[0001] 本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种实时动态观察ACE2和新型冠状病毒RBD相互作用的方法。

[0002] COVID-19是目前已发现的第七种能够引起人类疾病的冠状病毒，其他冠状病毒，如hCoV-NL63，hCoV-229E，HCoV-OC43,HKU1，只能引起普通感冒的症状，并且很容易治愈。然而，严重急性呼吸综合征(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS-CoV)也引起了一定的流行性并且死亡率较高。2002-2003年流行的SARS-CoV引起了世界范围内超过8000个感染病例，约800例死亡。 MERS-CoV发现于2012年，截止到2019年，共发现2000多病例和800多例死亡，并且不断有新的病例被发现。相比之下，COVID-19的传播速度最快，短短 9个月已经有千万人被感染。对新冠病毒侵染机理的理解是研发疫苗与特效药物的关键。

[0003] 冠状病毒是由核壳蛋白包裹单链RNA组成，COVID-19感染细胞的机制与 SARS-CoV相似，都是通过病毒表面的刺突S蛋白与人细胞膜蛋白血管紧张素转化酶2(hACE2)结合，在蛋白酶的作用下，内吞进入细胞内，然后释放RNA 对机体造成感染。COVID-19的S蛋白与SARS-CoV的S蛋白有近80％的同源性，都是由S1和S2两个亚基组成，其中，S2亚基包含疏水单元，用于侵染细胞膜。而S1亚基包含一个受体结合部位RBD(receptor-binding domain)，用于识别宿主细胞的ACE2蛋白。研究显示hACE2与COVID-19的RBD-SD1蛋白的结合力是34.6nM，为与SARS-CoV的RBD-SD1蛋白(KD＝325.8nM)结合力的近10倍，这解释了COVID-19的感染性更强的原因。

[0004] 由于RBD与hACE2相互作用是病毒侵染细胞的关键，其相互作用活性中心部位是疫苗与药物开发的重要靶点，因此RBD与hACE2相互作用的研究具有重要意义，而荧光标记与检测技术因具有原位实时检测，灵敏度高的特色而被广泛的应用于研究蛋白-蛋白的相互作用。目前已报道应用荧光抗体来标记 RBD与hACE2蛋白，但是抗体的标记是基于固定的死细胞进行的，无法还原其相互作用的真实环境；而荧光蛋白的标记目前只局限于标记hACE2，并且能够使用的荧光种类单一。目前还没有用标签蛋白(SNAP、Halo、PYP、CLIP等) 专一融合标记hACE2和RBD蛋白来研究hACE2-RBD相互作用。

[0022] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

[0023] 实施例1

[0024] hACE2和标签蛋白融合表达载体的构建

[0025] 构建如图1所示的融合蛋白，用常规分子克隆方法先将hACE2的全长 cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后分别将SNAP，CLIP，Halo，PYP， TC标签蛋白的cDNA亚克隆到hACE2的N端信号肽(hACE2的第1-51个碱基为信号肽)之后，得到pCMV-SNAP-hACE2,pCMV-CLIP-hACE2, pCMV-Halo-hACE2,pCMV-PYP-hACE2,pCMV-TC-hACE2。

[0026] 实施例2

[0027] 活细胞内对hACE2的荧光标记

[0028] 将Hela细胞分别传于5个共聚焦成像皿，24小时后，按照说明书用 Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体pCMV-SNAP-hACE2, pCMV-CLIP-hACE2,pCMV-Halo-hACE2,pCMV-PYP-hACE2,pCMV-TC-hACE2 转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液， 37℃5％CO2培养箱中继续培养48小时。将SNAP-561、Halo-488、PYP-
488、 CLIP-488以及TC-488荧光染料分别溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为1μM。用该探针溶液孵育细胞30min，然后用DMEM洗2遍，加入1mLDMEM培养基。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图2所示。

[0029] 图2a为转染了pCMV-SNAP-hACE2质粒并且在561nm激发下的Hela细胞成像，图2b为转染了pCMV-Halo-hACE2质粒并且在488nm激发下的Hela细胞成像，图2c为转染了pCMV-CLIP-hACE2质粒并且在488nm激发下的Hela 细胞成像，图2d为转染了pCMV-PYP-hACE2质粒并且在488nm激发下的Hela 细胞成像，图2e为转染了pCMV-TC-hACE2质粒并且在488nm激发下的Hela 细胞成像，从图2中可见，染料均标记在细胞膜上，说明其标记的是在细胞膜上过表达的hACE2蛋白。

[0030] 实施例3

[0031] SNAP-RBD(308-553)融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化

[0032] 用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(308-553)-6HiscDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将SNAP标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的 N端，得到pCMV-SNAP-RBD-6His。

[0033] 用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-SNAP-RBD-6His，然后用Ni-NTA 柱子纯化蛋白，用含100mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为 50.7KDa的目的蛋白SNAP-RBD-6His约1mg。跑SDS-PAGE凝胶电泳，如图3 所示，第1道为SNAP-RBD-6His蛋白的纯化后表达条带，分子量介于标准蛋白 44.3kDa与66.4kDa之间。

