技术领域
[0001] 本发明涉及植入材料的实验领域，尤其是涉及一种体外降解实验的实验方法及实验装置。
相关背景技术
[0002] 在医用可降解材料应用于人体前，应先通过动物实验的安全验证，在进行动物实验验证前需要在体外先进行安全验证。除常规体外生物相容性实验外，与传统医用材料相比生物可降解医用材料及产品需要在体外确定材料及产品的降解形貌及降解速率，以期对材料及产品植入体内的降解提供理论依据及指导。
[0003] 目前生物可降解材料的体外降解研究主要将材料或产品直接浸泡在模拟体液或培养基中观察降解形貌及计算降解速率。这种方法的降解产物及降解生成的气体均会分散，气体直接溢出试验液体，不会在样品周围小范围聚集，特别是在医用镁合金材料的体外降解实验中会产生大量的降解气体、分子及离子，降解产物的分散对模拟体内降解影响很大。另一方面，模拟体液或培养基的成分与植入体内有很大不同，因此目前的试验方法获得的体外数据与体内结果有很大差异。
具体实施方式
[0022] 以下配合图式及本发明的较佳实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。
[0023] 如图1所示，本发明提出了一种体外降解实验装置，该装置包括：降解容器1、降解液2、包埋凝胶3、包埋模具(图中未示出)。其中降解容器1中盛装有降解液2，包埋凝胶3悬浮于降解液2中。如图1所示包埋凝胶3内部包埋有需要进行体外降解的试样4。包埋模具用于制作包埋有试样4的包埋凝胶3。
[0024] 降解容器1可以包括离心管、烧杯、烧瓶等，本发明对于降解容器1的材料及形状没有限制，只要其可以用来盛放降解液2即可。
[0025] 降解液2可以包括模拟体液、模拟体液与有机分子的混合液、培养基或培养基与有机分子的混合液等。
[0026] 其中，模拟体液包括Hanks’、PBS、SBF、m‑SBF、EBSS、人工唾液、人工血浆，以及通过输入CO2的方式调节降解液pH等任何可用于体外降解的溶液，模拟体液可对降解液2的pH值起到缓冲作用。
[0027] 培养基包括MEM、DMEM、BME、IMDM等可用于体外降解的培养基；有机分子包括生物体所需的任何有机小分子和有机大分子，其中有机小分子包括维生素、氨基酸、葡萄糖等，有机大分子包括蛋白质、多糖、核酸、蛋白聚糖等。
[0028] 具体的，模拟血液环境时降解液2中血清蛋白的浓度为：38～40g/mL；葡萄糖的浓度为：6.5～11mg/mL。模拟皮下植入时降解液2中葡萄糖的浓度为：29.5～34mg/mL。模拟肌内植入时降解液2中肌原纤维蛋白浓度为：200～300mg/mL。模拟骨植入时降解液2中胶原蛋白浓度为：110～147mg/mL。
[0029] 包埋凝胶3的大小可根据试样4的大小来进行改变。包埋凝胶3的形状可制作成圆柱形、正方体、长方体、椎体、类似骨结构等形状及可用于体外降解的任何外形；包埋凝胶3还可与类骨结构相结合，类骨结构包括HA、TCP、βTCP、高分子支架以及多种成分的复合材料等，以烧结、化学反应、3D打印等方法制成的类骨结构；包埋凝胶3为透明或半透明状态，其颜色没有限定。
[0030] 如图1所示，位于试样4周围的包埋凝胶3的厚度为包埋厚度34，在本发明中包埋厚度34可根据对应体内植入位置的不同而改变，对此本发明没有限制。通常情况下包埋厚度34的取值范围为1mm～20mm。
[0031] 本发明对包埋模具的形状没有限定，包埋模具的材质可以为硅胶、橡胶或聚乙烯等材料。在包埋模具内部，位于包埋模具高度的二分之一处刻画有标线，在进行包埋试样时将试样4置于包埋模具的标线处，借此确保试样4位于包埋凝胶3的中心位置。
[0032] 优选地，本发明中的体外降解实验装置还包括内环境模拟设备(图中未示出)，内环境模拟设备可为降解容器1中的降解液提供恒定的温度以及必要可控的循环流动。内环境模拟设备可以包括水浴箱和循环泵：通过将降解容器1放入水浴箱中以提供恒定的环境温度；通过安装在降解容器1上的循环泵，使降解液流动，但不以此为限。
