[0001] 人、动物和植物的细菌感染的预防、诊断和治疗。

[0002] 细菌是单细胞的生物实体，大多数对人无害，不同类型中有不到百分之一会使人患病。许多细菌对人类都是有益的，例如那些有助于消化食物、破坏致病细胞和提供所需维生素的细菌。

[0003] 传染性细菌(有害的那百分之一)会导致人和动物患病。它们在体内快速繁殖并产生可导致组织损伤和疾病的有毒蛋白。

[0004] 噬菌体(也称为细菌噬菌体)由Ernest Hankin于1896年发现，并被用作对抗霍乱的抗菌剂。这些细菌特异性的病毒可以感染并破坏细菌细胞。

[0005] 噬菌体由包裹着DNA或RNA基因组的蛋白组成。通过将其病毒遗传物质(DNA或RNA)注入到宿主细胞中，噬菌体可以在细菌内复制，从而有效地接管细胞的功能，用以产生子代噬菌体，从而导致细胞壁破裂和随后的细菌细胞死亡。

[0006] 直到1930年代，噬菌体一直被用作抗菌剂。然而，发现细菌自然地产生对噬菌体的抗性。随着化学抗生素的引入，人们放弃了使用噬菌体。

[0007] 尽管抗生素是通常的治疗手段，但赋予抗生素抗性的细菌突变在全世界的致病性细菌中变得越来越普遍。例如，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)细菌是一种越来越常见的感染形式，通常通过医院内传播而获得。使用常规抗生素很难治愈MRSA感染。

[0008] 噬菌体能够对引起疾病的细菌物种非常具有特异性。大多数噬菌体具有使其能够结合目标细菌表面特定分子的结构。

[0009] 噬菌体的关键优势在于它们能够消除对抗生素具有抗药性的细菌，而无需使人、动物和环境暴露于毒性越来越大的抗生素、或有害或刺激性的化学品(例如，参见Intralytix的美国专利6,699,701号)。

[0010] 在自然环境中，可以按照成对关系从特定细菌生长的环境中分离出噬菌体，例如从污水或粪便中进行分离。已经创建了不同类型的天然噬菌体的储存库，以提供对可治疗由特定细菌物种造成的难治性感染的噬菌体。

[0011] 使用噬菌体的一个问题是，患者自体通常会对噬菌体产生免疫反应，并从血液中清除噬菌体。美国专利No.5,660,812号、美国专利No.5,688,501号、美国专利5,811,093号和美国专利5,766,892号均显示了选择或产生(利用突变)噬菌体以改善待在治疗患者血液中噬菌体半衰期的方法。

[0012] 与先前使用噬菌体消灭或治疗细菌污染或疾病有关的另一个问题是细菌可变得对噬菌体具有抗性。细菌中例如原噬菌体的存在可阻断来自感染性噬菌体的基因表达，从而阻止了该感染性噬菌体的复制并阻止了对细菌的裂解和杀死。原噬菌体还可能引起对进入的噬菌体DNA的破坏。

[0013] 这在以前意味着要么噬菌体需要与细菌匹配(通常需要对细菌进行复杂的遗传分析)，要么需要将多种不同的噬菌体组合使用。WO 03/080823中公开了不同噬菌体的组的生产，例如衍生自温和噬菌体的vir突变体的组。

[0014] 当前，仅存在天然的噬菌体、和已经被突变并针对某些细菌进行特异性选择的天然的噬菌体(参见，例如，Intralytix的美国专利8,685,697号)。

[0064] 除非另外指出，否则本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法来执行，并且如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。

[0065] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中通常可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三个字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来指代。每种蛋白或多肽可具有独特的功能。本发明包括多肽及其功能片段，以及具有相同生物学功能或活性的突变体和变体。

[0066] 在一些实施方式中，如果聚合分子(例如，多肽序列或核酸序列)的序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性，则该聚合分子被认为彼此“同源”。

[0067] 在一些实施方式中，核酸序列的片段是开放阅读框序列的片段。在一些实施方式中，这样的片段编码由开放阅读框核苷酸序列编码的蛋白的多肽片段(如本文所定义)。

[0068] 如本文所用，术语“核酸片段”是指具有缺失的核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列的片段是开放阅读框序列的片段。在一些实施方式中，这样的片段编码由开放阅读框核苷酸序列编码的蛋白的多肽片段(如本文所定义)。

[0069] 术语“构建体”是指与启动子和/或其他调节序列可操作连接的编码蛋白的核酸序列。

[0070] 术语“基因组序列”是指具有不连续的开放阅读框的序列，其中内含子中断了蛋白编码区。

[0071] 如本文所用，当在指定核酸的上下文中使用时，术语“使编码”、“编码”或“被编码”(“encoding”、“coding”或“encoded”)是指核酸包含指导核苷酸序列翻译成指定蛋白的必要信息。通过密码子的使用来指定编码蛋白的信息。编码蛋白的核酸可以在核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如，内含子)，或者可以缺少这样的中间非翻译序列(例如，在cDNA中)。