[0034] 实施例4

[0035] CLIP-RBD(308-553)融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化

[0036] 用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(308-553)-6HiscDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将CLIP标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的 N端，得到pCMV-CLIP-RBD-6His。

[0037] 用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-CLIP-RBD-6His，然后用Ni-NTA 柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为 47.8kDa的目的蛋白CLIP-RBD(308-553)约1mg。跑SDS-PAGE凝胶电泳，如图3所示，第2道为CLIP-RBD(308-553)蛋白的纯化后表达条带，分子量介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间。

[0038] 实施例5

[0039] Halo-RBD(333-525)融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化

[0040] 用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(333-525)-6HiscDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的N 端，得到pCMV-Halo-RBD-6His。

[0041] 用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-Halo-RBD-6His，然后用Ni-NTA 柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为 56.1kDa的目的蛋白Halo-RBD(333-525)约1mg。跑SDS-PAGE凝胶电泳，如图3所示，第3道为Halo-RBD(333-525)蛋白的纯化后表达条带，分子量介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间。

[0042] 实施例6

[0043] RBD(319-541)-PYP融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化

[0044] 用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(319-541)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的PYP标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的C端，得到pCMV-RBD-PYP-6His。

[0045] 用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-RBD-PYP-6His，然后用Ni-NTA 柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为 42.4kDa的目的蛋白RBD(319-541)-PYP约0.5mg。跑SDS-PAGE凝胶电泳，如图3所示，第4道为RBD(319-541)-PYP蛋白的纯化后表达条带，分子量略低于标准蛋白44.3kDa。

[0046] 实施例7

[0047] RBD(333-525)-Halo融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化

[0048] 用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(333-525)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的C端，得到pCMV-RBD-Halo-6His。

[0049] 用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-RBD-Halo-6His，然后用Ni-NTA 柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为 57kDa的目的蛋白RBD(333-525)-Halo约0.5mg。

[0050] 实施例8

[0051] 荧光标记RBD(333-525)-Halo蛋白并纯化

[0052] RBD(333-525)-Halo蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成 1.1mg/mL的母液。Halo640荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取RBD (333-525)-Halo蛋白溶液20μL，加入Halo640荧光染料0.6μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应2小时得到RBD(333-525)-Halo-640dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的RBD(333-525)-Halo-640dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的RBD(333-525)-Halo-640dye蛋白浓度为0.17mg/mL，摩尔浓度约为3μM。

[0053] 取RBD(333-525)-Halo和RBD(333-525)-Halo-640dye少量，跑SDS-PAGE 电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图4所示。图4的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第3和4道分别为RBD (333-525)-Halo和RBD(333-525)-Halo-640dye。蛋白RBD(333-525)-Halo 的分子量约为57kDa，介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间，荧光标记后的 RBD(333-525)-Halo-640dye在紫外光激发下显示出红色的荧光。

[0054] 实施例9

[0055] RBD(319-541)-Halo融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化

[0056] 用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(319-541)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的C端，得到pCMV-RBD-Halo-6His。

[0057] 用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-RBD-Halo-6His，然后用Ni-NTA 柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为 59.6kDa的目的蛋白RBD(319-541)-Halo约0.5mg。

[0058] 实施例10

[0059] 荧光标记RBD(319-541)-Halo蛋白并纯化

[0060] RBD(319-541)-Halo蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成 0.55mg/mL的母液。Halo640荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取RBD (319-541)-Halo蛋白溶液20μL，加入Halo640荧光染料0.6μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应2小时得到RBD(319-541)-Halo-640dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的RBD(319-541)-Halo-640dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的RBD(319-541)-Halo-640dye蛋白浓度为0.18mg/mL，摩尔浓度约为3.1μM。

[0061] 取RBD(319-541)-Halo和RBD(319-541)-Halo-640dye少量，跑SDS-PAGE 电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图4所示。图4的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第1和2道分别为RBD (319-541)-Halo和RBD(319-541)-Halo-640dye。蛋白RBD(319-541)-Halo 的分子量约为59.6kDa，介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间，荧光标记后的RBD(319-541)-Halo-640dye在紫外光激发下显示出红色的荧光。

[0062] 实施例11

[0063] 荧光标记SNAP-RBD(308-553)蛋白并纯化

[0064] SNAP-RBD(308-553)蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成 0.5mg/mL的母液。SNAP488荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取 SNAP-RBD(308-553)蛋白溶液40μL，加入Halo640荧光染料0.6μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应2小时得到SNAP-RBD(308-553) -488dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的SNAP-RBD(308-553)-488dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的SNAP-RBD(308-553)-488dye蛋白浓度为0.22mg/mL，摩尔浓度约为4.3μM。

[0065] 取SNAP-RBD(308-553)和SNAP-RBD(308-553)-488dye少量，跑 SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图5所示。图5 的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第1和2道分别为SNAP-RBD(308-553)和SNAP-RBD(308-553)-488dye。蛋白SNAP-RBD (308-553)的分子量约为50.7kDa，介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间，荧光标记后的SNAP-RBD(308-553)-488dye在紫外光激发下显示出绿色的荧光。

