[0001] 本发明属于农业微生物领域，尤其是涉及一种临床分离副猪嗜血杆菌培养基及分离方法。

[0002] 副猪嗜血杆菌是猪群上呼吸道的一种常在菌，特定条件下可以侵入机体引起全身性疾病。发病猪多以纤维素性多发性浆膜炎、多发性关节炎和脑炎为主要特征。副猪嗜血杆菌(Haemophilus，HPS)属于需氧或兼性厌氧菌，最佳生长温度35‑37℃，pH7.6‑7.8，其菌落表面光滑，边缘整齐，灰白色半透明，针尖大小。HPS生长需依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，对培养条件要求非常严格，临床上分离非常困难。加拿大诊断实验室用回归法分析表明，无法确认采集的样品中是否存在副猪嗜血杆菌，及副猪嗜血杆菌不易培养的特性，严重影响该菌在临床上分离鉴定，因此，副猪嗜血杆菌在临床的真实发病率可能为报道的10倍之多。

[0003] HPS的分离对副猪嗜血杆菌病的的确诊极为重要，但往往临床不能成功分离，原因之一是HPS在体外生长条件极为苛刻，需要V因子等，对外界环境的抵抗能力很差，在外界环境或病死猪体内存活时间较短，4℃环境下可存活5日，甚至更短。同时，样本中混有猪链球菌、大肠杆菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，分离后由于混有其它生长优势病菌，HPS成长劣势不易存活，病料运输过程中存活率低，因此造成副猪嗜血杆菌感染的误诊和漏诊。因此，临床上迫切需要一种临床上分离HPS和运输疑似感染HPS病料的培养基及临床分离操作方法。

[0022] 除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0023] 下面结合实施例来详细说明本发明。

[0024] 实施例1临床分离副猪嗜血杆菌培养基的制备

[0025] 1、基础培养基制备方法

[0026] 1.1黄豆浸汁：取洗净黄豆适量，加入10倍质量的纯化水，混匀，室温浸泡24小时，取出上清液(黄豆还可食用)，经0.45um滤膜过滤，即为50％黄豆浸汁；

[0027] 1.2称取蛋白胨0.5％、葡萄糖0.1％、酵母粉1％、NaCl 0.5％、柠檬酸0.19％、Na2HPO4 2.66％，加800mL黄豆浸汁；

[0028] 1.3将1.2中溶液加热并不断搅拌至完全溶解；

[0029] 1.4将1.3中溶解后液体温度降至室温后，用氢氧化钠调节pH至7.3±0.2；

[0030] 1.5将1.4中液体用黄豆浸汁定容至1L；

[0031] 1.6将1.5中液体在121℃下灭菌15分钟，即为基础培养基。

[0032] 2、临床分离副猪嗜血杆菌培养基的制备

[0033] 2.1 0.5％对氨基苯甲酸溶液

[0034] 称取0.5％对氨基苯甲酸用纯化水定容至100mL，加热至完全溶解，用0.22um滤膜过滤除菌；

[0035] 2.2 10％硫酸镁溶液

[0036] 称取10％硫酸镁用纯化水定容至100mL，完全溶解后，121℃下灭菌15分钟；

[0037] 2.3 NAD溶液

[0038] 称取1％NAD，用纯化水定容至100mL，完全溶解后，用0.22um滤膜过滤除菌；

[0039] 2.4糖肽类抗生素溶液

[0040] 称取1％盐酸万古霉素或替考拉宁，用纯化水定容至100mL，完全溶解后，用0.22um滤膜过滤除菌；

[0041] 2.5蜂胶提取物

[0042] 称取4g蜂胶除杂后加入到100mL的80％乙醇中，40℃水浴加热下进行提取2小时，提取后收集提取液得到蜂胶提取物；

[0043] 2.6副猪嗜血杆菌培养基

[0044] 液体培养基：将1L基础培养基121℃灭菌后，温度降至室温，无菌加入10mL对氨基苯酸溶液、10mL硫酸镁溶液、2mL NAD溶液、10mL糖肽类抗生素溶液、10mL蜂胶提取物、40mL新生牛血清，将培养基分装到塑料瓶中，用螺口瓶盖，盖紧，每瓶50mL，2‑8℃保存，保存期为30日。

