样品(冷冻)和更大的独立队列
(FFPE)。短扩增子引物(<150bp)被设计成靶向DMR中最具辨别力的CpG，并在对照物上进行
测试以确保完全甲基化的片段以线性方式稳健地扩增；而未甲基化和/或未转化的片段不
会扩增。表1C中列出了136个引物序列。最终，进行了54个测定(14个测定未能通过QC并被放弃)。

[0525] 对阶段一验证的结果进行逻辑分析以确定AUC和变化倍数。从以前的工作中认识到，器官内癌症亚型的表观遗传学不同，并且最好的组来自亚型标志物的组合。组织和血沉棕黄层对照的分析是分开进行的。结果在表4A、4B、4C、4D和4E中突出显示。许多测定对OC与血沉棕黄层样品具有100％的辨别率，并且在OC与良性输卵管比较中辨别率接近100％。

[0526] 这些结果为用于独立样品测试的高性能候选者提供了丰富的来源。在最初的54个测定中，选择33个。大多数都在0.90‑1.00的AUC范围内，但包括具有极高FC数(非常少的背景)的其它MDM和/或表现出与其它甲基化DNA标志物(MDM)的互补性的那些MDM。所有测定都
展示了高分析性能‑线性、效率、序列特异性(使用熔化曲线分析评估)和强扩增。

[0527] 在第2轮验证中，与上一步一样，整个样品和标志物组在一个批次中运行。每种标志物运行约10ng FFPE来源的样品DNA‑总共350种。表5A、5B、5C和5D中列出了OC亚型对比正常组织和血沉棕黄层的个别MDM结果。与对照物相比，多种MDM在所有OC组织学中都显示出
显著的甲基化变化倍数(10至>1000)。

[0528] 数据以热矩阵格式绘制，允许互补性可视化。交叉验证的2‑MDM图源自于rPART模拟(C2CD4D、NCOR2)，其以99％特异性和97％灵敏度区分总体OC与良性输卵管组织。亚型
rPART和随机森林模拟在所有组织学中产生了完美的区分(AUC＝1)。

[0529] 全甲基化组测序、严格的过滤标准和生物学验证得出针对卵巢癌的出色候选MDM。一些MDM以相对较高的灵敏度区分所有OC组织学与对照物，而另一些则准确地区分组织学。
鉴于高鉴别性和易于测定，此类MDM值得进一步探索作为早期检测标志物的临床应用。

[0530] 表1A提供了DMR信息，包括此类标志物的染色体编号、基因注释和DMR起始/终止位置。表1B提供了p值、接受者操作特征曲线下面积(AUC)和OC病例与所有对照物之间的变化
倍数差异。表1C提供了表1A和1B中提供的各种标志物的引物序列信息。

[0531] 表1A.

[0532]

[0533]

[0534]

[0535]

[0536]

[0537]

[0538]

[0539]

[0540]

[0541]

[0542]

[0543]

[0544] 表1B.

[0545]

[0546]

[0547]

[0548]

[0549]

[0550]

[0551]

[0552]

[0553]

[0554]

[0555]

[0556]

[0557] 表1C.

[0558]

[0559]

[0560]

[0561]

[0562]

[0563]

[0564] 选择DMR的一个子集进行进一步开发。标准主要是逻辑推导的ROC曲线下面积度量，它提供了对该区域辨别潜力的性能评估。选择0.85的AUC作为截止值。此外，计算甲基化变化倍数比(平均癌症高甲基化比率/平均对照高甲基化比率)，组织与组织比较采用下限
10，并且组织与血沉棕黄层比较采用下限20。要求p值小于0.01。DMR必须在平均和单个CpG选择过程中列出。使用MethPrimer(Li LC和Dahiya R.Bioinformatics 2002年11月；18
(11):1427‑31)为候选区域设计定量甲基化特异性PCR(qMSP)引物，并且对20ng(6250当量)的阳性和阴性基因组甲基化对照进行QC检查。测试多个退火温度以获得最佳辨别。在qMSP
的两个阶段中进行验证。第一个阶段由重新测试已测序的DNA样品组成。这样做是为了验证DMR是真正具有辨别力的，而不是过度拟合极大的下一代数据集的结果。第二个阶段使用了更大的独立样品集(浆液性OC‑36个样品；透明细胞OC‑21个样品；粘液性OC‑14个样品；子宫内膜样OC‑23个样品；对照输卵管良性‑29个样品；对照血沉棕黄层‑28个样品)。

