[0001] 本发明涉及基因工程，并且可用于生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。

[0002] 基因疗法是医学中的创新方法，旨在通过将新的遗传物质递送到患者的细胞中以补偿或遏制突变基因的功能和/或治疗遗传障碍来治疗遗传性和获得性疾病。基因表达的终产物可以是RNA分子或蛋白质分子。然而，体内的大多数生理学过程都与蛋白质分子的功能性活性有关，而RNA分子或是蛋白质合成的中间产物，或是进行调节功能。因此，在大多数情况下，基因疗法的目标是向生物体注入基因，所述基因提供由这些基因编码的蛋白质分子的转录和进一步翻译。在本发明的描述中，基因表达是指产生具有由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质分子。

[0003] 基因的组中包含的NOS2、NOS3、KCNMA1、VIP和CGRP基因在人和动物生物体的若干过程中起关键作用。证明了在某些情况下这些蛋白质的低/不足浓度与各种人类疾病之间的相关性，其通过在编码这些蛋白质的正常基因表达中的干扰证实。因此，选自NOS2、NOS3、KCNMA1、VIP、和CGRP基因的组的基因表达的基因疗法上调具有纠正人和动物的各种病况的潜力。

[0004] NOS2基因编码蛋白，即诱导型一氧化氮合酶2(同义名称：NOS2、或NOS2A、或iNOS、或NOS II)。NOS2蛋白参与一氧化氮合成，这反过来是人和动物中许多信号传导途径的介质，包括ERK和Apelin信号传导级联。NOS2在其中发挥重要作用的过程包括不同器官和组织的神经传递、抗细菌和抗肿瘤免疫、和血管舒缩。发现多态性和相对于正常NOS2基因表达的偏差与对不同疾病和病理状况的易感性之间存在联系。

[0005] 例如，显示在婴儿中NOS2表达的相对较低水平是STEC溶血性尿毒症综合征(HUS)发病率高的原因之一，导致肾功能衰竭(Tsuji S等人//Tohoku J Exp Med.2012Nov；228(3):247‑52)。在体内实验的过程中，刺激一氧化氮合成对Stx诱导的HUS小鼠模型具有保护作用(Dran GI等人//Kidney Int.2002Oct；62(4):1338‑48)。在另一项研究中，在NOS2表达降低的小鼠中观察到由败血症导致的死亡的可能性增加(Cobb J等人//Surgery 126(1999)438‑442)。

[0006] 众所周知，在患有伴随渗出液的中耳炎儿童中观察到腺状肿(adenoids)中NOS2表达降低，并且认为对NOS2表达的诱导是有前景的治疗方法(Granath A等人//Pediatr Allergy Immunol.2010Dec；21(8):1151‑6)。

[0007] 尽管关于NOS2活性在心血管疾病发病机制中的贡献存在有争议的信息，在对患有实验性高脂血症和易感动脉粥样硬化的兔子的研究中，显示施用表达NOS2基因的重组腺病毒载体导致血管舒缩功能的改善，并且这种方法的防止动脉硬化的作用表现为在血管壁中的脂质积累和内皮细胞中的炎症显著减少(Jiang B等人//Hum Gene Ther.2012Nov；23(11):1166‑75)。增加NOS2基因表达(包括通过病毒载体)可以减少或消除血管成形术后的内膜增生(Barbato JE,Tzeng E.//Trends Cardiovasc Med.2004Oct；14(7):267‑72)。

[0008] 表明了使用表达增强NOS2基因表达的saRNA的重组腺病毒载体的基因疗法方式恢复大鼠的勃起功能(Wang T等人//J Urol.2013Aug；190(2):790‑8)。

[0009] 至于癌症，显示了在用表达NOS2的载体注射的小鼠中，肿瘤的生长速度和转移降低(Schwentker A,Billiar TR.//World J Surg.2002Jul；26(7):772‑8)。当NOS2被抑制时，针对膀胱癌的BCG疗法的有效性显著降低，并且NOS2表达的增加可以被认为是改善BCG疗法有效性的策略(Shah G等人//Urol Oncol.2014Jan；32(1):45.e1‑9)。

[0010] 同样，可以将NOS2用于治疗阻塞性肾病(Chevalier RL.//Kidney Int.2004Oct；66(4):1709‑10)和骨骼肌损伤(Igamonti E等人//J Immunol.2013Feb 15；190(4):1767‑
77)。

[0011] NOS3基因编码蛋白，即内皮一氧化氮合酶3(同义名称：NOS3、或eNOS、或NOS III。NOS3蛋白正与NOS2蛋白一样，参与一氧化氮的合成，但特征在于血管内皮细胞中具有组成型表达，并且是确保血管张力的主要因素之一。NOS3参与的主要信号传导级联包括Act和EGF/EGFR信号传导途径。

[0012] 显示了伴随表达NOS3基因的载体的引入，在大鼠中观察到高血压降低和高胰岛素血症的缺乏(Zhao CX等人//J Pharmacol Exp Ther.2009Feb；328(2):610‑20)。气管内注射表达NOS3、环前列腺素合酶和VEGF基因的载体导致具有肺动脉高血压的实验动物的肺动脉压降低。用重组的载体转染并表达NOS3的自体细胞的引入获得了类似的阳性结果(Chen等人//Heart Lung Circ.2017May；26(5):509‑518；Wei L等人//Hypertens Res.2013May；36(5):414‑21)。

[0013] 同样，使用表达NOS3的重组腺病毒载体的基因疗法方式在大鼠中恢复了由年龄相关的变化引起的勃起功能(Bivalacqua T等人//Int J Impot Res.2000Sep；12Suppl 3:S8‑17)。

[0014] KCNMA1基因编码蛋白，即细胞膜的钙依赖性钾通道的成孔MaxiK亚基，其主要在平滑肌和神经元兴奋性的功能发挥中起重要作用。还显示了该基因的多态性与各种疾病(特别是心血管疾病)的联系。例如，KCNMA1基因的变异性是发生心肌梗塞和高血压的风险因素(Tabarki B等人//Hum Genet.2016Nov；135(11):1295‑1298)。

[0015] KCNMA1基因表达与粘膜的分泌功能相关。显示了构成COPD、哮喘、和可能的肺气肿发病机理的基础的IFN‑γ介导粘液纤毛清除降低可以通过提高KCNMA1基因的表达来校正(Manzanares D等人//Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2014Mar 1；306(5):L453‑62)。

[0016] 在勃起功能障碍方面，表达KCNMA1的DNA载体疗法成功完成I期临床试验，导致患者的勃起功能明显改善，在一些病例中持续24周(Melman,A等人//Hum  Gene Ther.2006Dec；17(12):1165‑76)。此外，用表达KCNMA1的载体转染的自体细胞的注射可显著改善大鼠实验模型中的勃起功能(He Y等人//Andrologia.2014Jun；46(5):479‑86)。

[0017] 在肿瘤细胞的一些类型中，特别是在肠癌细胞中，启动子KCNMA1基因区域被高度甲基化，导致其表达降低，并且可能在肿瘤的生长和扩散中起作用。通过将KCNMA1转基因引入这些细胞中引起的KCNMA1基因上调可以改变癌症过程的进程(Ma  G等人//Mol Cancer.2017Feb 23；16(1):46)。

[0018] 众所周知，西亚蝎(Buthus martensi Karsch)毒素的作用方式是阻断钙通道的亚基。可能地，使用KCNMA1作为与毒素结合的与内源性分子的竞争者可用于开发具有类似作用模式的针对这种毒素和其他毒素的解毒剂(Tao J等人//Toxins(Basel).2014Apr 22；6(4):1419‑33)。

[0019] VIP基因编码VIP蛋白，一种属于胰高血糖素家族的血管活性肠肽。它刺激心肌收缩功能，引起血管舒张，增加糖原分解，降低血压并使气管、胃和胆囊的平滑肌松弛。VIP蛋白作为具有抗细菌和抗真菌活性的抗微生物肽起作用(Karim  IA等人//J Neuroimmunol.2008Aug 30；200(1‑2):11‑6)。它的特征还在于具有免疫调节特性，表现为减少促炎介质的作用和增强抗炎介质的作用，使其成为治疗类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病的有希望的分子(Delgado M等人//Nat Med.2001May；7(5):563‑8)。

[0020] 显示在胰腺的β细胞中表达人VIP的大鼠中，响应于葡萄糖水平增加的胰岛素分泌增加(Kato I等人//Ann N Y Acad Sci.1996Dec 26；805:232‑42)。使用表达VIP的病毒载体的基因疗法方式已被证明在小鼠II型糖尿病实验模型中有效(Tasyurek HM等人//Gene Ther.2018Jul；25(4):269‑283)。

[0021] 在大鼠肺动脉高血压中，用重组VIP蛋白的单一疗法比用波生坦(bosentan)的疗法更有效(Hamidi SA等人//Respir Res.2011Oct 26；12:141)。

[0022] 关于癌症疾病，显示VIP表达抑制肾癌细胞的增殖(Vacas E等人//Biochim Biophys Acta.2012Oct；1823(10):1676‑85)。