[0072] 在核酸序列的上下文中，术语“序列同一性百分比”或“同一”是指两个序列中的残基在比对以获得最大对应性时是相同的。例如，可以使用计算机程序BLAST(Altschul等,J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Gish和States,Nature Genet.3：266-272(1993)比较多核苷酸序列。

[0073] 当提及核酸或其片段时，术语“基本同源性”或“基本相似性”表示当与另一种核酸(或其互补链)以适当的核苷酸插入或缺失进行最佳比对时，通过任何公知的序列同一性算法(例如上述BLAST)测定，有至少约70％、80％、85％或至少约90％，或至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列同一性。

[0074] 如本文所用，“异源核酸序列”是通常不存在的位于基因组中位置的任何序列。在一些实施方式中，异源核酸序列是天然噬菌体序列，不过来自不同噬菌体。

[0075] 特定的核酸序列还涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。因此，本文公开的编码蛋白序列的核酸序列也涵盖本文所述的其修饰变体。本发明的基本上相似的核酸片段的特征还可在于它们编码的氨基酸序列与本文公开的氨基酸序列的同一性百分比(根据本领域技术人员通常采用的算法所确定)。

[0076] “源噬菌体”是从自然或人工环境中分离的噬菌体，未经基因工程改造。“突变体噬菌体”是包含已经通过将异源核酸序列插入到基因组中而进行遗传修饰的基因组的噬菌体，或该噬菌体的基因组。在一些实施方式中，通过重组DNA技术修饰源噬菌体的基因组，以将异源核酸序列在限定的位点引入基因组。

[0077] “可操作地连接”或“可操作连接”的表达控制序列是指这样的连接：其中表达控制序列与目的编码序列邻接以控制目的编码序列的表达，以及反式作用的表达控制序列，或以一定距离控制编码序列的表达。

[0078] “编码序列”或“开放阅读框”是编码多肽或蛋白的核苷酸序列。编码序列的末端是起始密码子和终止密码子。本公开还包括编码蛋白的天然、分离或重组的核酸序列，以及包含该蛋白的编码序列的载体和/或(宿主)细胞。

[0079] 本发明还涵盖所公开的核苷酸序列的片段和变体以及由其编码的蛋白。“片段”意图指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分，以及因此指由其编码的蛋白。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白的生物学活性的蛋白片段。因此，本公开涉及任何核酸片段，其包含编码其所编码的全部或大部分氨基酸序列的核苷酸序列。

[0080] 本技术使用合成生物学来产生能够结合特定细菌菌株的噬菌体。由于噬菌体必须黏附在宿主细菌细胞上以启动对细菌的感染，因此病毒DNA或RNA中的基因选择或操作可以定义结合特征，从而使宿主细胞的范围超出了自然配对关系。根据一个实施方式，所公开的噬菌体具有一些特征，包括以下特征。

[0081] 噬菌体安全、无腐蚀和无毒。可以对噬菌体进行工程化，以使其不影响有用的细菌、动物或人细胞。因此，不会像抗生素那样干扰食物链。

[0082] 所述噬菌体是经过设计的，不是自然界发现的。因此，该技术适用于任何细菌感染。消除了不合需要的遗传成分。相反，分离特定细菌的天然噬菌体的现有方法就像为目标细菌“大海捞针”。

[0083] 对噬菌体进行工程化，以避免靶细菌发生突变/适应，从而导致较高的杀灭率且无耐受性。因此，所述噬菌体具有优于已知噬菌体的功效。噬菌体还防止生物膜形成。

[0084] 根据一个实施方式，平台是通用的。所公开的噬菌体可用于解决任何细菌问题。所公开的噬菌体可应用于人类健康(个性化药物、消毒剂和诊断)，例如在MRSA和VRE中；动物健康(畜牧医学、诊断)，例如用于治疗中间葡萄球菌的狗耳感染的滴耳剂；以及食品安全(对细菌污染产生清洁、检测)，例如大肠杆菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌和李斯特菌。

[0085] 根据一个实施方式，噬菌体不仅可以用于治疗抗药性细菌感染，而且可以用于预防环境和食物中可能对人和动物健康产生负面影响的细菌污染。

[0086] 例如，噬菌体可用于人类健康。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)细菌是一种越来越常见的医院获得性感染，通常通过接触被污染的表面而获得。对于具有已确认MRSA问题的设施，该产品可用于彻底清洁表面并减少新感染的发生。根据实施方式，提供了一种多菌株MRSA特异性消毒清洁剂，其可用于医院的多孔和无孔表面，包括床、窗帘、桌、椅、诊断和监测设备、以及医疗器械。