[0565] 组织像以前一样通过专家临床和病理审查进行鉴定。如前所述进行DNA纯化。EZ‑96DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,Irvine CA)用于亚硫酸氢盐转化步骤。在Roche 480 
LightCyclers(Roche,Basel Switzerland)上使用SYBR Green检测扩增10ng转化的DNA(每
种标志物)。连续稀释的通用甲基化基因组DNA(Zymo Research)用作定量标准。CpG不可知
的ACTB(β‑肌动蛋白)测定用作输入参考和标准化对照。结果表示为甲基化拷贝(特定标志物)/ACTB拷贝。

[0566] 对单个MDM(甲基化DNA标志物)性能的结果进行逻辑分析。对于标志物的组合，使用两种技术。首先，将rPart技术应用于整个MDM集并仅限于3种MDM的组合，在此基础上计算出rPart预测的癌症概率。第二种方法使用随机森林回归(rForest)，它生成500个单独的
rPart模型，这些模型与原始数据的boot strap样品拟合(大约2/3数据用于训练)并用于估
计整个MDM组的交叉验证误差(1/3数据用于测试)，并重复500次，以避免低估或高估真实交叉验证度量的虚假分离。然后将结果在500次迭代中取平均值。

[0567] 表2A示出了区分透明细胞OC组织与血沉棕黄层对照和对照输卵管组织的十个甲基化区域(对照血沉棕黄层、对照输卵管组织和透明细胞OC组织的甲基化百分比)(AUC和透
明细胞组织甲基化％与对照输卵管甲基化％之间的p值)。

[0568] 表2A.区分透明细胞OC组织与血沉棕黄层对照、对照输卵管组织、透明细胞卵巢癌组织的十个甲基化区域。

[0569]

[0570] 表2B示出了区分子宫内膜样OC组织与血沉棕黄层对照和对照输卵管组织的十个甲基化区域(对照血沉棕黄层、对照输卵管组织和子宫内膜样OC组织的甲基化百分比)(AUC
和子宫内膜样组织甲基化％与对照输卵管甲基化％之间的p值)。

[0571] 表2B.区分子宫内膜样OC组织与血沉棕黄层对照、对照输卵管组织、子宫内膜样卵巢癌组织的十个甲基化区域。

[0572]

[0573] 表2C示出了区分粘液性OC组织与血沉棕黄层对照和对照输卵管组织的十个甲基化区域(对照血沉棕黄层、对照输卵管组织和粘液性OC组织的甲基化百分比)(AUC和粘液性
组织甲基化％与对照输卵管甲基化％之间的p值)。

[0574] 表2C.区分粘液性OC组织与血沉棕黄层对照、对照输卵管组织和粘液性卵巢癌组织的十个甲基化区域。

[0575]

[0576] 表2D示出了区分浆液性OC组织与血沉棕黄层对照和对照输卵管组织的十个甲基化区域(对照血沉棕黄层、对照输卵管组织和浆液性OC组织的甲基化百分比)(AUC和浆液性
组织甲基化％与对照输卵管甲基化％之间的p值)。

[0577] 表2D.区分浆液性OC组织与血沉棕黄层对照、对照输卵管组织、卵巢癌组织的十个甲基化区域。

[0578]

[0579]

[0580] 表3示出了区分OC组织与血沉棕黄层对照的前10个甲基化区域(提供了OC与对照血沉棕黄层之间的甲基化百分比差异；提供了OC与对照输卵管之间的甲基化百分比差异；
提供了AUC；提供了变化倍数差异；以及提供了p值。

[0581] 表3.

[0582]

[0583]

[0584] 表4A‑E是初始组织验证的结果，其中从测序数据中选择了超过60个最高的DMR，并设计了qMSP测定。这些DMR在OC组织、透明细胞OC组织、子宫内膜样OC组织、粘液性OC组织、浆液性OC组织和对照输卵管组织上运行。接下来，进行了更大的独立组织验证，其中测试了新的未测试过的病例和对照物(参见表5)。

[0585] 表4A.

[0586]

[0587]

[0588] 表4B.

[0589]

[0590]

[0591]

[0592] 表4C.

[0593]

[0594]

[0595] 表4D.

[0596]

[0597]

[0598] 表4E.