[0023] 也已证明VIP对机械性肺上皮损伤的愈合具有积极作用(Guan CX等人//Peptides.2006Dec；27(12):3107‑14)。

[0024] 由VIP重组蛋白和甲磺酸酚妥拉明(phentolamine mesylate)的混合物组成的Invicorp(Plethora Solutions,London,UK)海绵窦内注射药，旨在用于治疗勃起功能障碍，并且在70％的勃起功能障碍病例中有效，所述病例对用其他药物的注射疗法有抗性(Wyllie MG//BJU Int.2010Sep；106(5):723‑4)。

[0025] CGRP基因编码CGRP蛋白，属于一个蛋白质家族的降钙素基因相关肽，所述家族还包括降钙素、肾上腺髓质素和淀粉素(amylin)。CGRP功能包括血管舒张和作为抗微生物肽起作用。CGRP参与先兆子痫的发展，并且对心血管系统具有保护作用(Márquez‑Rodas I等人//J Physiol Biochem.2006Mar；62(1):45‑56.)。在血管损伤的情况下，当CGRP在损伤热点中过表达时，凋亡细胞的数量会增加并防止新内膜增生。这些特性可用于预防各种血管外科手术后的再狭窄(Wang W,Sun  W,Wang  X.//Am  J Physiol HeartCirc Physiol.2004Oct；287(4):H1582‑9)。

[0026] 此外，CGRP在植入物周围组织的骨发育、代谢和重塑中发挥作用，并且注射表达CGRP的病毒载体对小鼠植入物的骨整合产生积极影响(Xiang L等人//Bone.2017Jan；94:135‑140)。注射用表达CGRP基因的病毒载体转染的自体细胞加速具有外周骨缺损的大鼠的再生(Fang Z等人//PLoS One.2013Aug 30；8(8):e72738)。

[0027] 注射表达CGRP基因的质粒载体导致小鼠糖尿病发病率降低，并显著降低诱导型自身免疫性糖尿病实验模型中的高血糖水平(She F等人//Sheng Li Xue Bao.2003Dec 25；55(6):625‑32)。表明了注射表达CGRP基因的病毒载体导致大鼠勃起功能的恢复
(Bivalacqua TJ等人//Biol Reprod.2001Nov；65(5):1371‑7)。

[0028] 此外，这些数据表明，在一组基因中包含的NOS2,NOS3,KCNMA1,VIP和CGRP基因编码的蛋白质的表达不足不仅与病理状况有关，而且与它们发展的易感性有关。此外，这些数据表明，这些蛋白质的表达不足可能不以现有临床实践标准(例如，使用ICD代码)框架内可以明确描述的病理学形式明确出现，但同时导致对人和动物不利并与生活质量恶化有关的状况。

[0029] 对提高治疗性基因表达的方法的分析意味着使用不同基因疗法载体的可行性。

[0030] 将基因疗法载体分为病毒、细胞、和DNA载体(关于基因疗法药物产物的质量、非临床和临床方面的指南EMA/CAT/80183/2014)。最近，基因疗法越来越重视非病毒基因递送系统的开发，其中质粒载体位居榜首。质粒载体没有细胞和病毒载体固有的限制。在靶细胞中，它们作为附加体存在，没有整合到基因组中，而产生它们相当便宜，并且没有施用质粒载体而引起的免疫反应或副作用，这使得它们成为遗传疾病的基因疗法和预防(DNA疫苗接种)的便捷工具(Li L,Petrovsky N.//Expert Rev Vaccines.2016；15(3):313‑29)。

[0031] 然而，在基因疗法中质粒载体使用的局限性是：1)用于在细菌菌株中生产构建体的抗生素抗性基因的存在；2)由病毒基因组序列所代表的各种调控元件的存在；3)决定载体递送至靶细胞的效率的治疗性质粒载体的长度。

[0032] 众所周知，欧洲药品管理局认为有必要避免将抗生素抗性标记基因添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于开发过程中基因疗法药物产物的设计修改的读后报告(Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development)/2011年12月14日EMA/CAT/GTWP/44236/2009先进疗法委员会(Committee for advanced therapies))。该建议主要与DNA载体渗透或水平抗生素抗性基因转移到体内存在的细菌细胞中的潜在危险有关，这些细菌是正常或机会性微生物群落的一部分。此外，抗生素抗性基因的存在显著增加了DNA载体的长度，这降低了其渗透到真核细胞的功效。

[0033] 值得注意的是，抗生素抗性基因也对DNA载体的生产方法做出了根本性的贡献。如果存在抗生素抗性基因，那么用于产生DNA载体的菌株通常在含有选择性抗生素的培养基中培养，这会在未经充分纯化的DNA载体制剂中造成抗生素痕量的风险。因此，没有抗生素抗性基因的用于基因疗法的DNA载体的生产与菌株的生产有关，其中此类菌株具有独特的特征，例如在无抗生素的培养基中治疗性DNA载体稳定扩增的能力。

[0034] 此外，欧洲药品管理局建议避免在治疗性质粒载体中存在构成各种病毒的基因组核苷酸序列的提高治疗性基因表达的调控元件(启动子、增强子、翻译后调控元件)(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南草稿(Draft Guideline on the quality,non‑clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal 
products)，http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf)。尽管这些序列可以提高治疗性转基因的表达水平，但是它们造成了与野生型病毒的遗传物质重组和整合到真核基因组中的风险。此外，疗法用的特定基因的过表达的相关性仍然是悬而未决的问题。

[0035] 疗法载体的大小也是必需的。众所周知，现代质粒载体通常具有不必要的非功能性位点，这些位点会显著增加其长度(Mairhofer  J,Grabherr  R.//Mol Biotechnol.2008.39(2):97‑104)。例如，pBR322系列载体中的氨苄西林抗性基因，通常由至少1000bp组成，占载体本身长度的20％以上。观察到载体长度与其渗入真核细胞的能力之间的反向关系；具有小长度的DNA载体有效渗入人和动物细胞中。例如，在关于用383‑
4548bp DNA载体转染HELA细胞的一系列实验中，显示渗入功效的差异可高达两个数量级(100倍差异)(Hornstein BD等人//PLoS ONE.2016；11(12):e0167537.)。

[0036] 因此，为了安全和最大效率的原因在选择DNA载体时，应优先考虑到如下那些构建体，它们不包含抗生素抗性基因，病毒来源的序列，并且其长度允许有效渗入到真核细胞中。以对于基因疗法目的足够的量生产此类DNA载体的菌株应确保使用无抗生素的营养培养基进行稳定的DNA载体扩增的可能性。

[0037] 用于基因疗法的重组DNA载体的使用实施例是产生用于遗传免疫的重组载体的方法(专利号US 9550998 B2)。质粒载体是超螺旋的质粒DNA载体，其用于人和动物细胞中克隆基因的表达。载体包含复制起点，含有人巨细胞病毒启动子和增强子的调控元件，以及来自人T‑细胞嗜淋巴细胞病毒的调节序列。

[0038] 利用噬菌体，通过插入菌株中的sacB基因的反义互补，将载体在无抗生素的专用大肠杆菌菌株中积累。该发明的缺点是在DNA载体组成中存在构成病毒基因组的序列的调控元件。

[0039] 以下实例是本发明关于使用NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的本发明的原型，以便于通过基因疗法方法提高这些治疗性基因的表达水平。

[0040] 专利号US 5594032A描述了通过将增强NOS2表达的NOS2基因的cDNA注射到生物体中来治疗勃起功能障碍的方法。本发明还描述了使用注射有NOS2基因的cDNA的遗传修饰的细胞将NOS2基因的cDNA递送到体内的方法。该发明的缺点是发明在勃起功能障碍疗法中的应用有限，并且缺乏使用允许NOS2基因的cDNA表达的不同载体的基因疗法方式。

[0041] 申请号US 20040120930A1描述了通过将重组NOS3蛋白或表达NOS3基因的载体注射到体内来治疗急性肢体缺血的技术。该发明的缺点包括发明在治疗急性肢体缺血方面的应用有限，并且对允许表达NOS2基因的cDNA的载体缺乏具体要求。

[0042] 专利号US 8536146B2描述了通过改变KCNMA1基因的表达来调节神经细胞功能的方法。该方法涉及通过将siRNA引入细胞来降低KCNMA1基因的表达。该发明的缺点包括发明对与病理性高KCNMA1表达相关的状态的有限的进一步实施、通过使用siRNA调控基因表达的方法、以及缺乏使用调控KCNMA1基因表达的各种载体的基因疗法方式。

[0043] 申请号WO 1994016718A1描述了用于治疗中枢神经系统疾病的经遗传修饰的神经元干细胞。经遗传修饰的神经干细胞可含有重组构建体，其允许选自基因的组(包括VIP和CGRP基因)的基因表达。该发明的缺点包括发明在治疗神经障碍方面的进一步实施有限，以及使用经遗传修饰细胞增加VIP和CGRP表达，但不包括表达这些基因的DNA载体。

[0209] 基于3165bp DNA载体VTvaf17，构建携带人治疗性基因的基因疗法DNA载体，设计为提高人和动物组织中这些治疗性基因的表达水平。产生携带人治疗性基因的每种基因疗法DNA载体的方法涉及将治疗性基因的蛋白质编码序列克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的多接头，所述治疗性基因选自以下基因的组：人NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因。众所周知，DNA载体渗入真核细胞的能力主要取决于载体的大小。尺寸最小的DNA载体具有更高的渗透能力。因此，优选载体中不存在不承担功能负载，但同时增加载体DNA大小的元件。在携带选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的组的治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产过程中，考虑了DNA载体的这些特征，其中载体中没有大的非功能性序列和抗生素抗性基因，除了技术优势和安全使用外，允许携带治疗性基因(选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的组)的所产生的的基因疗法DNA载体VTvaf17的尺寸显著减小。因此，所获得的基因疗法DNA载体渗入真核细胞的能力是由于其长度小所致。