[0045] 斜面培养基：基础培养基加入1.5％琼脂，121℃灭菌后，温度降至55‑60℃，无菌加入10mL对氨基苯酸溶液、10mL硫酸镁溶液、2mL NAD溶液为、10mL糖肽类抗生素溶液、10mL蜂胶提取物、40mL新生牛血清，倾倒斜面，每支斜面8‑10mL，待斜面凝固后，置于2‑8℃保存，保存期为30日。

[0046] 上述对氨基苯甲酸不溶于水，且高温容易氧化，易溶于热水，单独配制后，再加入到培养基中，可发挥其功能。硫酸镁加入到培养基中其溶解性较差，单独溶解配制，再加入到培养基中，可发挥其功能。

[0047] 实施例2副猪嗜血杆菌临床分离操作方法

[0048] 1、材料如表1所示

[0049] 表1材料明细

[0050]序号 材料 规格 数量 保存
1 副猪嗜血杆菌培养基(琼脂) 1.5cm×20cm 20支 2‑8℃
2 副猪嗜血杆菌培养基 5cm×15cm 20瓶 2‑8℃
3 无菌棉签 50支 1包 常温
4 无菌刀片 1cm×2cm 2个 常温
5 无菌塑料镊 5cm 2个 常温
6 酒精棉球 50粒 1包 常温
7 标签纸 1cm×2cm 30个 常温
8 无菌手套 M号 4只 常温
9 说明书 / 1份 /

[0051] 2、样本采集

[0052] 应采集于未经抗生素治疗的急性期病猪，接近于死亡状态或刚刚死亡猪，如进行抗生素治疗，须注明治疗用抗生素种类和治疗周期、剂量等后进行病料采集；

[0053] 采集病料主要包括肺脏、淋巴结、关节液、心包液、胸腔积液、腹腔积液和脑脊液，浆膜表面物质、心脏血液；

[0054] 3、操作步骤

[0055] 3.1肺脏、淋巴结、浆膜表面物质：应用无菌刀片切成2‑3cm×3‑4cm，将其装入液体培养基中，盖紧瓶盖，标记；

[0056] 3.2血液、关节液等液体病料：用无菌棉签蘸取液体病料，直接在斜面培养基上划曲线，划完后，立即封口，标记；同时用注射器抽取液体病料，标记；

[0057] 3.3包装和运输

[0058] 包装：将采集好病料包装密封后，常温运输，如气温超过37℃加入冰袋，防止温度过高；

[0059] 运输：可通过汽车运输，时间不超过72小时；

[0060] 3.4注意事项

[0061] 样品采集环境应干净、无灰尘、无液体污染。操作过程应配戴手套和口罩；

[0062] 斜面培养基如表面有菌落生长或瓶盖松动，请勿使用；副猪嗜血杆菌液体培养基如浑浊，请勿使用；

[0063] 无菌棉签、刀片、镊子包装打开后应立即使用，对另一发病猪取样时应更换刀片和镊子，避免交叉污染；

[0064] 应严格按照说明书进行操作。

[0065] 样品采集后，如不能立即送出，禁止冷冻，常温保存。样品采集完成后到样品运输至实验室时间不超过72小时。

[0066] 4副猪嗜血杆菌分离

[0067] 经副猪嗜血杆菌16S rRNA引物进行扩增，验证病料中是否存在副猪嗜血杆菌。该引物扩增DNA片段长度为1090bp。引物序列及其对应副猪嗜血杆菌16S rRNA基因(GenBank accession no.M75065)序列位置如下：