[0599]

[0600]

[0601] 表5A示出了表1中区分浆液性OC组织与良性卵巢组织和血沉棕黄层的各种标志物的曲线下面积。

[0602] 表5A.

[0603]

[0604]

[0605] 表5B示出了表1中区分透明细胞OC组织与良性卵巢组织和血沉棕黄层的各种标志物的曲线下面积。

[0606] 表5B.

[0607]

[0608]

[0609] 表5C示出了表1中区分子宫内膜样OC组织与良性卵巢组织和血沉棕黄层的各种标志物的曲线下面积。

[0610] 表5C.

[0611]

[0612]

[0613] 表5D示出了表1中区分粘液性OC组织与良性卵巢组织和血沉棕黄层的各种标志物的曲线下面积。

[0614] 表5D.

[0615]

[0616]

[0617] 实施例II.

[0618] 本实施例描述了卵巢癌组织标志物、透明细胞卵巢癌组织标志物、子宫内膜样卵巢癌组织标志物、粘液性卵巢癌组织标志物和浆液性卵巢癌组织标志物的鉴定。

[0619] 通过卵巢组织样品、透明细胞OC组织样品、子宫内膜样OC组织样品、粘液性OC组织样品、浆液性OC组织样品和正常卵巢组织样品的RRBS鉴定用于检测卵巢癌、透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性OC和浆液性OC的候选甲基化标志物。为了鉴定甲基化DNA标志物，每个患者组149个样品(参见表7)进行RRBS过程，然后与经过亚硫酸氢盐转化的人类基因组进行比对。选择卵巢癌、透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性OC和浆液性OC中相对于正常卵巢组织和血沉棕黄层的甲基化比率高的CpG区域并映射到它们的基因名称。

[0620] 表7.

[0621] 样品类型 数目 I期 II期 III期 IV期正常 35 NA NA NA NA
癌症 57 25 8 19 5
           
癌症亚型 数目 I期 II期 III期 IV期
透明细胞 15 8 4 3 0
子宫内膜样 18 12 3 3 0
粘液性 6 4 1 0 1
浆液性 18 1 0 13 4

[0622] 通过RRBS选择标志物后，共鉴定出49种甲基化标志物，并设计和订购了富集靶标的长探针定量放大信号测定(通用技术参见例如WO2017/075061和美国专利申请序列号
WO2017/075061)。表6A示出了用于49种甲基化标志物的标志物染色体区域。表6B示出了标
志物的引物信息和探针信息。图1还提供了用于49种甲基化标志物的标志物染色体区域以
及相关的引物和探针信息。

[0623] 表6A.

[0624]

[0625]

[0626] 表6B.

[0627]

[0628]

[0629]

[0630]

[0631]

[0632]

[0633]

[0634]

[0635] 每种甲基化标志物的灵敏度以每个亚型的95％截止值计算并列于表8A(卵巢癌)、8B(透明细胞OC)、8C(子宫内膜样OC)、8D(粘液性OC)和8E(浆液性OC)中。表8A‑E示出了表6A中所示的标志物针对OC、透明细胞OC、子宫内膜样OC、粘液性和浆液性OC在95％特异性下的卵巢癌和亚型组织灵敏度。

[0636] 表8A.

[0637]

[0638]

[0639] 表8B.

[0640]

[0641]

[0642]

[0643] 表8C.

[0644]

[0645]

[0646] 表8D.

[0647]

[0648]

[0649] 表8E.

[0650]

[0651]

[0652] 实施例III.

[0653] 本实例描述了用于检测卵巢癌(OC)的血浆标志物的鉴定。

[0654] DNA甲基化是癌症发生的早期事件，可以在癌症患者的血浆样品中检测到。在从组织中提取的DNA中，实验(在实施例I和II中描述)首先在组织样品内发现了可辨别OC的甲基
化DNA标志物(MDM)候选者，然后进行了验证。随后的实验独立测试了患有OC和未患OC的女
性的血浆，并鉴定、验证和证明了甲基化DNA标志物用于OC血浆检测的临床可行性。