[0033] 如图2所示，本发明还涉及到的一种利用本发明的体外降解实验装置进行体外降解实验的实验方法，包括以下步骤：
[0034] S1加工试样4：试样4可被加工成所需要的形状，如圆片、圆柱等，试样的形状不受限制。
[0035] S2融化凝胶：将凝胶主要成分加入到凝胶溶解液中，加热搅拌融化成流体凝胶。
[0036] S3包埋试样，包括以下两种方式：
[0037] (1)将一部分流体凝胶先灌注至包埋模具中，直到放入试样4后，试样不下沉时再放入试样，接着继续向包埋模具中灌注另一部分流体凝胶直至包埋模具装满，经固化、脱模后形成包埋凝胶3。
[0038] (2)将流体凝胶灌注至包埋模具中，直到模具装满，再将试样4加入到流体凝胶中，除去溢出的流体凝胶，经固化、脱模后形成包埋凝胶3。
[0039] 以上两种方式优选方式(1)，借此减少流体凝胶的浪费。
[0040] S4降解：将包埋有试样4的包埋凝胶3放入盛有降解液2的降解容器1中，再将降解容器1放入水浴箱中保持温度为37±1℃浸泡一段时间，定期观察记录降解过程。浸泡方式可以包括静态浸泡、半静态浸泡及动态浸泡。静态浸泡需保持降解液2静止，且不更换降解液2；半静态浸泡需保持降解液2流动，但不更换降解液2，可利用循环泵使降解液流动，但不以此为限；动态浸泡需保持降解液2流动，并定期更换降解液2。
[0041] S5测算：降解完成后将包埋凝胶3中的试样4取出，观察并测算所需参数。其中可用失重法计算试样降解速率。
[0042] 在S2融化凝胶的过程中，凝胶主要成分包括琼脂、魔芋粉、明胶等。S2、S3制成的包埋凝胶3包括医用水凝胶、琼脂凝胶、魔芋胶、明胶等可用于包埋材料或产品的凝胶。在制作时，凝胶主要成分与降解液2的质量比范围为1:4～25。为了更好的模拟内环境，优选地，琼脂凝胶制作比例为琼脂:降解液2质量比＝1:9～17；魔芋胶的制作比例为魔芋粉:降解液2质量比＝1:5～15；明胶的制作比例为明胶:降解液2质量比＝1:8～20；琼脂明胶复合凝胶的制作比例为琼脂:明胶:降解液2的质量比＝1:0.2～1.5:10～30。
[0043] 在S2融化凝胶的过程中，凝胶溶解液可采用溶解液与添加剂混合后制成。其中，溶解液包括降解液2、蒸馏水或其它可溶解凝胶的溶液；添加剂为不同于凝胶主要成分的其它凝胶或交联剂等。
[0044] 利用本发明的实验装置及实验方法进行体外降解实验有如下优势：
[0045] (1)在本发明的体外降解实验中，将试样4包埋进透水的包埋凝胶3中，并在降解液2中添加人体内包含的有机分子，借此模拟体内降解时不同组织的细胞外液的复杂构成及不同组织的包裹结构，使试样4的降解环境与体内相似。
[0046] (2)本发明的体外降解实验可有效模拟试样4植入人体后因降解产生的气体包裹状态，特别是当试样4为镁合金材料时，包埋凝胶3会将镁合金材料降解时产生的气体、分子及离子包裹在试样4的周围，从而使该体外降解实验后的试样4的表面更加接近于体内降解的状态。同时本发明的体外降解实验的降解速率也与体内降解的降解速率更为接近。
[0047] 以下通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案及效果。
[0048] 实施例一：
[0049] 在本实施例中，体外降解实验的实验方法如下：
[0050] S1加工试样4A：取医用镁合金生物可降解材料为试样4A，将试样4A加工成Φ8×3mm的圆片。
[0051] S2融化凝胶：将琼脂加入无菌水中，搅拌均匀，加热至80℃以上制成流体凝胶。
[0052] S3包埋试样：将流体凝胶倒入直径16mm高11mm的圆柱形硅胶包埋模具中，流体凝胶在样品周围厚度即包埋厚度为8mm，先将流体凝胶倒至容器一半位置，试样4A放置凝胶上不下沉时将试样4A放入，继续倒入流体凝胶直至包埋模具全满。经固化脱模后形成包埋有试样4A的包埋凝胶3。