[0210] 将以下基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP如下生产：将治疗性基因NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17中，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2，SEQ ID No.1；或VTvaf17‑NOS3，SEQ ID No.2；或VTvaf17‑VIP，SEQ ID No.3；或VTvaf17‑KCNMA1，SEQ ID No.4；或VTvaf17‑CGRP，SEQ ID No.5。通过从生物学正常组织样本提取总RNA产生NOS2基因(3466bp)、或NOS3基因(3615bp)、或VIP基因(511bp)、或KCNMA1基因(3578bp)、或CGRP基因(454bp)的编码区。将反转录反应用于人NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的第一链cDNA的合成。使用出于此目的通过化学合成方法产生的寡核苷酸进行扩增。通过考虑到用于进一步克隆的最佳程序的特异性限制性内切核酸酶切割扩增产物，并且通过位于VTvaf17载体多接头中的SalI、KpnI、BamHI、EcoRI、HindIII限制位点进行克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17。限制位点的选择是以这样的方式进行的，即克隆片段进入载体VTvaf17表达盒的阅读框，而蛋白质编码序列不包含所选核酸内切酶的限制位点。该领域的专家认识到基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP产生的方法学实现可以在已知的分子基因克隆的选择框架内变化，并且这些方法包括在本发明的范围内。例如，可以将不同的寡核苷酸序列用于扩增NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP基因，不同的限制性内切核酸酶或实验室技术(例如不依赖于连接的基因克隆)。

[0211] 基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP分别具有核苷酸序列SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2、或SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4、或SEQ ID No.5。同时，遗传密码的简并性是本领域专家已知的，并且这意味着本发明的范围还包括核苷酸序列的变体，不同之处在于核苷酸的插入、缺失或替换，它们不导致由治疗性基因编码的多肽序列的变化，和/或不导致VTvaf17载体调控元件的功能性活性的丧失。同时，遗传多态性是本领域专家已知的，并且意味着本发明的范围还包括来自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、或CGRP基因的组的核苷酸序列的变体，所述变体也编码NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、或CGRP蛋白的氨基酸序列的不同的变体，它们在生理条件下的其功能性活性上与列出的那些没有区别。

[0212] 渗入真核细胞并表达功能性活性的能力，即表达所获得的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP的治疗性基因的能力通过将所获得的载体注射入真核细胞，并随后分析特异性mRNA的表达和/或治疗性基因的蛋白质产物得到证实。注射了基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP的细胞中特异性mRNA的存在显示所获得的载体渗入真核细胞并表达治疗性基因的mRNA的能力。此外，该领域的专家知道mRNA基因的存在是强制性条件，但不是治疗性基因编码的蛋白质翻译的证据。因此，为证实基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP在注射了基因疗法DNA载体的真核细胞中在蛋白质水平上表达治疗性基因的特性，使用免疫学方法进行由治疗性基因编码的蛋白质浓度的分析。NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP蛋白的存在证实真核细胞中治疗性基因表达的功效，以及使用基于携带治疗性基因(选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，增加蛋白质浓度的可能性。为证实所产生的携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、携带治疗性基因(即NOS3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3、携带治疗性基因(即VIP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP、携带治疗性基因(即KCNMA1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1、携带治疗性基因(即CGRP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP的功效，使用以下方法：

[0213] A)实时PCR，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系后，人和动物细胞裂解液中治疗性基因的mRNA累积的变化；

[0214] B)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人细胞系后，人细胞裂解液中治疗性蛋白质的定量水平的变化。

[0215] C)酶联免疫吸附测定，即在将基因疗法DNA载体注射入这些组织后，人和动物组织生检标本的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化；

[0216] D)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染的该人的自体细胞注射这些组织后，在人组织生检的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化。

[0217] 为了证实使用构建的携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、携带治疗性基因(即NOS3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3、携带治疗性基因(即VIP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP、携带治疗性基因(即KCNMA1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1、携带治疗性基因(即CGRP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP的可行性，进行以下内容：

[0218] A)用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系；

[0219] B)将基因疗法DNA载体注射入不同的人和动物组织；

[0220] C)将用基因疗法DNA载体转染的自体细胞注射入人组织。

[0221] 如由基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP的核苷酸序列(分别为SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2、或SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4、或SEQ ID No.5)的核苷酸序列中缺乏与病毒基因组同源的区域和抗生素抗性基因所证实，由于基因疗法DNA载体中缺少构成病毒基因组核苷酸序列的调控元件并且基因疗法DNA载体中缺少抗生素抗性基因，这些使用方法缺少针对人和动物的基因疗法的潜在风险。

[0222] 该领域的专家已知，使用基因疗法DNA载体中的抗生素抗性基因，通过在含有选择性抗生素的营养培养基中增加细菌生物质来获得制备量的这些载体。在本发明的框架内，为了确保携带NOS2、或NOS3、或VIP或KCNMA1、或CGRP治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的安全使用，使用含有抗生素的选择性营养培养基是不可能的。提出了基于大肠杆菌菌株SCS110‑AF获得用于生产这些基因疗法载体的菌株的方法，作为用于获得携带治疗性基因(选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的技术解决方案，以便于在工业规模上扩大基因疗法载体的生产。大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP生产的方法涉及大肠杆菌菌株SCS110‑AF的感受态细胞的生产，其中使用对于本领域的专家熟知的转化(电穿孔)方法，将基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或DNA载体VTvaf17‑NOS3、或DNA载体VTvaf17‑VIP、或DNA载体VTvaf17‑KCNMA1、或DNA载体VTvaf17‑CGRP分别注射入这些细胞。将所获得的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP用于分别生产基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP，允许使用无抗生素培养基。

[0223] 为了证实携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、携带治疗性基因(即NOS3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3、携带治疗性基因(即VIP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP、携带治疗性基因(即KCNMA1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1、携带治疗性基因(即CGRP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP在工业规模上的可生产性、可构建性和至生产规模的扩大，在工业规模上对各自含有携带治疗性基因(即NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP进行发酵。

[0224] 将细菌团的生产扩大至工业规模用于分离携带治疗性基因(选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的方法，所述方法涉及在提供合适的生物质累积动态的无抗生素营养培养基中孵育大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP的种子培养物。在对数生长期达到足够量的生物质后，将细菌培养物转移至工业发酵罐，并然后培养至稳定期，然后提取含有治疗性DNA产物(即基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1、或基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP)的级份，多级过滤，并且通过色谱方法进行纯化。该领域的专家已知，菌株的培养条件、营养培养基的组成(除了无抗生素)、所使用的设备、和DNA纯化方法可以随特定生产线在标准操作程序的框架内变化，但是使用大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP的扩大、工业生产、和DNA载体的纯化的已知方法落入本发明的范围。

[0225] 本发明所述的公开内容通过本发明的实施例的示例来说明。

[0226] 在以下实施例中解释了本发明的本质。

[0227] 实施例1.

[0228] 携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的产生。

[0229] 由SalI和KpnI限制位点将NOS2基因的编码区(3466bp)克隆到3165bp DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2。通过从生物学人组织样本分离总RNA，随后使用商业试剂盒Mint‑2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并且使用以下寡核苷酸以及可商购的试剂盒 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增

[0230] 以获得NOS2基因的编码区(3466bp)：

[0231] NOS2_F ATCGTCGACCACCATGGCCTGTCCTTGGAAATTTC，

[0232] NOS2_R CGGTACCTCAGAGCGCTGACATCTCCAGG。

[0233] 通过整合源自不同来源的DNA的六个片段来构建基因疗法DNA载体VTvaf17：

[0234] (a)复制起点由具有点突变的可商购质粒pBR322区域的PCR扩增产生；

[0235] (b)EF1a启动子区由人基因组DNA的位点的PCR扩增产生；

[0236] (c)hGH‑TA转录终止子由人基因组DNA位点的PCR扩增产生；

[0237] (d)转座子Tn10的RNA‑OUT调控位点由寡核苷酸合成；

[0238] (e)卡那霉素抗性基因由可商购的质粒pET‑28的位点的PCR扩增产生；

[0239] (f)多接头通过使两个合成寡核苷酸退火而产生。

[0240] 根据制造商的说明，使用可商购的试剂盒 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增。片段具有重叠区域，允许它们与随后的PCR扩增合并。
使用寡核苷酸Ori‑F和EF1‑R整合片段(a)和(b)，并且使用寡核苷酸hGH‑F和Kan‑R整合片段(c)、(d)、和(e)。之后，所产生的片段通过以位点BamHI和NcoI限制性，随后连接来整合。这形成仍然缺少多接头的质粒。为了添加它，通过BamHI和EcoRI位点切割质粒，然后与片段(f)连接。因此，构建携带侧翼有SpeI限制位点的卡那霉素抗性基因的4182bp载体。然后由SpeI限制位点切割该基因，并且将剩余片段与自身连接。这形成重组的3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17，并允许无抗生素选择。

[0241] 通过限制性内切核酸酶SalI和KpnI(New England Biolabs,USA)切割NOS2基因的编码区的扩增产物和DNA载体VTvaf17。

[0242] 这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.1的6625bp DNA载体VTvaf17‑NOS2，并且一般结构显示在图1中。

[0243] 实施例2.