[0087] 根据实施方式，所公开的噬菌体可以用于减少或消除使人和/或动物致病的任何细菌和/或抗性细菌。在某些方面，使用这种消毒剂相对于诸如漂白剂等常用消毒剂具有多个优点。首先，噬菌体比常规方法更有效地破坏细菌。其次，噬菌体可以留在表面上存活约24小时，以破坏新的细菌污染事件。第三，与漂白剂不同，噬菌体不会留下腐蚀性残留物，因此不会伤害仪器、织物和皮肤。第四，与清洁液不同，针对有害细菌定制的噬菌体是无毒的。

[0088] 噬菌体也可用于动物健康治疗。例如，专门设计噬菌体替代常用的抗生素来应对鸡的细菌感染，从而产生了无抗生素的鸡，这在当今市场上有商业利益。这种治疗还有助于减少数量增长的由于细菌突变和进化为不受抗生素影响而发生的耐抗生素感染。

[0089] 噬菌体也可用于食品安全。例如，可以将噬菌体清洁喷雾剂施用到农作物上，以防止植物栽培或收获过程中的细菌污染，诸如草莓的大肠杆菌污染所导致的食源性疾病。

[0090] 利用模板技术产生具有各种特异性结合域(从而选择宿主范围)的噬菌体。该技术可提供高浓度的噬菌体。

[0091] 在一些实施方式中，源自噬菌体的基因产物可用于“自外裂解”，由此可以使细菌在不必被感染的情况下被消除。

[0092] 根据实施方式，提供了一种在无需事先用噬菌体对细菌污染物进行感染的情况下消除细菌污染物的方法，该方法包括获得一种或跟多种由所公开的噬菌体产生的裂解酶；将一种或更多种裂解酶应用于细菌污染物以消除细菌污染物。

[0093] 噬菌体或细菌噬菌体被定义为感染细菌的病毒。噬菌体对其相应的宿主细菌具有高度特异性。为了感染细菌，噬菌体黏附于在细菌表面上的特定受体。这种黏附决定了每个噬菌体的宿主范围，通常仅限于一些属、种甚至亚种的细菌。这种噬菌体特异性可以为临床医生、实验室技术人员、该领域的技术人员、以及消费者提供通过利用这种噬菌体特性来鉴定(检测或诊断)特定类型细菌的能力。

[0094] 噬菌体经历两种类型的自然生命周期或病毒繁殖方法，称为裂解周期和溶原性周期。在裂解周期中，病毒体复制后宿主细胞将被破坏并死亡。相比之下，溶原性周期不会导致宿主细胞立即裂解和随后的宿主细胞死亡；相反，噬菌体基因组与宿主DNA整合，或将自身建立为质粒，并随生物体的基因组一起复制。内源噬菌体保持休眠状态，直到宿主暴露于特定条件下(例如，压力)，此时噬菌体可以被激活，从而开始繁殖周期，导致宿主细胞裂解。

[0095] 内溶素在噬菌体裂解周期的最后阶段从其宿主体内产生，大部分释放到周质空间中(Borysowski等，2006)。从那里开始，内溶素裂解肽聚糖中的共价键以释放病毒子代(Fischetti，2008)。在内溶素亚组中有五类：酰胺酶、内肽酶、胞壁质酶、氨基葡萄糖苷酶和转糖基酶(Gasset，2010)。

[0096] 根据实施方式，提供了来自细菌病毒的裂解酶或抗生酶在对抗抗微生物剂抗性中的应用。抗生酶被定义为降解细菌细胞壁的蛋白，这意味着它不会受到噬菌体蛋白的影响(Borysowski和Gorski，2010)。术语“抗生酶”首先在论文‘Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using bacteriophage lytic enzyme’(Nelson等，2001)中提出。噬菌体裂解酶具有特异性。噬菌体衍生的裂解酶及其对致病性细菌菌株中发现的细胞壁某些成分有破坏性活性，但对动物的天然微生物群却没有破坏性(Gasset.2010)。两个实例包括C型的链球菌溶素，其可有效溶解A型的链球菌，但对正常的口腔链球菌没有影响(Fischetti，2006)。通过使用通常在致病性革兰氏阴性大肠杆菌中表达的外膜蛋白FyuA，可以得到更相关的实例。FyuA结合域与T4溶菌酶的融合导致融合物从外膜转移到周质空间，在此溶菌酶能够破坏细菌细胞壁的稳定性(Lukacik等，2013)

[0097] 根据一个实施方式，公开了一种提供内溶素蛋白或多种内溶素蛋白的方法，其克服了采用完整噬菌体的问题。一种或多种内溶素特异性地从细胞内或细胞外靶向并降解细菌细胞壁(肽聚糖)，从而导致裂解。在各方面中，提供了一种方法，该方法从多种噬菌体中产生内溶素基因的各种克隆，并使用高通量筛选和评估内溶素克隆对抗一种或多种细菌例如大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌和空肠弯曲菌的成功性。

