前列腺素的制造方法 技术领域： [0001] 本发明涉及制造前列腺素的方法。 背景技术 [0002] 目前，作为前列腺素(PG)的制造方法，已知使不饱和脂肪酸与环氧化酶(COX)反应(氧化反应)而生成PGG2和/或PGH2、再使还原剂SnCl2与PGG2和/或PGH2反应(还原反应)而生成前列腺素的两步法(例如，专利文献1和非专利文献2)。 [0003] 现有技术文献 [0004] 专利文献 [0005] 专利文献1：日本特开平6‑90788号公报 [0006] 非专利文献 [0007] 非专利文献1：Applied Microbiol Biotechnol,Vol.91(2011)1121‑1129发明内容 [0008] 发明所要解决的问题 [0009] 通过现有方法得到的前列腺素的收率并不高。因此，本发明的目的在于以高收率制造前列腺素。 [0010] 用于解决问题的方法 [0011] 本发明的前列腺素的制造方法具备在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤。还原剂可以为选自由含有二价Sn的还原剂、Na2SO3、Na2S2O3、Na2S2O4和KI组成的组中的1种以上还原剂，可以为选自由含有二价Sn的还原剂和KI组成的组中的1种以上还原剂，可以为选自由SnCl2、SnSO4、Sn2P2O7和SnC2O4组成的组中的1种以上还原剂。或者，还原剂可以为选自由Na2SO3、Na2S2O3和Na2S2O4组成的组中的1种以上还原剂。不饱和脂肪酸可以为碳链数16以上且具有1个以上双键的不饱和脂肪酸，可以为选自由花生四烯酸、二高‑γ‑亚麻酸和全顺式‑5,8,11,14,17‑二十碳五烯酸组成的组中的1种以上不饱和脂肪酸。在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤可以在6～12.5的pH下进行。在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤可以包括向环氧化酶与还原剂的混合物中添加不饱和脂肪酸的步骤，环氧化酶与还原剂的混合物可以通过向环氧化酶中添加还原剂而得到。环氧化酶可以来源于红藻或哺乳类。红藻可以为江蓠，哺乳类可以为人、绵羊或牛。在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤可以包括在还原剂存在下使不饱和脂肪酸与表达环氧化酶的细胞或其提取物、或者单离出的环氧化酶接触的步骤。 [0012] 发明效果 [0013] 根据在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的本发明的方法，能够以高收率制造前列腺素。在还原剂存在下进行氧化反应时氧化反应或还原反应中的任一者不会进行、目标产物的收率下降是目前的技术常识，因此，根据本发明的方法能够以高收率制造前列腺素是出人预料的。 具体实施方式 [0014] 本发明的前列腺素的制造方法具备在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤。 [0015] 不饱和脂肪酸可以是单一的不饱和脂肪酸，也可以是2种以上不饱和脂肪酸的组合。不饱和脂肪酸可以是碳原子数16以上或18以上且具有1个以上双键的不饱和脂肪酸。作为不饱和脂肪酸，可以使用例如花生四烯酸(ARA)、二高‑γ‑亚麻酸(DGLA)、全顺式‑5,8, 11,14,17‑二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、全顺式‑8, 11,14,17‑二十碳四烯酸(ETA)等以往用于制造前列腺素的不饱和脂肪酸。由ARA可得到PGF2α或PGE2，由DGLA可得到PGF1α或PGE1，由EPA可得到PGF3α或PGE3。从促进反应的观点出发，可以与不饱和脂肪酸一起加入饱和脂肪酸。即，使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤可以在还原剂和饱和脂肪酸存在下进行。 [0016] 还原剂没有特别限定，可以使用公知的还原剂。还原剂可以为单一的还原剂，也可以为2种以上还原剂的组合。还原剂例如可以为含有二价Sn的还原剂、Na2SO3、Na2S2O3、Na2S2O4、KI、NaHSO3或K2S2O3、或者它们的组合。