[0244] 携带治疗性基因(即NOS3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3的产生。

[0245] 由HindIIII和EcoRI限制位点，将NOS3基因的编码区(3615bp)克隆到3165bp DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3。通过从生物学人组织样本分离总RNA，随后使用商业试剂盒Mint‑2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并且使用以下寡核苷酸以及可商购的试剂盒 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，以获得NOS3基因的编码区(3615bp)：

[0246] NOS3_F GACAAGCTTCCACCATGGGCAACTTGAAGAG，

[0247] NOS3_R GGAATTCAGGGGCTGTTGGTGTCTGAGCCG；通过限制性内切核酸酶HindIIII和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。

[0248] 这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.2的6774bp DNA载体VTvaf17‑NOS3，并且一般结构显示在图1中。

[0249] 如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。

[0250] 实施例3.

[0251] 携带治疗性基因(即人VIP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP的产生。

[0252] 由BamHI和EcoRI限制位点将VIP基因的编码区(511bp)克隆到3165bp DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP。通过从生物学人组织样本分离总RNA，随后使用商业试剂盒Mint‑2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并且使用以下寡核苷酸以及可商购的试剂盒 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增以获
得VIP基因的编码区(511bp)：

[0253] VIP_F AGGATCCACCATGGACACCAGAAATAAGGCCCAG，

[0254] VIP_R GGAATTCATTTTTCTAACTCTTCTGGAAAG；通过限制性内切核酸酶BamHI和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。

[0255] 这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.3的3652bp DNA载体VTvaf17‑VIP，并且一般结构显示在图1中。

[0256] 如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。

[0257] 实施例4.

[0258] 携带治疗性基因(即KCNMA1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1的产生。

[0259] 由BamHI和EcoRI限制位点，将KCNMA1基因的编码区(3578bp)克隆到3165bp DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1。通过从生物学人组织样本分离总RNA，随后使用商业试剂盒Mint‑2(Evrogen)进行反转录反应，并且使用以下寡核苷酸以及可商购的试剂盒 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，以获得KCNMA1基因的编码区(3578bp)：

[0260] KCNMA1_F AGGATCCGGTACCGAGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCCATG，

[0261] KCNMA1_R ACCAAGCTTATCTGTAAACCATTTCTTTTCTG；通过限制性内切核酸酶BamHI和EcoRI(New England Biolabs)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。

[0262] 这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.4的6731bp DNA载体VTvaf17‑KCNMA1，并且一般结构显示在图1中。

[0263] 如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。

[0264] 实施例5.

[0265] 携带治疗性基因(即CGRP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP的产生。

[0266] 由BamHI和EcoRI限制位点将CGRP基因(454bp)的编码区克隆到3165bp DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP。通过从生物学人组织样本分离总RNA，随后使用商业试剂盒Mint‑2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并且使用以下寡核苷酸以及可商购的试剂盒 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，以
获得CGRP基因的编码区(454bp)：

[0267] CGRP_F AGGATCCGGACGTCATGGAAGTGAAGGATGCCAATT，

[0268] CGRP_R GGAATTCCTATGCTGGGTCCTCTTCGTCCATTG；通过限制性内切核酸酶BamHI和EcoRI(New England Biolabs)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。

[0269] 这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.5的3595bp DNA载体VTvaf17‑CGRP，并且一般结构显示在图1中。

[0270] 如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。

[0271] 实施例6.

[0272] 携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能性活性的证据。该实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。

[0273] 在用携带人NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染后48小时，在HBdSMC原代人膀胱平滑肌细胞(ATCC PCS‑420‑012)中对NOS2治疗性基因的mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。

[0274] 在标准条件下(37℃，5％CO2)在使用血管平滑肌细胞GroCGRPh试剂盒(TM
PCS‑100‑042 )制备的含有生长添加剂的培养基中培养HBdSMC人原代膀胱平滑肌细胞培养
4
物。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)，用表达人NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2进行转染。在试管1中，将1μl的DNA载体VTvaf17‑NOS2溶液(浓度
500ng/μl)和1μl的试剂P3000添加至25μl培养基Opti‑MEM(Gibco,USA)。将制剂通过轻微摇动进行混合。在试管2中，将1μl Lipofectamine 3000溶液添加至25μl培养基Opti‑MEM(Gibco,USA)中。将制剂通过轻微摇动进行混合。将试管1中的内容物添加至试管2的内容物，并且将混合物在室温下孵育5分钟。将所得溶液以40μl的体积逐滴添加至细胞中。

[0275] 将用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的细胞用作参考。如上所述制备用于转染的参考载体VTvaf17。

[0276] 使用Trizol试剂(Invitrogen,USA)，从经转染的细胞中分离总RNA。将1ml的Trizol试剂添加至含有细胞的孔中，并且匀化，并且在65℃下加热5分钟。然后将样品以14,
000g离心10分钟，并在65℃下再次加热10分钟。然后，添加200μl氯仿，并将混合物轻轻搅拌，并且以14,000g离心10分钟。然后将水相分离，并与1/10体积的3M乙酸钠(pH 5.2)和相等体积的异丙醇混合。将样品在‑20℃下孵育10分钟，并然后以14,000g离心10分钟。将沉淀的RNA在1ml 70％乙醇中冲洗，风干，并且溶解于10μl无RNase的水中。通过评价由实时PCR的cDNA扩增子的累积动态来测定转染后NOS2 mRNA表达的水平。对于针对人NOS2基因特异的cDNA的产生和扩增，使用以下NOS2_SF和NOS2_SR寡核苷酸：

[0277] NOS2_SF AACGTGTTCACCATGAGGCT，

[0278] NOS2_SR CTCTCAGGCTCTTCTGTGGC。

[0279] 扩增产物的长度是377bp。

[0280] 使用SYBR GreenQuantitect RT‑PCR试剂盒(Qiagen,USA)针对实时PCR进行反转录反应和PCR扩增。以20μl的体积，含有：25μl的QuantiTect SYBR Green RT‑PCR Master Mix、2.5mM氯化镁、0.5μM每种引物、以及5μl的RNA进行反应。对于反应，在以下条件下使用CFX96扩增仪(Bio‑Rad,USA)：在42℃下持续30分钟反转录，在98℃下持续15分钟变性的1个循环，随后包括在94℃下持续15s变性、在60℃下持续30s引物的退火、以及在72℃下持续30s延伸的40个循环。将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β‑2‑微球蛋白)基因用作参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含NOS2和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。使用Bio‑Rad CFX Manager 2.1软件(Bio‑Rad,USA)，进行NOS2和B2M基因的cDNA扩增累积动态的实时定量。测定结果的图表显示在图2中。

[0281] 图2显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染HBdSMc人膀胱平滑肌细胞培养物，cDNA扩增子比在细胞的参考样本中累积更快，这表明用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染后，细胞中人NOS2基因的mRNA水平更高，并且证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达NOS2基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2，以便于提高真核细胞中NOS2基因的表达水平的可行性。

[0282] 实施例7.

[0283] 携带治疗性基因(即NOS3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能性活性的证据。该实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。

[0284] 在用携带人NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3转染后48小时，在T/G HA‑TMVSMC人原代主动脉平滑肌细胞培养物(ATCC CRL‑1999 )中对NOS3治疗性基因的mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。

[0285] 在37℃下，在5％CO2的存在下在F‑12K培养基(ATCC)中培养T/G HA‑VSMC人原代主动脉平滑肌细胞培养物，所述培养基添加了0.05mg/ml抗坏血酸、0.01mg/ml胰岛素、0.01mg/ml转铁蛋白、10ng/ml亚硒酸钠、0.03mg/ml内皮细胞生长补充物(ECGS)、10％胎牛
4
血清。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。将Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例
6所述的程序，用表达人NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3进行转染。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的T/GHA‑VSMC原代主动脉平滑肌细胞用作参考。
如实施例6中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了寡核苷酸具有与实施例6不同的序列。对于针对人NOS3基因特异的cDNA的扩增，使用以下NOS3_SF和NOS3_SR寡核苷酸：

[0286] NOS3_SF GACCCACTGGTGTCCTCTTG，

[0287] NOS3_SR CTCCGTTTGGGGCTGAAGAT

[0288] 扩增产物的长度是329bp。

[0289] 将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β‑2‑微球蛋白)基因用作参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含NOS3和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。使用Bio‑Rad  CFX Manager 2.1软件(Bio‑Rad,USA)，进行PCR产物(即通过扩增获得的NOS3和B2M基因cDNA)的实时定量。测定结果的图表显示在图3中。

[0290] 图3显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3转染T/GHA‑VSMC原代主动脉平滑肌细胞培养物，cDNA扩增子比在细胞的参考样本中累积更快，这表明用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3转染后，细胞中人NOS3基因的mRNA水平更高，并且证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达NOS3基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3以便于提高真核细胞中NOS3基因的表达水平的可行性。

[0291] 实施例8.