[0066] 实施例12

[0067] 荧光标记的RBD-Halo与荧光标记的SNAP-hACE2的相互作用成像。

[0068] 将Hela细胞传于共聚焦成像皿，24小时后，按照说明书用Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体PCMV-SNAP-hACE2转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃5％CO2培养箱中继续培养48小时。将SNAP-561荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.2μM。用该探针溶液孵育细胞15min，然后用DMEM洗一遍，加入1mL DMEM培养基，加入RBD(333-525)-Halo-640dye至终浓度为20nM，同时，加入细胞核染料Hoechst33342终浓度为0.5μM，在37℃5％CO2培养箱中孵育10min。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图6a-d所示。

[0069] 图6a为405nm激发下的Hela细胞核成像，显示的是Hoechst 33342染料的荧光；图6b为561nm激发下的Hela细胞成像，显示的是SNAP-561染料的荧光，SNAP-561标记在细胞膜过表达的SNAP-hACE2蛋白上，因此561通道显示的是荧光标记的SNAP-hACE2蛋白；图6c为
640nm激发下的Hela细胞成像，显示的是RBD525-Halo-640dye的荧光；图6d为图2a-c叠加的图像，可见图6b 和图6c的荧光能够很好地重叠，证明了hACE2蛋白与RBD蛋白能够相互作用。

[0070] 实施例13

[0071] 荧光标记的RBD-Halo蛋白与野生型hACE2的相互作用成像

[0072] 将Hela细胞传于共聚焦成像皿，24小时后，后，按照说明书用Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体PCMV-hACE2-SV-EGFP转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃5％CO2培养箱中培养48小时。将培养基换成1mL DMEM培养基，加入RBD(333-525) -Halo-640dye至终浓度为20nM，同时，加入细胞核染料Hoechst33342终浓度为0.5μM，在37℃5％CO2培养箱中孵育10min。用荧光共聚焦显微镜在
100 倍油镜下成像，如图6e-h所示。

[0073] 图6e为405nm激发下的Hela细胞核成像，显示的是Hoechst 33342染料的荧光；图6f为488nm激发下的Hela细胞成像，显示的是绿色荧光蛋白EGFP 的荧光，EGFP在PCMV-hACE2-SV-EGFP质粒中是一个报告基因，只要有EGFP 表达的细胞，其细胞膜上一定过表达了和野生型的人源ACE2蛋白；图6g为640 nm激发下的Hela细胞成像，显示的是RBD(333-
525)-Halo-640dye的荧光；图6h为图6e-h叠加的图像，可见RBD(333-525)-Halo-640dye标记在有EGFP 蛋白表达的细胞的细胞膜上，证明了RBD(333-525)-Halo蛋白能够与野生型的hACE2蛋白相互作用。

[0074] 实施例14

[0075] 荧光标记的SNAP-RBD(308-553)蛋白与Halo-hACE2的相互作用成像[0076] 将Hela细胞传于共聚焦成像皿，24小时后，后，按照说明书用Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体pCMV-Halo-hACE2转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃5％CO2培养箱中培养45小时。将Halo-561荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.2μM。用该探针溶液孵育细胞15min，然后用DMEM洗一遍，将培养基换成1mL DMEM培养基，加入SNAP-RBD(308-553)-488dye至终浓度为50nM，在37℃ 5％CO2培养箱中孵育30min。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图 7a-c所示。

[0077] 图7a为561nm激发下的Hela细胞成像，显示的是Halo-561染料的荧光， Halo-561标记在细胞膜过表达的Halo-hACE2蛋白上，因此561通道显示的是荧光标记的Halo-hACE2蛋白；图7b为488nm激发下的Hela细胞成像，显示的是SNAP-RBD(308-553)-488dye的荧光；图7c为图7a,b叠加的图像，可见图 7a和图7b的荧光能够很好地重叠，证明了hACE2蛋白与RBD蛋白能够相互作用。

[0078] 实施例15

[0079] 荧光标记的RBD(319-541)-Halo蛋白与CLIP-hACE2的相互作用成像[0080] 将Hela细胞传于共聚焦成像皿，24小时后，后，按照说明书用Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体pCMV-CLIP-hACE2转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃5％CO2培养箱中培养45小时。将CLIP-488荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.5μM。用该探针溶液孵育细胞60min，然后用DMEM洗一遍，将培养基换成1mL DMEM培养基，加入RBD(319-541)-Halo-640dye至终浓度为100nM，在
37℃ 5％CO2培养箱中孵育30min。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图 7a-c所示。

[0081] 图7d为488nm激发下的Hela细胞成像，显示的是CLIP-488染料的荧光，CLIP-488标记在细胞膜过表达的CLIP-hACE2蛋白上，因此488通道显示的是荧光标记的CLIP-hACE2蛋白；图7e为640nm激发下的Hela细胞成像，显示的是RBD(319-541)-Halo-640dye的荧光；图7f为图7d,e叠加的图像，可见图7d和图7e的荧光能够很好地重叠，证明了hACE2蛋白与RBD蛋白能够相互作用。