[0068] 上游引物hpsF1，5’‑TATCGRGAGATGAAAGAC‑3’，R＝A/G，(182‑199bp)；

[0069] 上游引物hpsF2，5’‑GTAATGTCTAAGGACTAG‑3’，(178‑195bp)；

[0070] 下游引物hpsR，5’‑CCTCGCGGCTTCGTC‑3’，(1267‑1253bp)。

[0071] 实施例3临床分离副猪嗜血杆菌培养基与常规培养基的分离效果

[0072] 本发明临床分离副猪嗜血杆菌培养基和常规培养基的副猪嗜血杆菌分离率比如表2所示。

[0073] 常规培养基配方：市售TSA和TSB培养基，依据说明书制备培养基，加入20ug/mLNAD，加入10％新生牛血清。

[0074] 表2临床分离副猪嗜血杆菌培养基与常规培养基的分离结果

[0075]

[0076]

[0077] 由表1与图1数据显示，运输气温均在20‑35℃之间，12小时内，两种培养基均能分离到副猪嗜血杆菌，本发明培养基分离率明显高于常规培养基；12小时到24小时内，本发明培养基分离率在50％以上，而常规培养基在14％以内，远远低于本发明培养基，24小时到70小时，本发明培养基分离率为50％‑14％，而常规培养基无法分离到副猪嗜血杆菌。

[0078] 实施例4对氨基苯甲酸和硫酸镁的培养基的制备

[0079] 1、基础培养基制备方法

[0080] 1.1称取胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、NaCl 0.5％、加800mL纯化水；

[0081] 1.2将1.1中溶液加热并不断搅拌至完全溶解；

[0082] 1.3将1.2中溶解后液体温度降至室温后，用氢氧化钠调节pH至7.3±0.2；

[0083] 1.4将1.3中液体用纯化水定容至1L；

[0084] 1.5将1.4中液体在121℃下灭菌15分钟，即为基础培养基。

[0085] 2、对氨基苯甲酸和硫酸镁的培养基的制备

[0086] 2.1 0.5％对氨基苯甲酸溶液

[0087] 称取0.5％对氨基苯甲酸用纯化水定容至100mL，加热至完全溶解，用0.22um滤膜过滤除菌；

[0088] 2.2 10％硫酸镁溶液

[0089] 称取10％硫酸镁用纯化水定容至100mL，完全溶解后，121℃下灭菌15分钟；

[0090] 2.3 NAD溶液

[0091] 称取1％NAD，用纯化水定容至100mL，完全溶解后，用0.22um滤膜过滤除菌；

[0092] 2.4副猪嗜血杆菌培养基

[0093] 液体培养基：将1L基础培养基121℃灭菌后，温度降至室温，无菌加入10mL对氨基苯酸溶液、10mL硫酸镁溶液、2mLNAD溶液、100mL新生牛血清，将培养基分装到塑料瓶中，用螺口瓶盖，盖紧，每瓶50mL，2‑8℃保存，保存期为30日。

[0094] 斜面培养基：基础培养基加入1.5％琼脂，121℃灭菌后，温度降至55‑60℃，无菌加入10mL对氨基苯酸溶液、10mL硫酸镁溶液、2mLNAD溶液为、100mL新生牛血清，倾倒斜面，每支斜面8‑10mL，待斜面凝固后，置于2‑8℃保存，保存期为30日。

[0095] 实施例5临床分离副猪嗜血杆菌培养基与含有对氨基苯甲酸和硫酸镁的培养基的分离效果

[0096] 本发明临床分离副猪嗜血杆菌培养基和含有对氨基苯甲酸和硫酸镁的培养基的副猪嗜血杆菌分离率比如表3所示。

[0097] 表3临床分离副猪嗜血杆菌培养基与含有对氨基苯甲酸和硫酸镁的培养基的分离结果

[0098]

[0099]

[0100] 注：同一病猪的病料均分为2份于不同培养基中，同时进行运输。

[0101] 常规培养基中加入对氨基苯甲酸和硫酸镁，与本发明培养基进行副猪嗜血杆菌分离率对比，运输温度在18‑25℃之间，运输时间在12小时‑36小时，分离率为22.2％‑70％，而本发明培养基，运输温度在18‑25℃之间，运输时间在12小时‑36小时，分离率为44.4％‑90％。运输时间60小时以上，常规培养基中加入对氨基苯甲酸和硫酸镁分离率为0，而本发明培养基运输时间70小时，分离率为20％。

[0102] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。