[0292] 携带治疗性基因(即VIP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能性活性的证据。该实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。

[0293] 在用携带人VIP基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP转染后48小时，在HBdSMC原代人膀胱平滑肌细胞(ATCC PCS‑420‑012)中对VIP治疗性基因的mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。

[0294] 在标准条件下(37℃，5％CO2)在使用血管平滑肌细胞GroCGRPh试剂盒(TM
PCS‑100‑042 )制备的含有生长添加剂的培养基中培养HBdSMC人原代膀胱平滑肌细胞培养
4
物。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。将Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例6所述的程序，用表达人VIP基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP进行转染。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的HBdSMc人原代膀胱平滑肌细胞用作参考。如实施例
6中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了寡核苷酸具有与实施例6不同的序列。
对于针对人VIP基因特异的cDNA的扩增，使用以下VIP_SF和VIP_SR寡核苷酸：

[0295] VIP_SF CCTTCTGCTCTCAGGTTGGG，

[0296] VIP_SR CCCTCACTGCTCCTCTTTCC

[0297] 扩增产物的长度是380bp。

[0298] 将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β‑2‑微球蛋白)基因用作参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含VIP和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。使用Bio‑Rad CFX Manager 2.1软件(Bio‑Rad,USA)，进行PCR产物(即通过扩增获得的VIP和B2M基因cDNA)的实时定量。
测定结果的图表显示在图4中。

[0299] 图4显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP转染HBdSMc人膀胱平滑肌细胞培养物，cDNA扩增子比在细胞的参考样本中累积更快，这表明用基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP转染后，细胞中人VIP基因的mRNA水平更高，并且证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达VIP基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP以便于提高真核细胞中VIP基因的表达水平的可行性。

[0300] 实施例9.

[0301] 携带治疗性基因(即KCNMA1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能性活性的证据。该实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。

[0302] 在用携带人KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染后48小时，在人原代海绵体阴茎细胞培养物中对KCNMA1治疗性基因的mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。

[0303] 如下培养原代人海绵体阴茎细胞。使用生检取样器MAGNUM(BARD,USA)，从患者的海绵体阴茎部位取阴茎生检。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有0.05％胰蛋白酶(Gibco,USA)和10mM EDTA的缓冲溶液中。在37℃下，将细胞在磁搅拌器上搅拌的情况下进行孵育。然后使用100μm孔径过滤器(Nalgen,USA)将细胞悬浮液过滤，以
130g离心10分钟，将沉淀的细胞重悬浮于含有10％胎牛血清(Gibco,USA)、2mM谷氨酰胺、10
2
μg/ml庆大霉素的15ml DMEM(Gibco,USA)中，放置于75cm烧瓶(Eppendorf)中，并且在37℃下，在5％CO2的存在下孵育36‑72小时。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以
4
5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。

[0304] 将Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例6所述的程序，用表达人KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1进行转染。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的经T HESC固定的人成纤维细胞的细胞培养物用作参考。如实施例6中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了寡核苷酸具有与实施例6不同的序列。对于针对人KCNMA1基因特异的cDNA的扩增，使用以下KCNMA1_SF和KCNMA1_SR寡核苷酸：

[0305] KCNMA1_SF GAGAGAGCCGAAGCCGAAAG，

[0306] KCNMA1_SR ACCCTTGGGAATTAGCCTGC。

[0307] 扩增产物的长度是825bp。

[0308] 将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β‑2‑微球蛋白)基因用作参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含KCNMA1和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。使用Bio‑Rad  CFX Manager 2.1软件(Bio‑Rad,USA)，进行PCR产物(即通过扩增获得的KCNMA1和B2M基因cDNA)的实时定量。测定结果的图表显示在图5中。

[0309] 图5显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染的人海绵体阴茎细胞培养物，cDNA扩增子比在细胞的参考样本累积中更快，这表明在用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染后，细胞中人KCNMA1基因的mRNA水平更高，并且证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达KCNMA1基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1以便于提高真核细胞中KCNMA1基因的表达水平的可行性。

[0310] 实施例10.

[0311] 携带治疗性基因(即CGRP基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能性活性的证据。该实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。

[0312] 在用携带人CGRP基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP转染后48小时，在HBdSMC原代人膀胱平滑肌细胞(ATCC PCS‑420‑012)中，对CGRP治疗性基因的mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。

[0313] 在标准条件下(37℃，5％CO2)在使用血管平滑肌细胞GroCGRPh试剂盒(TM
PCS‑100‑042 )制备的含有生长添加剂的培养基中培养HBdSMC人原代膀胱平滑肌细胞培养
4
物。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。将Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例6所述的程序，用表达人CGRP基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP进行转染。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的HBdSMc人原代膀胱平滑肌细胞用作参考。如实施例6中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了寡核苷酸具有与实施例6不同的序列。对于针对人CGRP基因特异的cDNA的扩增，使用以下CGRP_SF和CGRP_SR寡核苷酸：

[0314] CGRP_SF ACTGATCTGAAAGAGCAGCGT,

[0315] CGRP_SR AGAATGCTGGTGACGGTGTG

[0316] 扩增产物的长度是311bp。

[0317] 将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β‑2‑微球蛋白)基因用作参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含CGRP和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。使用Bio‑Rad  CFX Manager 2.1软件(Bio‑Rad,USA)，进行PCR产物(即通过扩增获得的CGRP和B2M基因cDNA)的实时定量。测定结果的图表显示在图6中。

[0318] 图6显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP转染HBdSMc人膀胱平滑肌细胞培养物，cDNA扩增子比在细胞的参考样本中累积更快，这表明用基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP转染后，细胞中人CGRP基因的mRNA水平更高，并且证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达CGRP基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP以便于提高真核细胞中CGRP基因的表达水平的可行性。

[0319] 实施例11.

[0320] 使用携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2以便于提高哺乳动物细胞中NOS2蛋白的表达的功效和可行性的证据。

[0321] 在用携带人NOS2基因的DNA载体VTvaf17‑NOS2转染HBdSMC原代人膀胱平滑肌细胞培养物(ATCC PCS‑420‑012)后，对这些细胞的细胞裂解液中NOS2蛋白浓度的变化进行评价。

[0322] 在标准条件下(37℃，5％CO2)在使用血管平滑肌细胞GroCGRPh试剂盒(TM
PCS‑100‑042 )制备的含有生长添加剂的培养基中培养HBdSMC人原代膀胱平滑肌细胞培养
4
物。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少NOS2基因的cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人NOS2基因的DNA载体VTvaf17‑NOS2(C)用作转染剂。根据制造商的程序(QIAGEN，SuperFect 
Transfection Reagent Handbook,2002)，伴随一些修改，制备DNA‑树枝状聚合物。对于在
24孔板的1个孔中的细胞转染，将麦克伊(McCoy)5A培养基添加至溶解于TE缓冲液中的1μg DNA载体，至终体积为60μl，然后添加5μl的SuperFect转染试剂，并通过移液五次轻轻混合。
将复合物在室温下孵育10‑15分钟。然后将培养物培养基自孔取出，将所述孔用1ml的PBS缓冲液冲洗。350μl含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基添加至所得复合物中，轻轻混合，并且添加至细胞。在5％CO2的存在下，在37℃下将所述细胞用复合物孵育2‑3小时。

[0323] 然后小心移去培养基，并且将大批活细胞用1ml PBS缓冲液冲洗。然后，添加含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基，并在5％CO2的存在下在37℃下孵育24‑48小时。

[0324] 转染后，将细胞用PBS冲洗三次，并然后将1ml的PBS添加至细胞，并使细胞经历三次冷冻/融化。然后将悬浮液以15,000rpm离心15分钟，并收集上清液，并用于定量和测定治疗性蛋白质。

[0325] 根据制造商的方法，使用针对一氧化氮合酶2，诱导型(NOS2)的ELISA试剂盒(Cloud‑Clone Corp.Cat.SEA837Hu,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定NOS2蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。

[0326] 为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的NOS2蛋白的参考样本构建。敏感性为至少54pg/ml(0.057ng/ml)，测量范围‑从156pg/ml至10000pg/ml(0.156‑10ng/ml)。将R‑3.0.2用于对结果进行统计学处理并进行数据可视化(https://www.r‑project.org/)。测定结果的图表显示在图7中。

[0327] 图7显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染HBdSMc人膀胱平滑肌细胞导致NOS2蛋白质浓度增加，证实了所述载体渗入真核细胞并在蛋白质水平上表达NOS2基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2以便于提高真核细胞中NOS2基因的表达水平的可行性。

[0328] 实施例12.