[0098] 因此，该技术扩展了可以在有或没有感染的情况下以噬菌体或噬菌体基因产物处理的细菌菌株的数量。

[0099] 噬菌体通过感染和杀死细菌而使自己倍增。在此过程中，细菌细胞壁成分随噬菌体一起释放。这些成分可能对人、动物和细菌有毒。因此，使用细菌大规模制备噬菌体需要使用刺激性有机化学物质的制造后处理，以将毒性降低至临床治疗可接受的水平。

[0100] 因此，根据一个实施方式，提供了一种通过使用酵母菌株，例如乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母来生长所公开的在细菌大规模使用中的噬菌体的方法。所公开的方法避免了有毒终产物的释放。

[0101] 产生突变体噬菌体

[0102] 分离环境样品并进行充分表征，以确定符合某些标准的候选样品。优选地，从包括一个或多个以下特征的候选物中选择合适的源噬菌体：

[0103] -裂解性噬菌体；

[0104] -遗传上与已知噬菌体不同；和

[0105] -仅携带一个黏附基因。

[0106] 根据实施方式，提供了一种遗传修饰一种或多种合适的源噬菌体的方法。

[0107] 在一个实施方式中，源噬菌体包括一个黏附基因。在另一个实施方式中，源噬菌体包括多于一个黏附基因。

[0108] 在一个实施方式中，该方法产生噬菌体平台，该噬菌体平台被配置为允许进一步交换一种或多种所需蛋白，例如黏附蛋白。

[0109] 根据一个实施方式，操纵噬菌体基因组以改变病毒的生命周期，产生功能获得、功能丧失或用于病毒鉴定(报告基因)。总结如图1所示。

[0110] 一方面，源噬菌体是裂解性噬菌体。一方面，源噬菌体是携带一个或多个黏附基因的裂解性噬菌体。在另一方面，源噬菌体是仅携带一个黏附基因的裂解性噬菌体。一方面，源噬菌体仅携带一个黏附基因。

[0111] 根据一个实施方式，提供了一种生产突变体噬菌体的方法。一方面，该方法包括修饰源噬菌体的噬菌体结合位点，以使突变体噬菌体能够黏附于不同的血清型。在一个实施方式中，随后复活突变体噬菌体并确定新的结合域。

[0112] 根据一个实施方式，工程化噬菌体仅包含裂解基因，其中任何和所有溶原基因已被去除以确保不会发生整合。

[0113] 根据一个实施方式，提供了一种“无细胞克隆”的方法，以提供模板(或平台)技术，其允许修饰/插入/缺失病毒基因。该平台使用分离的环境样品通过构建突变体噬菌体(定义为由已知和未知遗传密码生成的噬菌体)而生成。

[0114] 相对于已知的噬菌体类型，对来自环境样品的未知噬菌体类型进行测试基因对比，从而使我们能够分离出已知的基因类型。

[0115] 在一个实施方式中，提供了一种突变体噬菌体，其中添加了感兴趣的基因，并且其中缺失了不合乎需要的基因。连同非编码区，突变体噬菌体是携带至少两个独特的开放阅读框(ORF)的遗传平台。

[0116] 这些独特的ORF可用于添加感兴趣的基因。参考图2，将基因组互补物分成通过PCR扩增获得的与相邻片段有重叠部分的片段。将外源基因插入各自的片段内。采用同源重组方法，使用细菌细胞提取物将片段合并在一起，其中提取物包含必要的成分，以通过同源性将片段连接在一起成为一个连续的片段。通过无细胞翻译可从完全组装的基因组中拯救噬菌体。该方法涉及将选择的DNA与大肠杆菌的无毒细胞提取物以及氨基酸和能量混合在一起，提取物中的转录和翻译蛋白和酶驱动该DNA的表达，从而导致噬菌体的产生。

[0117] 在各方面，突变体噬菌体是携带四个独特的开放阅读框(ORF)的遗传平台。

[0118] 在一个实施方式中，第一ORF可用于插入用于细菌的黏附基因。一方面，黏附基因可以选自但不限于以下蛋白：

[0119] ·肠杆菌科的DNA结合噬菌体蛋白(>CP007523.1：3585236-3586111沙门氏菌肠亚种，肠型鼠伤寒杆菌str.CDC 2011K-0870，完整基因组)SEQ ID No：125

[0120] ·DNA结合噬菌体蛋白(>CP002910.1：3892390-3893265肺炎克雷伯菌KCTC 2242,完整基因组)SEQ ID No：126