含有二价Sn的还原剂例如可以为SnCl2、SnSO4、Sn2P2O7、SnC2O4或SnO、或者它们的组合。从选择性且以高收率得到PGF2α、PGF1α、PGF3α等PGF的观点出发，还原剂优选为含有二价Sn的还原剂或KI，更优选为含有二价Sn的还原剂，进一步优选为SnCl2、SnSO4、Sn2P2O7或SnC2O4，特别优选为SnCl2。从选择性且以高收率得到PGE2、PGE1、PGE3等PGE的观点出发，还原剂优选为Na2SO3、Na2S2O3或Na2S2O4。 [0017] 环氧化酶可以为单一的环氧化酶，也可以为2种以上环氧化酶的组合。环氧化酶(COX)的来源没有特别限定，环氧化酶例如可以为来源于微生物、植物或动物的环氧化酶。 动物例如可以为哺乳类。哺乳类例如可以为人、绵羊或牛。植物例如可以为红藻。红藻例如可以为江蓠。在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤可以包括在还原剂存在下使不饱和脂肪酸与表达环氧化酶的细胞或其提取物、或者单离出的环氧化酶接触的步骤。通过使表达环氧化酶的细胞或其提取物与不饱和脂肪酸接触，该细胞或提取物中的环氧化酶与不饱和脂肪酸反应。表达环氧化酶的细胞可以是表达内源性或外源性环氧化酶的细胞。表达外源性环氧化酶的细胞只要是能够表达COX的宿主就没有特别限定，例如可以为表达江蓠来源的环氧化酶(GvCOX)的大肠杆菌。表达内源性环氧化酶的细胞例如可以为江蓠的细胞。或者，在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤可以包括在还原剂存在下使不饱和脂肪酸与含有表达环氧化酶的细胞的植物或其提取物、更具体而言与江蓠或其提取物接触的步骤。 [0018] 含有不饱和脂肪酸、还原剂和环氧化酶的反应液中的不饱和脂肪酸的初始浓度例如可以为0.0001～400g/L、0.01～100g/L或0.1～10g/L。本说明书中，初始浓度是指反应刚开始后的浓度。 [0019] 含有不饱和脂肪酸、还原剂和环氧化酶的反应液中的还原剂的初始浓度例如可以为0.0001～800mM、0.1～400mM或1～200mM。 [0020] 含有不饱和脂肪酸、还原剂和环氧化酶的反应液中的环氧化酶的初始浓度例如可以为0.1mg/L～100g/L、1mg/L～10g/L或10mg/L～1g/L。 [0021] 在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤中，反应可以在水或水溶液中进行。作为水溶液，可以使用例如乙酸缓冲液(pH4～5)、磷酸钾缓冲液(KPB、pH6～7)、Tris‑Cl缓冲液(pH8～10)、硼酸缓冲液(pH11～13)、磷酸钠缓冲液(NaP、pH6～7)、甲酸缓冲液(pH3～4)、氨缓冲液(pH9～10)等缓冲液。如果能够稳定地维持pH，也可以不使用缓冲液，水溶液例如可以为盐水。 [0022] 反应液的pH(即，反应时的pH)可以为6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上或12以上，可以为12.5以下、12以下、11以下、10以下、9以下、8以下或7以下。反应液的pH优选为6～12.5，更优选为7～12或7～12.5，进一步优选为8～12或8～12.5，特别优选为9～ 12。 [0023] 反应液的温度(即，反应温度)只要是不使环氧化酶失活的温度则没有特别限定，例如可以为‑10～90℃、5～70℃或20～40℃。 [0024] 反应时间也取决于酶反应的反应速度，例如可以为30秒～98小时、10分钟～24小时或30分钟～4小时。 [0025] 在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤中，不饱和脂肪酸、还原剂和环氧化酶的添加顺序例如可以如下： [0026] 可以向环氧化酶、更具体而言含有环氧化酶的反应容器中以任意顺序添加不饱和脂肪酸和还原剂； [0027] 可以向还原剂、更具体而言含有还原剂的反应容器中以任意顺序添加不饱和脂肪酸和环氧化酶； [0028] 可以向不饱和脂肪酸、更具体而言含有不饱和脂肪酸的反应容器中依次添加环氧化酶和还原剂。其中，在向不饱和脂肪酸与环氧化酶的混合液中添加还原剂的情况下，从以高收率制造前列腺素的观点出发，优选在将不饱和脂肪酸和环氧化酶混合后立即(例如将不饱和脂肪酸和环氧化酶混合后5秒以内)添加还原剂。