[0001] 本发明属于生物医学组织工程，具体涉及一种生物能量活性材料及其应用。

[0002] 在临床上，因创伤、感染、骨肿瘤切除等原因造成的各种类型骨缺损十分常见。全世界范围内每年进行骨移植患者的数量达到220万【J.Van der Stok,E.M.Van Lieshout,Y.El‑Massoudi,G.H.Van Kralingen,P.Patka,Bone substitutes in the Netherlands‑a systematic literature review,Acta Biomater 7(2)(2011)739‑50.】。据美国骨科医师协会(AAOS)统计，在美国每年有630万人发生骨折，其中需要接受骨移植物的患者就有50万之多，每年仅在骨折治疗方面的费用支出高达2000亿美元【D.C.Lobb,B.R.DeGeorge,Jr.,A.B.Chhabra,Bone Graft Substitutes:Current Concepts and Future Expectations,J Hand Surg Am 44(6)(2019)497‑505e2.】。我国每年骨损伤患者超过350万，每年新增病例达到数十万之多，创伤住院年增长率达7.2％，高居住院人数的第二位，骨缺损的高发生率使得骨移植物成为仅次于输血之后需求量最大的医疗耗材【G.H.Brundtland,A WHO Scientific Group on the Burden of Musculoskeletal Conditions at the Start of the New Millennium met in Geneva from 13to 15January 2000.,Who Tech Rep Ser 919(2003)1‑218.】，给社会带来沉重的医疗负担。

[0003] 自体骨的移植可以较好的进行骨修复，但是“供体有限”限制了其更好的应用。生物可降解高分子材料因具有良好的生物相容性和降解性而广泛用于骨组织工程研究。生物可降解高分子材料包括天然可生物降解聚合物(如胶原、壳聚糖)和合成生物可降解聚合物(如PLA、PLGA、PCL)，因具有良好的生物相容性和降解性，是目前常用的骨组织工程支架材料【F.Asghari,M.Samiei,K.Adibkia,A.Akbarzadeh,S.Davaran,Biodegradable and biocompatible polymers for tissue engineering application:a review,ArtifCells Nanomed Biotechnol 45(2)(2017)185‑192.】。虽然可生物降解聚合物具有一定的骨缺损修复功能，但仍然存在降解速率不可控、力学性能较差、酸性降解产物引起炎症反应等系列自身难以克服的缺点【Y.X.Lai,Y.Li,H.J.Cao,J.Long,X.L.Wang,L.Li,C.R.Li,Q.Y.Jia,B.Teng,T.T.Tang,J.Peng,D.Eglin,M.Alini,D.W.Grijpma,G.Richards,L.Qin,Osteogenic magnesium incorporated into PLGA/TCP porous scaffoldby 3D printing for repairing challenging bone defect,Biomaterials 197(2019)207‑219.】，阻碍了其在临床上的广泛应用。

[0004] 骨再生过程是一个能量消耗的过程，细胞能量代谢对组织修复和再生起着至关重要的作用。三磷酸腺苷(ATP)是细胞能量的主要来源，在许多生物过程中发挥作用，包括细胞的增殖、迁移及分化【I.Gadjanski,S.Yodmuang,K.Spiller,S.Bhumiratana,G.Vunjak‑Novakovic,Supplementation of Exogenous Adenosine 5‑Triphosphate Enhances Mechanical Properties of 3D Cell‑Agarose Constructs for Cartilage Tissue Engineering,Tissue Eng Pt A 19(19‑20)(2013)2188‑2200.】。研究表明，生物能量作为一种潜在的治疗方法，已在体外模型或相对薄的浅表组织(如皮肤)再生方面取得了成功。到目前为止，用于复杂骨组织缺损修复的具有长期生物能量释放效应的3D支架鲜有报道。
这在很大程度上是由于使用现有的生物支架材料无法持续提高细胞中ATP的稳定性和相关生物质活性，阻碍了生物能量活性材料在骨组织工程中的应用和发展。

[0035] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

[0036] 实施例1

[0037] (1)将能合成3‑羟基丁酸‑4‑羟基丁酸共聚酯的微生物嗜盐单胞菌在60MMG培养基中，37℃，400‑800rpm条件下发酵培养72小时，72小时后收集菌体，置于70℃对菌体进行通风干燥，得到含有3‑羟基丁酸‑4‑羟基丁酸共聚酯的干菌体粉末。

[0038] 60MMG培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母提取物1g/L，硫酸铵0.25g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钠9.65g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，微量元素I10ml/L，微量元素II 1ml/L。

[0039] (2)用氯仿对干菌体粉末中的3‑羟基丁酸‑4‑羟基丁酸共聚酯进行提取(1g干菌体粉末加入20ml氯仿)，搅拌均匀后装入高压反应釜中，在100℃条件下反应4小时。

[0040] (3)待高压反应釜冷却后，采用过滤或者抽滤的方法去掉细胞碎片，得到澄清氯仿溶液。

[0041] (4)在60℃条件下将氯仿溶液浓缩(按照100ml氯仿溶液浓缩到60ml的比例进行)，然后加入到15倍体积的预冷无水乙醇中，然后置于4℃冰箱中过夜，进行沉淀析出。

[0042] (5)过滤收集步骤(4)中的沉淀析出物，并将收集到的沉淀析出物置于40℃真空干燥箱中24h，待溶剂挥发完全后，即可得3‑羟基丁酸‑4‑羟基丁酸共聚酯。

[0043] 称取50mg 3‑羟基丁酸‑4‑羟基丁酸共聚酯溶解于氯仿中，静置1小时形成均匀的溶液，然后取10ul进行凝胶渗透色谱，测试分子量。结果如图1所示。

[0044] 分子量计算结果如下：

[0045]