[0053] S4降解：将包埋凝胶3放入盛有降解液2的降解容器1中，在本实施例中降解液2为m‑SBF模拟体液。再将降解容器放入37±1℃水浴箱中，每7天更换一次液体，浸泡14天。定期观察试样4A的状态。
[0054] S5测算：降解完成后将试样4A从包埋凝胶3中取出，对试样4A的表面进行观察，并利用失重法计算降解速率。
[0055] 实验结果：如图3A所示，试样4A在降解时产生了气体并形成了小气泡，由于试样4A被包埋凝胶3所包埋，致使小气泡无法分散，聚集在试样4A的周围；随着降解实验的继续，在包埋凝胶3内，试样4A周围聚集的小气泡越来越多，逐渐形成较大的气泡并将试样4A包裹。本实验中的降解速率为0.52±0.031mm/a。
[0056] 另一方面，取与试样4A相同的两个试样分别为试样5(图中未示出)和试样6(图中未示出)。
[0057] 将试样5直接放入与实施例一相同的装有以m‑SBF模拟体液为降解液2的降解容器1中，同时保持37±1℃水浴箱中，每7天更换一次液体，浸泡14天，计算降解速率，其中试样5的外层未包覆有包埋凝胶3。
[0058] 试样6则被直接植入肌肉内一个月，计算降解速率。
[0059] 结果发现试样4A的降解速率与试样6的降解速率接近，并远小于试样5的降解速率，详见表1。
[0060] 表1：不同降解方法获得的试样降解速率
[0061]降解方法 试样4A 试样5 试样6
降解速率(mm/a) 0.52±0.031 2.077±0.042 0.25±0.071
[0062] 实施例二：
[0063] 本实施例的实验方法与实验装置与实施例一大致相同，区别在于：
[0064] A降解液2选取Hanks’溶液。
[0065] B试样4B为镁合金材料，且被加工成了Φ2.5×10mm的圆柱形。
[0066] C在S2融化凝胶阶段，将魔芋粉加入Hanks’溶液中，搅拌均匀，加热至80℃。
[0067] D包埋模具选用直径为12.5mm，高20mm的硅胶模具。包埋厚度为10mm
[0068] E在S4降解阶段，每两天更换一次降解液2。
[0069] 实验结果：图3B所示，实施例二中的试样4B在降解时产生了气体并形成了小气泡，由于试样4B被包埋凝胶3包埋，致使小气泡无法分散聚集在试样4B的周围；随着降解实验的继续，在包埋凝胶3内的试样4B周围聚集的小气泡越来越多，逐渐形成了较大的气泡并将试样4B包裹。
[0070] 在此设立对照实验：如图3C所示，取与实施例二中的试样4B相同的试样4C，将未包覆包埋凝胶3的试样4C直接放入降解液2中，其余的实验方法均与实施例二相同，并观察降解状态。在对照实验中，降解初期未包覆有包埋凝胶3的试样4C产生的气体并未聚集在试样4C的周围，随着对照实验的持续，一直未观察到有气泡聚集在试样4C的周围。
[0071] 由此可见，对比本案实施例二中被包埋凝胶3包覆的试样4B产生的气体可有效的被包埋凝胶3聚集在该试样4B的周围，使得实施例二的体外降解实验更接近于体内降解的状态。另一方面，经测算，实施例二的平均体外降解速率为0.30±0.018mm/a，与体内结果无显著差异。
[0072] 实施例三：
[0073] 本实施例的实验方法与实验装置与实施例一大致相同，区别在于：
[0074] A降解液2选用SBF+10％FBS模拟体液。
[0075] B试样4D(图中未示出)被加工成了Φ10×10mm圆柱。
[0076] C包埋模具为直径20mm高20mm的硅胶模具，包埋厚度为10mm。
[0077] D浸泡方式与实施例二相同。
[0078] 实验结果：在体外降解实验过程中试样4D的表面变化与实施例二相似。降解完成后取出试样4D后计算平均降解速率为0.21±0.047mm/a，与体内降解结果无显著差异。
[0079] 以上仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，因此,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