另外，从选择性地得到PGF或PGE的观点出发，优选向环氧化酶与还原剂的混合物中添加不饱和脂肪酸，更优选向环氧化酶、更具体而言含有环氧化酶的反应容器中依次添加还原剂和不饱和脂肪酸。反应容器没有特别限定，可以使用微管、离心管、烧瓶、烧杯、不锈钢罐等现有公知的反应容器。 [0029] 一个实施方式的本发明的前列腺素的制造方法中，在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的步骤之后，可以进一步包括从反应液中分离环氧化酶的步骤，和/或，可以进一步包括从反应液中提取前列腺素的步骤和对提取出的前列腺素进行纯化的步骤。 分离环氧化酶的方法没有特别限定，可以利用公知的方法。提取和纯化前列腺素的方法没有特别限定，可以利用公知的方法。例如，前列腺素可以用乙酸乙酯等有机溶剂提取后利用柱色谱法进行纯化。 [0030] 实施例 [0031] [试验例1‑1] [0032] 使用E.coli BL21(DE3)/pGVCOX1如下制造和分析前列腺素。 [0033] (1)基因表达菌体的制作 [0034] 将优化为大肠杆菌的密码子后的GvCOX基因插入大肠杆菌表达载体pET‑28a(ノバジェン公司)的NcoI‑BamHI位点，构建质粒pGVCOX1。优化后的GvCOX基因例如在 Biotechnol.Lett.36(2014)2193‑2198中有记载。关于基本的基因重组技术，依照“Molecular cloning(1989)：a laboratory manual.2nd ed.New York,NY:Cold Spring Laboratory.”。质粒的构建中使用的限制酶、修饰酶等试剂购自东洋纺株式会社，按照说明书使用。ECOS(注册商标)感受态E.coli BL21(DE3)购自富士胶片和光纯药株式会社，按照说明书将pGVCOX1导入E.coli BL21(DE3)而制作E.coli BL21(DE3)/pGVCOX1。 [0035] 将E.coli BL21(DE3)/pGVCOX1接种到含有50mg/L卡那霉素的5mL的LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠)中，在28℃下振荡培养24小时。将2.5mL培养液接种到含有50mg/L卡那霉素和0.1mM异丙基‑β‑硫代半乳糖苷(IPTG、ナカライテスク株式会社)的LB培养基100mL中，在20℃下振荡培养24小时。对2.5mL培养液进行离心分离，除去上清，得到GvCOX基因表达菌体。 [0036] (2)前列腺素的制造(实施例) [0037] 将悬浮于缓冲液中的GvCOX基因表达菌体、悬浮于水中的还原剂、以及不饱和脂肪酸依次添加到微管中并进行搅拌，得到由GvCOX基因表达菌体、还原剂、1g/L不饱和脂肪酸和50mM缓冲液构成的0.5mL混合液。作为缓冲液，使用Tris‑Cl(pH8.0)。作为还原剂，使用 5mM的SnCl2、5mM的SnSO4、20mM的Sn2P2O7、20mM的SnC2O4、5mM的Na2SO3、5mM的Na2S2O3、5mM的Na2S2O4或5mM的KI。作为不饱和脂肪酸(底物)，使用花生四烯酸(西格玛奥德里奇公司)、DGLA(东京化成工业株式会社)或EPA(东京化成工业株式会社)。上述浓度为混合液中的终浓度。使混合液在20℃下振荡反应60分钟。另外，为了比较，在不添加还原剂的情况下进行了同样的反应(参考例)。反应结束后，向反应液中加入1N的HCl而将pH调节为3.0。 [0038] (3)前列腺素的制造(比较例) [0039] 将悬浮于缓冲液中的GvCOX基因表达菌体、以及不饱和脂肪酸依次加入到微管中，得到由GvCOX基因表达菌体、1g/L不饱和脂肪酸和50mM缓冲液构成的0.5mL混合液。使混合液在20℃下振荡反应60分钟。反应结束后，向反应液中添加1N的HCl而使pH为3.0，再加入还原剂。作为缓冲液、还原剂和不饱和脂肪酸，使用与(2)中所用的缓冲液、还原剂和不饱和脂肪酸相同的物质。 [0040] (4)前列腺素的分析 [0041] 使用乙酸乙酯从(2)或(3)的反应液中提取反应产物。使用带有隔膜真空泵的旋转蒸发器从提取液中除去有机溶剂。