[0046] 实施例2

[0047] 将实施例1中合成得到的3‑羟基丁酸‑4‑羟基丁酸共聚酯材料装入熔融3D打印机(180℃)，进行骨组织修复多孔支架制备。

[0048] 结果如图2所示，其中，图2‑A为3D打印制备的多孔支架，图2‑B为支架横截面电镜扫描图，多孔支架的孔径大约在350‑400μm。

[0049] 实验例

[0050] 将实施例2中3D多孔支架浸泡于磷酸盐缓冲液8周，收集降解产物。在磷酸盐缓冲液中，3‑羟基丁酸‑4‑羟基丁酸共聚酯的降解产物主要是3‑羟基丁酸(3HB)。对收集到的降解产物进行浓度测定，然后进行体外实验。

[0051] 磷酸盐缓冲液的组成为：氯化钠7.9g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.24g/L。

[0052] (1)取生长状态良好的人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，按照2×104细胞密度接种于48孔板，4小时后向上述细胞中加入不同浓度的3‑羟基丁酸(0μM，10μM，40μM，80μM，160μM，320μM)，在第1，5，7天用CCK‑8分别测定细胞增殖情况。同时以乳酸(LA)作为对照组。

[0053] 结果如图3所示。图3为支架降解产物3‑羟基丁酸对人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增值的影响结果，与对照组(LA)相比，在第5天，第7天3HB刺激后显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖，表明支架降解产物能够促进hBMSCs增值。

[0054] (2)将人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，按照1×105细胞密度接种于6孔板，培养12小时后，向上述细胞中加入含有不同浓度的3‑羟基丁酸(0μM，40μM，160μM，320μM)的成骨诱导分化液，在第7，14天分别检测碱性磷酸酶的表达情况。根据碱性磷酸酶活性检测试剂盒的使用说明进行碱性磷酸酶表达的检测。

[0055] 成骨诱导分化液的组成：低糖DMEM培养基+10％胎牛血清+2mM L‑谷氨酰胺+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+100nM地塞米松+0.2mML‑抗坏血酸+10mMβ‑甘油磷酸钠。

[0056] 结果如图4所示。图4为支架降解产物3‑羟基丁酸对hBMSCs碱性磷酸酶表达活性的影响结果，结果表明支架降解产物能够促进hBMSCs碱性磷酸酶表达。且与对照组(LA)相比，3HB刺激骨髓间充质干细胞诱导分化14天后，显著增强了碱性磷酸酶的表达，而对照组则表现出抑制作用。

[0057] (3)将人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，按照1×105细胞密度接种于6孔板，培养12小时后，向上述细胞中加入含有不同浓度的3‑羟基丁酸(0μM，40μM，160μM，320μM)的成骨诱导分化液，在第10，14天分别用茜素红然检测胞外钙结节的形成。

[0058] 结果如图5所示。图5为支架降解产物3‑羟基丁酸对hBMSCs胞外钙结节形成的影响结果，与对照组(LA)相比，3HB刺激骨髓间充质干细胞诱导分化10，14天后显著增强了胞外钙结节的沉积，表明3‑羟基丁酸促进了骨髓间充质干细胞成骨分化标志物钙结节的形成。

[0059] (4)将人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，按照1×105细胞密度接种于6孔板，培养12小时后，向上述细胞中加入含有不同浓度的3‑羟基丁酸的成骨诱导分化液(0μM，40μM，
160μM，320μM)，进行21天诱导分化，诱导21天后，利用激光共聚焦拉曼光谱检测胞外磷灰石的形成。

[0060] 结果如图6所示。图6为激光共聚拉曼光谱分析hBMSCs胞外磷灰石的形成情况，骨髓间充质干细胞诱导分化21天后，胞外有大量的磷灰石形成且其含量随着3HB浓度的变大而增多，表明3‑羟基丁酸能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化磷灰石的形成。

[0061] (5)将人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，按照1×105细胞密度接种于6孔板，培养12小时后，向上述细胞中加入含有不同浓度的3‑羟基丁酸(0μM，40μM，160μM，320μM)的成骨诱导分化液，进行7天诱导分化，诱导7天后，利用实时荧光定量PCR技术检测成骨分化相关基因(Runx相关转录因子2基因、骨钙素基因、骨保护素基因)表达情况。

[0062] 结果如图7所示。图7为支架降解产物3‑羟基丁酸对hBMSCs成骨分化相关基因表达的影响结果，与对照组(LA)相比，3HB刺激骨髓间充质干细胞诱导分化7天后促进了成骨分化相关基因的表达，而对照组则在一定程度上抑制了基因的表达，表明支架降解产物3‑羟基丁酸能够促进hBMSCs成骨分化相关基因表达。

[0063] (6)将人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，按照1×104细胞密度接种于6孔板，培养12小时后，实验分为阳性对照组，阴性对照组以及实验组，阳性对照组用高糖培养基(HG)处理细胞6小时；阴性对照组用含有氧化磷酸化解偶联剂(CCCP)的高糖培养基处理细胞6小时；实验组用含有不同浓度(40μM，160μM，320μM)的3‑羟基丁酸和乳酸(LA)的无糖培养基(GF)处理细胞6小时。

[0064] 结果如图8所示。图8为支架降解产物3‑羟基丁酸对细胞线粒体膜势能的影响结果，结果表明支架降解产物3‑羟基丁酸能够为细胞提供ATP及维持线粒体膜势能(ΔΨm)，且与LA组相比，3HB能为细胞提供较多的生物能量(ATP)并提高细胞膜势能。