[0329] 使用携带NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3以便于提高哺乳动物细胞中NOS3蛋白的表达的功效和可行性的证据。

[0330] 在用携带人NOS3基因的DNA载体VTvaf17‑NOS3转染HBdSMC原代人膀胱平滑肌细胞培养物(ATCC PCS‑420‑012)后，对这些细胞的细胞裂解液中NOS3蛋白浓度的变化进行评价。

[0331] 在标准条件下(37℃，5％CO2)在使用血管平滑肌细胞GroCGRPh试剂盒(TM
PCS‑100‑042 )制备的含有生长添加剂的培养基中培养HBdSMC人原代膀胱平滑肌细胞培养
4
物。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少NOS3基因的cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人NOS3基因的DNA载体VTvaf17‑NOS3(C)用作转染剂。根据制造商的程序(QIAGEN，SuperFect 
Transfection Reagent Handbook,2002)，伴随一些修改，制备DNA‑树枝状聚合物。对于在
24孔板的一个孔中的细胞转染，将麦克伊(McCoy)5A培养基添加至溶解于TE缓冲液中的1μg DNA载体，至终体积为60μl，然后添加5μl的SuperFect转染试剂，并通过移液五次轻轻混合。
将复合物在室温下孵育10‑15分钟。然后将培养物培养基自孔取出，将所述孔用1ml的PBS缓冲液冲洗。350μl含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基添加至所得复合物中，轻轻混合，并且添加至细胞。在5％CO2的存在下，在37℃下将所述细胞用复合物孵育2‑3小时。

[0332] 然后小心移去培养基，并且将大批活细胞用1ml PBS缓冲液冲洗。然后，添加含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基，并在5％CO2的存在下在37℃下孵育24‑48小时。

[0333] 转染后，将细胞用PBS冲洗三次，并然后将1ml的PBS添加至细胞，并使细胞经历三次冷冻/融化。然后将悬浮液以15,000rpm离心15分钟，并收集上清液，并用于定量和测定治疗性蛋白质。

[0334] 根据制造商的方法，使用针对一氧化氮合酶3，内皮的(NOS3)的ELISA试剂盒(Cloud‑Clone Corp.Cat.SEA868Hu,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定NOS3蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。

[0335] 为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的NOS3蛋白的参考样本构建。敏感性为至少57pg/ml(0.057ng/ml)，测量范围‑从156pg/ml至10000pg/ml(0.156‑10ng/ml)。将R‑3.0.2用于对结果进行统计学处理并进行数据可视化(https://www.r‑project.org/)。测定结果的图表显示在图8中。

[0336] 图8显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3转染HBdSMc人膀胱平滑肌细胞导致NOS3蛋白质浓度的增加，证实了所述载体渗入真核细胞并在蛋白质水平上表达NOS3基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3以便于提高真核细胞中NOS3基因的表达水平的可行性。

[0337] 实施例13.

[0338] 使用携带VIP基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP以便于提高哺乳动物细胞中VIP蛋白的表达的功效和可行性的证据。

[0339] 在用携带人VIP基因的DNA载体VTvaf17‑VIP转染HBdSMC原代人膀胱平滑肌细胞培养物(ATCC PCS‑420‑012)后，对这些细胞的条件培养基中VIP蛋白浓度的变化进行评价。

[0340] 在标准条件下(37℃，5％CO2)在使用血管平滑肌细胞GroCGRPh试剂盒(TM
PCS‑100‑042 )制备的含有生长添加剂的培养基中培养HBdSMC人原代膀胱平滑肌细胞培养
4
物。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5x10个细胞/孔的量接种到24孔板中。将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少VIP基因的cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人VIP基因的DNA载体VTvaf17‑VIP用作转染剂。根据制造商的程序(QIAGEN，SuperFect Transfection Reagent Handbook,2002)，伴随一些修改，制备DNA‑树枝状聚合物。对于在24孔板的一个孔中的细胞转染，将麦克伊(McCoy)5A培养基添加至溶解于TE缓冲液中的1μg DNA载体，至终体积为60μl，然后添加5μl的SuperFect转染试剂，并通过移液五次轻轻混合。将复合物在室温下孵育10‑15分钟。然后将培养物培养基自孔取出，将所述孔用1ml的PBS缓冲液冲洗。350μl含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基添加至所得复合物中，轻轻混合，并且添加至细胞。在5％CO2的存在下，在37℃下将所述细胞用复合物孵育2‑3小时。

[0341] 然后小心移去培养基，并且将大批活细胞用1ml PBS缓冲液冲洗。然后，添加含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基，并在5％CO2的存在下在37℃下孵育24‑48小时。

[0342] 转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，通过添加0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH 7‑7.6)使混合物中和，并充分搅拌。收集上清液，并用于测定治疗性蛋白质。

[0343] 根据制造商的方法，使用针对血管活性肠肽(VIP)的ELISA试剂盒(Cloud‑Clone Corp.Cat.CEA380Hu,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定NOS2蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。

[0344] 为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的VIP蛋白的参考样本构建。敏感性为至少2.63pg/ml(0.00263ng/ml)，测量范围‑从6.17pg/ml至500pg/ml(0.00617‑0.5ng/ml)。将R‑3.0.2用于对结果进行统计学处理并进行数据可视化(https://www.r‑project.org/)。测定结果的图表显示在图9中。

[0345] 图9显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP转染HBdSMc人膀胱平滑肌细胞导致VIP蛋白质浓度的增加，证实了所述载体渗入真核细胞并在蛋白质水平上表达VIP基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑VIP以便于提高真核细胞中VIP基因的表达水平的可行性。

[0346] 实施例14.

[0347] 使用携带KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1以便于提高哺乳动物细胞中KCNMA1蛋白的表达的功效和可行性的证据。

[0348] 在用携带人KCNMA1基因的DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染HBdSMC原代人膀胱平滑肌细胞培养物(ATCC PCS‑420‑012)后，对这些细胞的细胞裂解液中KCNMA1蛋白浓度的变化进行评价。

[0349] 在标准条件下(37℃，5％CO2)在使用血管平滑肌细胞GroCGRPh试剂盒(TM
PCS‑100‑042 )制备的含有生长添加剂的培养基中培养HBdSMC人原代膀胱平滑肌细胞培养
4
物。为实现90％汇合，在转染程序之前24小时，将细胞以5×10 个细胞/孔的量接种到24孔板中。将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少KCNMA1基因的cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人KCNMA1基因的DNA载体VTvaf17‑KCNMA1用作转染剂。根据制造商的程序(QIAGEN，SuperFect Transfection Reagent Handbook,2002)，伴随一些修改，制备DNA‑树枝状聚合物。对于在
24孔板的一个孔中的细胞转染，将麦克伊(McCoy)5A培养基添加至溶解于TE缓冲液中的1μg DNA载体，至终体积为60μl，然后添加5μl的SuperFect转染试剂，并通过移液五次轻轻混合。
将复合物在室温下孵育10‑15分钟。然后将培养物培养基自孔取出，将所述孔用1ml的PBS缓冲液冲洗。350μl含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基添加至所得复合物中，轻轻混合，并且添加至细胞。在5％CO2的存在下，在37℃下将所述细胞用复合物孵育2‑3小时。

[0350] 然后小心移去培养基，并且将大批活细胞用1ml PBS缓冲液冲洗。然后，添加含有10μg/ml庆大霉素的麦克伊(McCoy)5A培养基，并在5％CO2的存在下在37℃下孵育24‑48小时。

[0351] 转染后，将细胞用PBS冲洗三次，并然后将1ml的PBS添加至细胞，并使细胞经历三次冷冻/融化。然后将悬浮液以15,000rpm离心15分钟，并收集上清液，并用于定量和测定治疗性蛋白质。

[0352] 根据制造商的方法，使用人KCNMA1/BK ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan BioScieces Cat.LS‑F38925,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定KCNMA1蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。

[0353] 为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的KCNMA1蛋白的参考样本构建。敏感性为至少0.65pg/ml(0.00065ng/ml)，测量范围‑从1.23pg/ml至100pg/ml(0.00123‑0.1ng/ml)。将R‑3.0.2用于对结果进行统计学处理并进行数据可视化(https://www.r‑project.org/)。测定结果的图表显示在图10中。

[0354] 图10显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染HBdSMc人膀胱平滑肌细胞导致KCNMA1蛋白质浓度增加，证实了所述载体渗入真核细胞并在蛋白质水平上表达KCNMA1基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1以便于提高真核细胞中KCNMA1基因的表达水平的可行性。

[0355] 实施例15.

[0356] 使用携带CGRP基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP以便于提高哺乳动物细胞中CGRP蛋白的表达的功效和可行性的证据。

[0357] 在用携带人CGRP基因的DNA载体VTvaf17‑CGRP转染原代海绵体阴茎平滑肌细胞培养物后，对这些细胞的裂解液中CGRP蛋白浓度的变化进行评价。如实施例9所述获得细胞。

[0358] 将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少CGRP基因的cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人CGRP基因的DNA载体VTvaf17‑CGRP(C)用作转染剂。根据实施例11所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和人原代阴茎海绵体平滑肌细胞的转染。

[0359] 转染后，将细胞用PBS冲洗三次，并然后将1ml的PBS添加至细胞，并使细胞经历三次冷冻/融化。然后将悬浮液以15,000rpm离心15分钟，并收集上清液，并用于定量和测定治疗性蛋白质。

[0360] 使用针对降钙素基因相关肽(CGRP)的ELISA试剂盒(Cloud‑Clone Corp.Cat.CEA876Hu,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定CGRP蛋白，其中使用
ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。

[0361] 为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的CGRP蛋白的参考样本构建。敏感性为至少5.35pg/ml(0.00535ng/ml)，测量范围‑从12.35pg/ml至1000pg/ml(0.001235‑1ng/ml)。将R‑3.0.2用于对结果进行统计学处理并进行数据可视化(https://www.r‑project.org/)。测定结果的图表显示在图11中。

[0362] 图11显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP转染人原代阴茎海绵体平滑肌细胞导致CGRP蛋白质浓度增加，证实了所述载体渗入真核细胞并在蛋白质水平上表达CGRP基因的能力。呈现的结果还证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑CGRP以便于提高真核细胞中CGRP基因的表达水平的可行性。

[0363] 实施例16.