将得到的析出物用乙醇溶解，在以下条件下利用LC‑MS进行分析(参考：Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,Volume 83(2019)774‑780,DOI:10.1080/09168451.2018.1562880)。 [0042] ＜LC‑MS分析条件＞ [0043] 使用设备：LC‑MS2020(株式会社岛津制作所制) [0044] 柱：5C18‑AR‑II COSMOSIL(R)packed column，4.6mm i.d.x150mm(ナカライテスク株式会社制) [0045] 柱温：40℃ [0046] 洗脱液A：0.1％(v/v)甲酸水溶液 [0047] 洗脱液B：0.1％(v/v)甲酸/乙腈 [0048] 梯度洗脱(洗脱液B浓度)：20％～40％(10分钟)、40％～100％(10分钟)、100％(25分钟) [0049] 流速：0.2mL/分钟 [0050] 模式：负离子模式 [0051] 加热块温度：200℃ [0052] 脱溶剂线温度：250℃ [0053] 雾化器气体流速：1.5L/分钟 [0054] 将结果示于表1。本说明书中，PGF/PGE表示PGF相对于PGE的质量比，PGE/PGF表示PGE相对于PGF的质量比。使用ARA、DGLA和EPA作为不饱和脂肪酸的情况下，分别得到了PGF2α和PGE2、PGF1α和PGE1、以及PGF3α和PGE3。 [0055] [表1] [0056] [0057] (5)对照实验 [0058] 将pET‑28a导入E.coli BL21(DE3)，得到E.coli BL21(DE3)/pET‑28a。使用E.coli BL21(DE3)/pET‑28a代替GvCOX基因表达菌体进行(2)～(4)的实验，结果未检测到前列腺素。 [0059] [试验例1‑2] [0060] 使用E.coli BL21(DE3)/pGVCOX1的提取液，如下制造和分析前列腺素。 [0061] (1)GvCOX提取液的制备 [0062] 将通过试验例1‑1中记载的方法制作的E.coli BL21(DE3)/pGVCOX1接种到含有 50mg/L卡那霉素的5mL的LB培养基中，在28℃下振荡培养24小时。将2.5mL培养液接种到含有50mg/L卡那霉素和0.1mM的IPTG的LB培养基100mL中，在20℃下振荡培养24小时。对培养液进行离心分离，除去上清。将得到的菌体悬浮于10mL的50mM Tris‑Cl(pH8.0)中，使用超声波均质机US‑300(株式会社日本精机制作所制)进行破碎，得到GvCOX基因表达菌体的提取液(GvCOX提取液)。 [0063] (2)前列腺素的制造和分析(实施例和比较例) [0064] 使用0.25mL的GvCOX提取液代替GvCOX基因表达菌体，除此以外与试验例1‑1的(2)～(4)同样地制造和分析前列腺素。作为缓冲液，使用与试验例1‑1相同的缓冲液。作为还原剂，使用终浓度为5mM的SnCl2、SnSO4或Na2SO3。作为不饱和脂肪酸，使用花生四烯酸。将结果示于表2。 [0065] [表2] [0066] [0067] (3)对照实验 [0068] 使用E.coli BL21(DE3)/pET‑28a代替GvCOX提取液进行(2)的实验，结果未检测到前列腺素。 [0069] [试验例1‑3] [0070] 使用绵羊来源的COX‑1如下制造和分析前列腺素。 [0071] (1)前列腺素的制造(实施例) [0072] 将绵羊来源的COX‑1(フナコシ株式会社)、悬浮于水中的还原剂、以及不饱和脂肪酸依次添加到微管中并进行搅拌，得到由5μg绵羊来源的COX‑1、还原剂、不饱和脂肪酸和 50mM缓冲液构成的0.5mL混合液。作为缓冲液，使用Tris‑Cl(pH8.0)。作为还原剂，使用 0.1mM的SnCl2、5mM的Na2SO3、5mM的Na2S2O3或5mM的Na2S2O4。作为不饱和脂肪酸，使用0.1g/L的ARA、0.1g/L的DGLA或0.1g/L的EPA。上述浓度为混合液中的终浓度。使混合液在37℃下反应60分钟。另外，为了比较，在不添加还原剂的情况下进行了同样的反应(参考例)。反应结束后，向反应液中添加1N的HCl而将pH调节为3.0。 [0073] (2)前列腺素的制造(比较例) [0074] 将绵羊来源的COX‑1(フナコシ株式会社)和不饱和脂肪酸依次加入到微管中并进行搅拌，得到由5μg绵羊来源的COX‑1、不饱和脂肪酸和50mM缓冲液构成的0.5mL混合液。