[0121] ·DNA结合蛋白(>CM000724.1：300852-301217蜡状芽孢杆菌BDRD-ST26染色体，全基因组鸟枪法测序)SEQ ID No：127

[0122] ·噬菌体DNA结合转录调节物(>CP003678.1：c575894-575136肠杆菌阴沟亚种溶解型SDM,完整基因组)SEQ ID No：128

[0123] ·噬菌体ssDNA结合蛋白(>CP009983.1：941901-942146副溶血性弧菌菌株FORC_008染色体2，完整序列)SEQ ID No：129

[0124] ·DNA结合蛋白(>CM000749.1：288493-288840苏云金芽孢杆菌，T04001染色体，全基因组鸟枪法测序)SEQ ID No：130

[0125] ·噬菌体核苷酸结合蛋白(>CP006620.1：c2486999-2486259粪肠球菌Aus0085,完整基因组)SEQ ID No：131

[0126] ·DNA结合蛋白噬菌体P4(>AE005174.2：318190-318450大肠杆菌O157：H7 str.EDL933基因组)SEQ ID No：132

[0127] ·CP4-6原噬菌体；推定的DNA结合转录调节物(>HG738867.1：c269405-268512大肠杆菌str.K-12substr.MC4100完整基因组)SEQ ID No：133

[0128] ·DNA结合蛋白(假伯克氏菌K96243染色体1，完整序列)SEQ ID No：134[0129] ·推定的DNA结合噬菌体蛋白(>AL590842.1：c1239408-1238512鼠疫耶尔森菌CO92完整基因组)SEQ ID No：135

[0130] ·推定的DNA结合噬菌体蛋白(>AL590842.1：1235071-1235391鼠疫耶尔森菌CO92完整基因组)SEQ ID No：136

[0131] ·推定的噬菌体相关DNA结合蛋白(>BX950851.1：4152092-4152508胡萝卜欧文氏菌亚种SCRI1043,完整基因组)SEQ ID No：137

[0132] 在一个实施方式中，第二ORF用于插入编码可用于克服细菌宿主防御的蛋白的基因。

[0133] 例如，第二ORF可以用于引入酶解功能来对抗细菌防御。一方面，第二ORF可用于添加细胞内溶素基因和/或生物膜降解基因。

[0134] 在实施方式中，细胞内溶素基因选自：

[0135] ·PP1噬菌体内溶素，SEQ ID No：138，其与大肠杆菌噬菌体B2相似：93％同一和100％查询覆盖率，登录号：MG581355；肠杆菌噬菌体JL1：92％同一和100％查询覆盖率，登录号：JX865427；志贺氏菌噬菌体EP23：91％同一和100％查询覆盖率，登录号：JN984867；苏达利菌噬菌体：91％同一和100％查询覆盖率，登录号：GQ502199；

[0136] ·PP2噬菌体内溶素，SEQ ID No：139，其与大肠杆菌噬菌体phiLLS相似：99％同一和100％查询覆盖率，登录号：KY677846；沙门氏菌噬菌体Stp1：98％同一和100％查询覆盖率，登录号：KY775453；沙门氏菌噬菌体SP01：98％同一和100％查询覆盖率，登录号：KY114934；T5噬菌体样叉29：97％同一和100％查询覆盖率，登录号：MF431732；

[0137] ·PP3噬菌体内溶素，SEQ ID No：140，其与肠杆菌噬菌体ATK48相似：99％同一和100％查询覆盖率，登录号：KT184310；志贺氏菌噬菌体SHSML-52-1：99％同一和100％查询覆盖率，登录号：KX130865；大肠杆菌噬菌体APCEc01：99％同一和100％查询覆盖率，登录号：KR422352.1；大肠杆菌O157分型噬菌体6：98％同一和100％查询覆盖率，登录号：
KP869104；志贺氏菌噬菌体Shf125875：98％同一和100％查询覆盖率，登录号：KM407600；志贺氏菌噬菌体phi25-307：98％同一和100％查询覆盖率，登录号：MG589383；克雷伯氏菌噬菌体vB_Kpn_F48：73％同一和98％查询覆盖率，登录号：MG746602；

[0138] ·PP7噬菌体内溶素，SEQ ID No：141，其与沙门氏菌噬菌体ST11相似：95％同一和100％查询覆盖率，登录号：MF370225；沙门氏菌噬菌体Meda：95％同一和100％查询覆盖率，登录号：MH586731；沙门氏菌噬菌体Si3：95％同一和100％查询覆盖率，登录号：KY626162；
大肠杆菌噬菌体EC6：95％同一和100％查询覆盖率，登录号：JX560968；噬菌体Felix 01：
95％同一和100％查询覆盖率，登录号：AF320576；肠杆菌噬菌体KhF2：94％同一和100％查询覆盖率，登录号：KT184314；沙门氏菌病毒VSe102：94％同一和100％查询覆盖率，登录号：
MG251392；沙门氏菌噬菌体蘑菇：94％同一和100％查询覆盖率，登录号：KP143762；葡萄球菌噬菌体SA1：94％同一和100％查询覆盖率，登录号：GU169904；大肠杆菌O157分型噬菌体
15：94％同一和100％查询覆盖率，登录号：KP869113；柠檬杆菌噬菌体Mijalis：83％同一和
99％查询覆盖率，登录号：KY654690；志贺氏菌噬菌体Sf14：82％同一和99％查询覆盖率，登录号：MF327003；