[0364] 使用携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的功效和可行性的证据，以便于提高人细胞中NOS2蛋白的表达。

[0365] 为证实携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的功效及其使用的可行性，在注射携带人NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2后，对人皮肤中的NOS2蛋白浓度的变化进行评价。

[0366] 为分析NOS2蛋白浓度的变化，将携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2注射入三名患者的前臂皮肤中，其中同时注射的安慰剂是缺少NOS2基因的cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。

[0367] 患者1，男性，66岁(P1)；患者2，女性，67岁(P2)；患者3，男性，62岁(P3)。将聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内jetPEI(Polyplus Transfection,France)用作运输系统。将含有NOS2基因的cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2和基因疗法DNA载体VTvaf17用作不含有NOS2基因cDNA的安慰剂，将其溶解于无菌的无核酸酶的水中。为获得基因构建体，根据制造商的建议制备DNA‑cGMP级体内jetPEI复合物。

[0368] 对于每种遗传构建体，以1mg的量，使用通道方法(其中30G针至1.5mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的可注射的体积是0.3ml。每个遗传构建体的注射的点位于前臂位点处的8至10cm间隔处。

[0369] 在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后，在第2天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从注射携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者皮肤中，以及从完整皮肤(III)中取生检样本将生检位点中患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有50mM Tris‑HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、和1mM苯甲基磺酰化氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液，并使用针对一氧化氮合酶2，诱导型(NOS2)的ELISA试剂盒(Cloud‑Clone Corp.Cat.SEA837Hu,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定治疗性蛋白质，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry 
Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。

[0370] 为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的NOS2蛋白的参考样本构建。敏感性为至少54pg/ml(0.057ng/ml)，测量范围‑从156pg/ml至10000pg/ml(0.156‑10ng/ml)。

[0371] 图12显示与缺少人NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的NOS2蛋白浓度相比，在携带人NOS2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的注射部位中所有三名患者的皮肤中NOS2蛋白浓度增加，表明基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的功效，并且证实其使用的可行性(特别是在人组织中皮内注射基因疗法DNA载体后)。

[0372] 实施例17.

[0373] 使用携带NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3以便于提高人细胞中NOS3蛋白的表达的功效和可行性的证据。

[0374] 为证明携带NOS3治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3的功效及其使用的可行性，在注射携带治疗性基因(即人NOS3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3后，对人肌肉组织中NOS3蛋白浓度的变化进行评估。

[0375] 为分析NOS3蛋白浓度的变化，将携带NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3与运输分子注射入三名患者的皮肤中，其中同时注射的安慰剂是缺少NOS3基因的cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17与运输分子。

[0376] 患者1，女性，60岁(P1)；患者2，男性，62岁(P2)；患者3，男性，63岁(P3)。将聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内jetPEI(Polyplus Transfection,France)用作运输系统；根据制造商的建议，进行样品制备。

[0377] 对于每种遗传构建体，以1mg的量，使用通道方法(其中30G针至约10mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3的可注射的体积是0.3ml。每个遗传构建体的注射的点位于8至10cm间隔的中间处。

[0378] 在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后，在第2天取生检样本。使用皮肤生检装置MAGNUM(BARD,USA)，从注射携带NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者肌肉组织，以及腓肠肌的完整部位(III)取生检样本。将生检位点中患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约20mm3，并且重量为高达22mg。将样本放置于含有50mM Tris‑HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、和1mM苯甲基磺酰化氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗性蛋白质。

[0379] 如实施例12所述，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定NOS3蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。

[0380] 测定结果的图表显示在图13中。

[0381] 图13显示与缺少人NOS3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的NOS3蛋白浓度相比，在携带治疗性基因(即NOS3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3的注射部位中所有三名患者的腓肠肌中NOS3蛋白浓度增加，表明基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS3的功效，并且证实其使用的可行性(特别是在人组织中肌内注射基因疗法DNA载体后)。

[0382] 实施例18.

[0383] 使用携带KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1以便于提高哺乳动物组织中KCNMA1蛋白的表达水平的功效和可行性的证据。

[0384] 在海绵窦内阴茎注射基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1后，对海绵体阴茎生检中KCNMA1蛋白浓度的变化进行评价。

[0385] 根据制造商的说明书，制备构成DNA载体与基于聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内jetPEI(Polyplus Transfection,France)的运输系统的混合物的注射用溶液。可注射的体积是0.75ml，其中DNA浓度为1μg/μl。通过使用30G针，其中注射点位于彼此相距近1cm处，注射三次，将携带KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1海绵窦内注射入右侧海绵体阴茎中。通过使用30G针，其中注射点位于彼此相距近1cm处，注射三次，将基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)海绵窦内地注射入左侧海绵体阴茎中。在注射基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1和安慰剂后，为了确保质粒在注射区域保留的最大可能时间，在阴茎根部施加压迫止血带20分钟。

[0386] 在注射基因疗法DNA载体后第2天，取生检样本。使用皮肤生检装置MAGNUM(BARD,USA)，从注射携带KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者海绵体阴茎，以及海绵体阴茎的完整部位(III)取生检样本。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有50mM Tris‑HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、和1mM苯甲基磺酰化氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定如实施例14所述的治疗性蛋白质。

[0387] 测定结果的图表显示在图14中。

[0388] 图14显示与对照组II(安慰剂)和对照组III(完整部位)相比，观察到来自携带KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1的注射部位的人海绵体阴茎生检中KCNMA1蛋白浓度的增加。所获得的结果显示海绵窦内注射基因疗法DNA载体的功效和用于上调哺乳动物组织中治疗性蛋白质的表达水平的使用的可行性。

[0389] 实施例19.

[0390] 携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的功效及其通过注射用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染的自体成纤维细胞使用以提高人组织中NOS2蛋白的表达水平的可行性的证据。

[0391] 为证实携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的功效及其使用的可行性，在注射用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染的相同患者的自体成纤维细胞培养物后，在患者皮肤中对NOS2蛋白浓度的变化进行评价。

[0392] 将用携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染的适合的自体成纤维细胞培养物注射入患者的前臂皮肤，同时注射处于用不携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的自体成纤维细胞培养物形式的安慰剂。

[0393] 从患者皮肤生检标本中分离人原代成纤维细胞培养物。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从受紫外线保护的区域(即耳后或在肘内侧)的皮肤取生检标本。生检样本为大约10mm并且大约11mg。将患者的皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。在37℃下，在5％CO2的存在下，将原代细胞培养物培养在含有10％胎牛血清和100U/ml氨苄西林的DMEM培养基中。每2天进行培养物培养基的传代和更换。培养
4
物生长的总持续时间不超过25‑30天。然后从细胞培养物中取等分试样的5×10个细胞。将患者的成纤维细胞培养物用携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2或安慰剂(即不携带NOS2治疗性基因的VTvaf17载体)转染。

[0394] 根据制造商的说明书，使用阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺JETPEI(Polyplus transfection,France)进行转染。将细胞培养72小时，并然后注射入患者。使用通道方法(其中13mm长的30G针至大约3mm的深度)，在前臂中进行用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染的患者的自体成纤维细胞培养物和用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的患者的自体成纤维细胞培养物(作为安慰剂)的注射。在注射的悬浮液中经修饰的自体成纤维细胞的浓度为大约5ml的细胞/1ml悬浮液，所注射的细胞的剂量不超过15mln。自体成纤维细胞培养物的注射的点位于8至10cm间隔处。

[0395] 在注射用携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2和安慰剂转染的自体成纤维细胞培养物后，在第4天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从注射用携带治疗性基因(即NOS2基因)的基因疗法DNA载体
VTvaf17‑NOS2转染的自体成纤维细胞培养物(C)、用不携带NOS2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的自体成纤维细胞培养物(安慰剂)(B)的部位的患者皮肤中，以及从完整皮肤部位(A)取生检。将生检位点中患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有50mM Tris‑HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、和1mM苯甲基磺酰化氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定如实施例11所述的治疗性蛋白质。

[0396] 测定结果的图表显示在图15中。

[0397] 图15显示与用不携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位的NOS2蛋白浓度相比，用携带NOS2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位中患者皮肤的区域中NOS2蛋白的浓度增加，表明基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的功效及其使用以便于提高人组织中NOS2的表达水平(特别是在向皮肤中注射用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2转染的自体成纤维细胞后)的可行性。

[0398] 实施例20.

[0399] 使用携带KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1以便于提高哺乳动物细胞中KCNMA1蛋白的表达的功效和可行性的证据。

[0400] 为证实携带KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1的功效，与用不携带人KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)转染的BEND参考细胞相比，在用携带人KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染后48小时，BAOSMC牛主动脉平滑肌细胞(Genlantis)中KCNMA1治疗性基因的mRNA累积的变化。

[0401] 在添加了高达10％的牛血清(Paneco,Russia)的牛平滑肌细胞生长培养基(Sigma B311F‑500)中培养BAOSMC牛主动脉平滑肌细胞培养物(Genlantis)。如实施例9所述，进行携带人KCNMA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1和DNA载体VTvaf17的转染、RNA提取、反转录反应、PCR扩增、和数据分析。将GenBank数据库中编号AH001130.2下列出的公牛/奶牛肌动蛋白基因(ACT)用作参考基因。

[0402] 测定结果的图表显示在图16中。

[0403] 图16显示用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染的BAOSMC牛主动脉平滑肌细胞的结果是cDNA扩增子比在细胞的参考样本中累积更快，这表明在用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1转染后，细胞中人KCNMA1基因的mRNA水平更高。所呈现的结果证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17‑KCNMA1以便于提高哺乳动物中KCNMA1基因的表达水平的可行性。

[0404] 实施例21.