使混合液在37℃下反应60分钟。反应结束后，向反应液中添加1N的HCl而将pH调节为3.0，再加入还原剂。作为缓冲液、还原剂和不饱和脂肪酸，使用与(1)中所用的缓冲液、还原剂和不饱和脂肪酸相同的物质。 [0075] (3)前列腺素的分析 [0076] 与试验例1‑1的(4)同样地对(1)和(2)的反应液中的前列腺素进行分析。将结果示于表3。 [0077] [表3] [0078] [0079] (4)对照实验 [0080] 在不使用COX‑1的情况下进行(1)～(3)的实验，结果未检测到前列腺素。 [0081] [试验例1‑4] [0082] 如下使用人来源的COX‑1制造和分析前列腺素。 [0083] (1)前列腺素的制造和分析(实施例和比较例) [0084] 使用人PTGS1/COX‑1(フナコシ株式会社)代替绵羊来源的COX‑1、并且改变还原剂的种类，除此以外与试验例1‑3同样地制造和分析前列腺素。具体而言，使用Tris‑Cl(pH8.0)作为缓冲液，使用0.1mM的SnCl2或0.1mM的SnSO4作为还原剂，使用花生四烯酸作为不饱和脂肪酸。将结果示于表4。 [0085] [表4] [0086] [0087] (2)对照实验 [0088] 在不使用人PTGS1/COX‑1的情况下进行(1)的实验，结果未检测到前列腺素。 [0089] [试验例1‑结果] [0090] 在还原剂存在下使环氧化酶与不饱和脂肪酸反应的实施例中，能够以高收率得到前列腺素。另外，使用含有二价Sn的还原剂或KI作为还原剂的情况下，能够选择性地得到PGF(PGF2α、PGF1α或PGF3α)。另一方面，使用Na2SO3、Na2S2O3或Na2S2O4作为还原剂的情况下，能够选择性地得到PGE(PGE2、PGE1或PGE3)。 [0091] [试验例2] [0092] 作为缓冲液，使用终浓度为100mM的乙酸缓冲液(pH为4.0或5.0)、KPB(pH为6.0或 7.0)、Tris‑Cl缓冲液(pH为8.0、9.0或10.0)或硼酸缓冲液(pH为11.0、12.0、12.5或13.0)，并且改变还原剂的终浓度，除此以外与试验例1‑1的(2)和(4)同样地制造和分析前列腺素。 具体而言，使用5mM的SnCl2、5mM的SnSO4、25mM的Sn2P2SO7或25mM的SnC2O4作为还原剂，使用花生四烯酸作为不饱和脂肪酸。上述浓度为混合液中的终浓度。将结果示于表5。 [0093] [表5] [0094] [0095] [试验例2‑结果] [0096] 通过在特定的pH范围内进行反应，能够以更高的收率得到前列腺素。 [0097] [试验例3‑1](实施例) [0098] 改变缓冲液和还原剂的终浓度，除此以外与试验例1‑1的(2)和(4)同样地制造和分析前列腺素。具体而言，使用100mM的Tris‑Cl(pH8.0)作为缓冲液，使用10mM的SnCl2、 10mM的SnSO4、25mM的Sn2P2O7或25mM的SnC2O4作为还原剂，使用1g/L花生四烯酸作为不饱和脂肪酸。上述浓度为混合液中的终浓度。 [0099] [试验例3‑2](实施例) [0100] 如下改变混合液的组成和制备方法，除此以外与试验例3‑1同样地制造和分析前列腺素：将缓冲液、悬浮于水中的还原剂、花生四烯酸和悬浮于缓冲液中的GvCOX基因表达菌体依次加入到微管中并进行搅拌，得到由GvCOX基因表达菌体、25mM还原剂、2.5g/L花生四烯酸和100mM的Tris‑Cl(pH8.0)构成的0.5mL混合液。 [0101] [试验例3‑3](比较例) [0102] 改变缓冲液和还原剂的终浓度，除此以外与试验例1‑1的(3)和(4)同样地制造和分析前列腺素。具体而言，使用100mM的Tris‑Cl(pH8.0)作为缓冲液，使用10mM的SnCl2、 10mM的SnSO4、25mM的Sn2P2O7或25mM的SnC2O4作为还原剂，使用1g/L花生四烯酸作为不饱和脂肪酸。上述浓度为混合液中的终浓度。 [0103] [试验例3‑结果] [0104] 将试验例3‑1～3‑3的结果示于表6。 [0105] [表6] [0106] [0107] 与依次添加还原剂、花生四烯酸和GvCOX基因表达菌体的情况相比，依次添加GvCOX基因表达菌体、还原剂和花生四烯酸的情况能够进一步选择性地得到PGF2α。