[0139] ·PP11噬菌体内溶素，SEQ ID No：142，其与肠杆菌噬菌体HK578相似：79％同一和97％查询覆盖率，登录号：JQ086375；大肠杆菌噬菌体Sloth：78％同一和97％查询覆盖率，登录号：KX534339；大肠杆菌噬菌体Envy：78％同一和97％查询覆盖率，登录号：KX534335；

[0140] ·阴沟肠杆菌A1S1噬菌体内溶素SEQ ID No：143。

[0141] 在一个实施方式中，生物膜降解基因和糖萼降解物选自：

[0142]

[0143] 例如，第二ORF可以用于引入模板中使用的抗菌蛋白以进行细菌裂解。一方面，示例蛋白是用于降解金黄色葡萄球菌(>ENA|JQ066320|JQ066320.1金黄色葡萄球菌菌株JP1 Psmβ1(psmβ1)和Psmβ2(psmβ2)基因，完整的cds)的细菌细胞壁降解剂。SEQ ID No：144。

[0144] 在其他方面，第二ORF可用于引入靶向细菌细胞壁中发现的关键连接化学键(酰胺、酯和糖酵解键)的酶。示例包括：

[0145] ·M20家族肽酶[未培养细菌]，登录号AHZ45606(未培养细菌，>KF835382.1：c34024-32630未培养细菌克隆SZR5基因组序列)SEQ ID No：145

[0146] ·脂解酶(未培养细菌登录号AHZ45613>KF835383.1：7038-8066未培养细菌克隆WZR9基因组序列)SEQ ID No：146

[0147] ·肽酶M56([未培养细菌]登录号AHZ45657未培养细菌克隆WZR18基因组序列(>KF835385.1：c14123-13038未培养细菌克隆WZR18基因组序列)SEQ ID No：147；

[0148] ·另一实例是未培养细菌克隆HOAb112C长链脂肪酸CoA连接酶基因([未培养细菌]DBSOURCE登录号KF955286.1)SEQ ID No：148；

[0149] ·葛佬素样蛋白1的家蚕BmGloverin1 mRNA，完整登录号AB190863SEQ ID No：；149

[0150] ·葛佬素样蛋白2的家蚕BmGloverin2 mRNA，完整登录号AB190864SEQ ID No：150；

[0151] ·葛佬素样蛋白3的家蚕BmGloverin3 mRNA，登录号AB190865SEQID No：151；and[0152] ·葛佬素样蛋白4的家蚕BmGloverin3 mRNA，登录号AB190866SEQ ID No：152；

[0153] 根据实施方式，提供了一种生产突变体噬菌体的方法，该方法包括使选定的噬菌体的至少一个黏附基因失活，所述选定的噬菌体可以分离自来自环境的噬菌体。该方法还包括将包含一个或多个黏附基因的一个或多个异源核酸序列插入选定的噬菌体中。一个或多个插入的黏附基因不同于所失活的天然黏附基因，并且由于其对所选择的细菌有特异性而被选择，以产生突变体噬菌体。在一些实施方式中，提供选择的黏附基因扩展了可能的宿主细胞(即细菌)的范围，超出了自然配对关系。

[0154] 根据实施方式，提供了一种生产突变体噬菌体的方法，该方法包括使选定的噬菌体的至少一个黏附基因失活，所述选定的噬菌体可以分离自来自环境的噬菌体。该方法还包括将第一异源核酸序列插入选定的噬菌体中，第一异源核酸序列包含编码第一特异性黏附基因的第一开放阅读框。第一特异性黏附基因不同于所失活的黏附基因，并且由于其对所选择的细菌有特异性而被选择，以产生突变体噬菌体。

[0155] 在另一实施方式中，该方法还包括将第二异源核酸序列插入第二开放阅读框中，编码可用于克服细菌防御的基因。在一些方面，用于克服细菌防御的基因可以是生物膜降解基因、糖萼降解基因、编码抗菌蛋白的基因、和破坏细菌壁的酶的基因，从而产生突变体噬菌体。在一个方面，第一开放阅读框还编码与第一特异性黏附基因不同的第二特异性黏附基因。