[0405] 携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP，其生产方法。

[0406] 构建用于在工业规模上生产携带选自以下基因的组：NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP的治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的菌株，即分别携带基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP，供其生产，允许无抗生素选择，所述构建方法涉及制备大肠杆菌菌株SCS110‑AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或DNA载体VTvaf17‑NOS3、或DNA载体VTvaf17‑VIP、或DNA载体VTvaf17‑KCNMA1、或DNA载体VTvaf17‑CGRP对这些细胞进行电穿孔。之后，将所述细胞倒入具有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖、和10μg/ml氯霉素。其中，产生大肠杆菌菌株SCS110‑AF以生产基因疗法DNA载体VTvaf17或基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，允许无抗生素阳性选择，这涉及构建含有允许无抗生素阳性选择的转座子Tn10调控元件RNA‑IN的64bp线性DNA片段；1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含有蔗糖的培养基内进行选择)、选择发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR和两个同源序列329bp和233bp(确保与基因失活同时的基因recA的区域中的同源重组)，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并且选择在含有10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆。用于生产的所获得的菌株按以下登记号包括于国家生物资源中心(National Biological Resource Centre)‑俄罗斯国家工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(NBRC RNCIM)，英国的RF和NCIMB专利保藏服务的保藏物中：大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2‑登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B‑13323下，保藏日期12.12.2018，国际保藏单位编号NCIMB 43244，保藏日期08.11.2018；大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3‑登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B‑13255下，保藏日期24.09.2018，国际保藏单位编号NCIMB 43206，保藏日期20.09.2018；大肠杆菌菌株大肠杆菌SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP‑登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B‑13252下，保藏日期24.09.2018，国际保藏单位编号NCIMB 43204，保藏日期20.09.2018；大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1‑登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B‑13257下，保藏日期24.09.2018，国际保藏单位编号NCIMB 43205，保藏日期20.09.2018；大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP‑登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B‑13277下，保藏日期16.10.2018，国际保藏单位编号NCIMB 43306，保藏日期13.12.2018。

[0407] 实施例22.

[0408] 用于扩大携带治疗性基因(选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP的组)的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体到工业规模的方法。

[0409] 为证实基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2(SEQ ID No.1)、或VTvaf17‑NOS3(SEQ ID No.2)、或VTvaf17‑VIP(SEQ ID No.3)、或VTvaf17‑KCNMA1(SEQ ID No.4)、或VTvaf17‑CGRP(SEQ ID No.5)在工业规模上的可生产性和可构建性，对各自包含携带治疗性基因(即NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP)的基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP进行大规模的发酵。每种大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP基于如实施例21所述的大肠杆菌菌株SCS110‑AF(Cell and Gene Therapy LLC,
United Kingdom)通过如下方法产生：用携带治疗性基因(即NOS2、或NOS3、或VIP、或KCNMA1、或CGRP)的基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP对该菌株的感受态细胞进行电穿孔，其中将转化的细胞在具有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中进一步接种，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、和6％蔗糖，并且进行个别克隆的选择。

[0410] 在10l发酵罐中进行携带基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的大肠杆菌SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2的发酵，随后提取基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2。

[0411] 对于大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2的发酵，制备含有(每10l的体积)：100g胰蛋白胨和50g酵母浸膏(Becton Dickinson,USA)的培养基；然后将培养基用水稀释至8800ml，并且在121℃下高压蒸汽处理20分钟，并然后添加1200ml 50％(w/v)蔗糖。之后，以100ml的体积，将大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2的种子培养物接种于培养物烧瓶中。将培养物在30℃下在摇床恒温箱中孵育16小时。将种子培养物转移至Techfors S生物反应器(Infors HT,Switzerland)中，并培养至稳定期。通过在600nm下测量培养物的光密度来控制该过程。将细胞在5,000‑10,000g下沉淀30分钟。去除上清液，并将细胞沉淀重悬浮于10％(按体积计)的磷酸盐缓冲盐水中。将细胞以5,000‑10,000g再次离心30分钟。去除上清液，将含有20mM TrisCl、1mM EDTA、200g/l蔗糖(pH 8.0)的溶液以1000ml的体积添加至细胞沉淀中，并且将混合物充分搅拌至匀化的悬浮液。然后添加卵溶菌酶溶液，至终浓度为100μg/ml。将混合物在冰上孵育20分钟，同时轻轻搅拌。然后添加2500ml 0.2M NaOH，
10g/l十二烷基磺酸钠(SDS)，将混合物在冰上孵育10分钟，同时轻轻搅拌，然后添加3500ml 
3M乙酸钠、2M乙酸(pH 5‑5.5)，并将混合物在冰上孵育10分钟，同时轻轻搅拌。将所得样品以15,000g或更高值离心20‑30分钟。将溶液小心倾析，通过粗滤器(滤纸)除去残余的沉淀物。然后，添加RNase A(Sigma,USA)至终浓度为20μg/ml，并且将溶液在室温下孵育过夜持续16小时。然后将溶液以15,000g离心20‑30分钟，并通过0.45μm膜过滤器(Millipore,USA)。然后，用100kDa膜(Millipore,USA)进行超滤，并用25mM TrisCl(pH 7.0)的缓冲溶液将混合物稀释至初始体积。这种操作进行了三至四次。将溶液施加到含有250ml DEAE Sepharose HP(GE,USA)的柱上，用25mM TrisCl(pH 7.0)平衡。上样后，将柱用三倍体积的相同溶液洗涤，并然后使用25mM Tris‑HCl(pH 7.0)的线性梯度洗脱基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2，以获得25mM Tris‑HCl(pH 7.0)，1M NaCl的溶液，柱体积的五倍。通过测量在260nm处的流出溶液的光密度来控制洗脱过程。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的色谱级分结合在一起，并使用Superdex 200(GE,USA)进行凝胶过滤。将柱用磷酸盐缓冲盐水平衡。通过测量在260nm处的流出溶液的光密度来控制洗脱过程，并通过琼脂糖凝胶电泳分析级分。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2的级分结合在一起，并储存在‑20℃下。为评价过程的再生产性，将指定的处理操作重复五次。以类似的方式进行大肠杆菌菌株
SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP的所有处理操作。

[0412] 终产物产量的处理再生产性和定量特性证实了基因疗法DNA载体VTvaf17‑NOS2、或VTvaf17‑NOS3、或VTvaf17‑VIP、或VTvaf17‑KCNMA1、或VTvaf17‑CGRP在工业规模上的生产性和构建性。

[0413] 因此，所产生的含有治疗性基因的基因疗法DNA载体可用于将其递送至由该基因编码的蛋白质表达减少或不足的人和动物细胞中，从而确保所希望的治疗性效果。

[0414] 本发明设定的目的，即构建基因疗法DNA载体，以提高NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的表达水平，结合以下特性：

[0415] I)上调真核细胞中治疗性基因表达的功效；

[0416] II)由于基因疗法DNA载体中不存在代表病毒基因组核苷酸序列的调控元件，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；

[0417] 由于基因疗法DNA载体中不存在抗生素抗性基因，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；

[0418] III)在工业规模上菌株的可生产性和可构建性；

[0419] IV)以及已经实现用于产生这些基因疗法DNA载体的携带这些基因疗法DNA载体的菌株的构建目的，

[0420] 这由以下实施例支持：

[0421] 对于项目I‑实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；

[0422] 对于项目II‑实施例1、2、3、4、5；

[0423] 对于项目III‑实施例1、2、3、4、5；

[0424] 对于项目IV‑实施例21、22。

[0425] 工业实用性

[0426] 以上列出的所有实施例证实了所提议的携带治疗性基因(选自NOS2、NOS3、VIP、KCNMA1、和CGRP基因的组)以便于提高这些治疗性基因的表达水平的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS2、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑NOS3、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑VIP、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑KCNMA1、或大肠杆菌菌株SCS110‑AF/VTvaf17‑CGRP，以及其在工业规模上的生产方法的工业实用性。

[0427] 缩写词表：

[0428] VTvaf17：缺少病毒基因组和抗生素抗性标记物(载体治疗性无病毒‑抗生素)序列的基因疗法载体

[0429] DNA：脱氧核糖核酸

[0430] cDNA：互补脱氧核糖核酸

[0431] RNA：核糖核酸

[0432] mRNA：信使核糖核酸

[0433] bp：碱基对

[0434] PCR：聚合酶链式反应

[0435] ml：毫升，

[0436] μl：微升

[0437] mm3：立方毫米

[0438] l：升

[0439] μg：微克

[0440] mg：毫克

[0441] g：克

[0442] μM：微摩尔

[0443] mM：毫摩尔

[0444] min：分钟

[0445] s：秒

[0446] rpm：每分钟转数

[0447] nm：纳米

[0448] cm：厘米

[0449] mW：毫瓦特

[0450] RFU：相对荧光单位

[0451] PBS：磷酸盐缓冲盐水

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