[0655] 为了发现，来自67个冷冻组织(18个高级别浆液性(HGS)、18个子宫内膜样、15个透明细胞(CC)、6个粘液性OC；10个良性输卵管上皮(FTE)；)和19个无癌女性的血沉棕黄层的DNA进行简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)以鉴定与OC相关的MDM。候选MDM的选择是基于接受者操作特征(ROC)区分、甲基化变化倍数和对照之间的低背景甲基化。使用MSP对从来
自OC(36个HGS、22个子宫内膜样、21个CC和14个粘液性)和29个FTE的独立FFPE组织中提取
的DNA进行盲法生物验证。使用长探针定量信号测定在新诊断出患有OC的女性和人群抽样
的健康女性的独立处理前血浆样品中测试在组织中性能最佳的MDM。进行随机森林建模分
析以产生疾病的预测概率；结果是计算机交叉验证的500倍。

[0656] 在RRBS发现和生物验证后，33种MDM在所有OC组织学与FTE中显示出显著的甲基化变化倍数(10至>1000)。对91名患有OC(76名(84％)HGS)和91名未患OC的女性的血浆测试前
11种MDM(GPRIN1、CDO1、SRC、SIM2、AGRN、FAIM2、CELF2、DSCR6、GYPC、CAPN2、BCAT1)；交叉验证的11‑MDM小组高度区分OC与对照组(95％特异性；79％灵敏度和AUC 0.91(0.86‑0.96))。
在HGS中，该小组正确鉴定了83％，包括5/6I/II期，以及大多数其它亚型(表9)。

[0657] 全甲基化组测序、严格的过滤标准和生物学验证得出针对OC的出色候选MDM，在血浆中表现出有前景的高灵敏度和特异性。

[0658] 表9.

[0659]

[0660] 使用来自OC患者的66个血浆样品(例如，6个I期OC、3个II期OC、27个III期OC、12个IV期OC、18个ND)另外测试了以下标志物MDM，并与237个来自未患OC的患者的对照血浆进行了比较：ATP10A(例如，ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI、SIM2_A、AGRN_8794、BCAT1_6015、KCNA3_7518、KCNA3_7320、LOC10013136、GYPC_C、SRC(例如，SRC_A、SRC_B)、NR2F6、TSHZ3、CELF2(例如，CELF2_A、CELF2_B)、TACC2(例如，TACC2_A、TACC2_B)、VIPR2(例如，VIPR2_A、VIPR2_B)和SPOCK2_74333。表10示出了用于检测OC的每种标志物的灵敏度和特异性百分比。

[0661] 表10.

[0662]

[0663]

[0664] 随后的实验证明了通过检测以下组合来鉴定OC的临床可行性：1)与正常非癌性水平相比，癌抗原125(CA‑125)水平增加，和2)与正常非癌性甲基化水平相比，以下标志物的测量的甲基化水平变化：ATP10A(例如，ATP10A_A、ATP10A_B、ATP10A_C、ATP10A_D、ATP10A_E)、EPS8L2(例如，EPS8L2_A、EPS8L2_B、EPS8L2_C、EPS8L2_D)、C1QL3(例如，C1QL3_A、C1QL3_B)、FAIM2(例如，FAIM2_A、FAIM2_B)、CAPN2_B、LBH、CMTM3(例如，CMTM3_A、CMTM3_B)、ZMIZ1(例如，ZMIZ1_A、ZMIZ1_B、ZMIZ1_C、ZMIZ1_D)、GPRIN1(例如，GPRIN1_A、GPRIN1_B)、CDO1(例如，CDO1_A、CDO1_B)、GP5、DSCR6、SKI和SIM2_A。

[0665] 使用来自OC患者的66个血浆样品(例如，6个I期OC、3个II期OC、27个III期OC、12个IV期OC、18个ND)测试了这类标志物MDM，并与237个来自未患OC的患者的对照血浆进行了比较。还在66个血浆样品和237个对照血浆样品中测量了CA‑125的水平。表11示出了MDM检测OC的90％特异性。表12示出了CA‑125检测OC的90％特异性。表13示出了MDM和CA‑125检测OC的90％特异性。

[0666] 表11.制表

[0667]

[0668] 表12.制表

[0669]

[0670]

[0671] 表13.制表

[0672]

[0673] 以引用的方式并入

[0674] 本文中所提及的每一个专利文献和科技文章的全部公开内容都出于全部目的以引用的方式并入。

[0675] 等效方案

[0676] 在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明能以其它具体形式来实施。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为说明性的，而非是对本文中描述的本发明的限
制。因此，本发明的范围是由随附权利要求书而非由上述描述所指示，并且属于权利要求书的等效含义和范围内的所有变化都意图包括在其中。