[0156] 在一些实施方式中，该方法失活来自选定的噬菌体的所有黏附基因。在一些方面，失活的步骤包括在至少一种天然黏附基因中产生失活突变。在一些方面，失活突变是点突变。

[0157] 根据实施方式，提供了一种用于对表面进行消毒或去污的抗微生物组合物。在一些方面，所述抗微生物组合物包含所公开的突变体噬菌体。

[0158] 根据实施方式，提供了一种对怀疑含有细菌的表面去污的方法。在一些方面，细菌是感染性或非感染性细菌。该方法包括将包含所公开的突变体噬菌体的所公开的抗微生物组合物施加至表面。在各方面中，其量可有效地对至少基本上或所有污染细菌的表面进行去污。

[0159] 在一些方面，该表面是生物表面(动物或植物)。

[0160] 根据实施方式，提供了一种产生特异性突变体噬菌体基因产物的方法。在各方面中，提供了一种消除或基本上消除微生物污染物(感染性或非感染性细菌)的方法，该方法包括：获得由所公开的突变体噬菌体产生的一种或多种裂解酶，并施加所述一种或多种裂解酶至细菌污染物。在某些方面，所述消除在没有对微生物污染物进行事先噬菌体感染的情况下完成，因此导致自外裂解的结果。

[0161] 在本说明书中提到的所有出版物和专利都通过引用并入本文，并入程度就好像每个单独的出版物或专利都被具体地和单独地指出通过引用并入一样。

[0162] 出于说明和描述本发明的目的，已经给出了本发明的前述描述以及某些代表性实施方式和细节。并不旨在穷举本发明或将本发明限制为所公开的精确形式。对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以在不背离本发明范围的情况下进行修改和变型。

[0163] 例子

[0164] 例1–噬菌体分离

[0165] 收集并纯化来自下水道和废物、环境土壤和动物粪便的样品，以用于分离噬菌体。然后筛选所纯化的样品中是否存在针对特定细菌的噬菌体。根据Bonilla等(2016)和Bourdin等(2014)采用从水样中分离噬菌体的方案和方法；根据Sillankorva(2018)、Pausz等(2009)和Van Twest&Kropinski(2009)采用从固体和土壤样品中分离噬菌体的方案和方法。

[0166] 使用无菌水将固体样品再水化至少1小时，以使噬菌体得以散播。然后将样品离心以去除固体物质和大颗粒，并收集上清液。然后将离心的环境样品和水样品进行进一步处理，并使用过滤器(0.2μM)进行纯化，以去除细菌和较小的有害颗粒。过滤后的样品可以使用滤管进一步浓缩，或者储存在4℃下以备将来使用。

[0167] 然后使用琼脂覆盖菌斑测定技术(Kropinski等，2009)对过滤后的样品进行抗目标细菌菌株的测试。用过滤的环境样品和选择的细菌菌株接种液体琼脂覆盖物并混合。然后将其倒入琼脂培养板上(取决于细菌菌株)并使其硬化。然后将板温育过夜(条件取决于细菌菌株)，并在第二天观察针对所选菌株的噬菌斑。然后挑出含有噬菌体的菌斑，并通过3轮的随后噬菌斑测定覆盖物进行进一步处理，以纯化所选择的噬菌体。

[0168] 使用上面概述的方法，收集了大量(数百个)EV样本，并测试了其对开发模板的适合性。对每个EV样品的功能和结构基因进行了表征，进行了整合测试(如下具体所述)。鉴定了具有低拷贝数溶原基因，以及可允许革兰氏阴性和革兰氏阳性裂解的结构和功能基因的候选噬菌体。对名为PP8的所选定的噬菌体进行测序，并如下文具体所述检查基因结构和功能。选择PP8，因为它具有所需的基因。尽管它也具有溶原性基因，但可以使用ORF替换将它们去除。

[0169] 例2–平台开发

[0170] 使用环境样品EV31/PP8，在噬菌体分离后，使用PureLink病毒DNA/RNA提取试剂盒纯化了基因组材料。扩增全长基因组(EV31/Full/F/pYESIL和EV31/Full/R/pYESIL，见序列EV31)，以与pYESIL蓝宝石载体具有30bp的同源性。使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR扩增(修饰使用触地(touchdown)技术，使引物从69℃开始退火，每个循环下降0.5℃)。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，将条带切下、提取并组装。所得的构建体EV31pYES(未修饰)可用于EV31的基因修饰和基于噬菌体拯救的系统中突变功能的确定。

[0171] 例3–全长基因组组装

[0172] 简而言之，以下提供了一种对酵母(乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)细胞基因操作的方法，以使其包括来自大肠杆菌噬菌体T7的T7 DNA(脱氧核糖核酸)依赖的RNA(核糖核酸)聚合酶转录，然后在酵母中表达噬菌体。还提供了一种对酵母(乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)细胞基因操作的方法，以使其在酵母内包括来自细菌(大肠杆菌)和RNA(核糖核酸)聚合酶(P)的转录成分，然后在酵母表达噬菌体。

[0173] 参见图3，将基因组互补物分成与通过PCR扩增获得的相邻片段有重叠部分的片段。将外源基因插入各自的片段内。通过同源重组方法将片段合并成全长基因组，并在酵母菌株毕赤酵母(Pichia pastoris)内将基于酵母的质粒(作为额外的PCR片段)与T7启动子结合在一起。在T7启动子控制下的稳定质粒在诱导含有T7 RNA聚合酶的巴斯德毕赤氏酵母后驱动噬菌体的复活，然后使用酶和机械手段裂解细胞以释放完全形成的噬菌体颗粒。

[0174] EV31pYes(未修饰)与pYESIL载体的同源重组是通过使用100ng的每种PCR产物实现的，并将其转到化学感受态的酵母细胞中。合并pYESIL载体(100ng)和EV31(100ng)。加入感受态酵母细胞并轻轻混合，然后加入600μl聚乙二醇(PEG)和醋酸锂(LiAc)溶液，然后轻轻混合。将混合物在30℃下温育30分钟，以10分钟的间隔倒置。温育后，立即加入35.5μl的二甲基亚砜(DMSO)，通过颠倒混合，并在42℃下热激20分钟(偶尔颠倒)。然后将试管以200-400xg离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1ml无菌0.9％氯化钠(NaCl)中。通过将
100μl平铺在选择性琼脂平板(不含色氨酸的培养基)上，并在30℃下温育3天，可以实现转化的可视化。菌落PCR筛选可以确定阳性转化子的存在。通过标准克隆技术实现同源重组，以使酿酒酵母菌株5150达到化学感受态。简而言之，使用Gietz和Schiestl 2007方案，从储备中产生单个酵母菌落的扩散板，并在30℃下温育过夜。第二天，刮取50μl当量的细胞，并在试管中用1ml无菌无核酸酶水洗涤，然后13,000xg旋转0.5分钟。将以下物质按顺序添加到细胞沉淀中：240μl PEG-3350(50％w/v)，36μl LiAc(1M)，50μl单链载体DNA(2mg/ml猪精子)和34μl质粒-无核酸酶水混合物(

[0175] 图4显示了从遗传模板中复活的PP8的滴定。

[0176] 图5显示了描述EV31/PP8基因位置的图形表示，并且图6中提供了整个基因组的详细核苷酸序列，显示了有义链(SEQ ID NO：1)、互补序列(SEQ ID NO：2)的反义链，和其中编码的蛋白的序列(SEQ ID NO：3-124)以及限制性核酸内切酶位点。图7显示了具有注释的EV31/PP8分子和蛋白的具体描述。

[0177] 例4-通过菌落PCR进行克隆验证

[0178] 按照以下方式进行阳性转化子(平板生长菌落)的筛选。将单个酵母菌落放入15μl裂解缓冲液中进行接种。在单独的试管中，转移5μl的每种混合物并保存在4℃下，以备用于阳性菌落的大规模培养。将剩余的10μl细胞悬液在95℃下煮5分钟，然后立即置于冰上，加入40μl无核酸酶的水并混合。在每个总体积为50μl的PCR反应中加入0.5μl的裂解物，并通过琼脂糖凝胶电泳使其可视化。PP8 DNA消化所得的凝胶如图8所示。

[0179] 例5-独特ORF的开发

[0180] 使用PP8模板，产生了突变体噬菌体。使用同源重组通过产生点突变来去除天然黏附蛋白。

[0181] 基因中断14452-13316(尾蛋白)：

[0182] >PP8-F1F

[0183] ACAAATAGTGAAGAGATAAACCAGGTTGAGCAAG SEQ ID No：185

[0184] >PP8-尾-mut-R

[0185] TTGACGTTGAATCTGGAGTCGATAGGTGCGACAGGTTACCAATGG SEQ ID No：186[0186] >PP8-尾-mut-F

[0187] GTCGCACCTATCGACTCCAGATTCAACGTCAAGGTCTCACC SEQ ID No：187

[0188] >PP8-F1R

[0189] TTCCAAGACGGATTCGAACCGTCACTAGTACAAGG SEQ ID No：188

[0190] 基因中断14823-14446(尾蛋白)：

[0191] >PP8-F1F

[0192] ACAAATAGTGAAGAGATAAACCAGGTTGAGCAAG SEQ ID No：185

[0193] >PP8-hyp1-mut-R

[0194] TTAATGATGTTATCTCGATAACGTCGACATGGAGACTCAGTAAATGG SEQ ID No：189[0195] >PP8-hyp1-mut-F

[0196] TCTCCATGTCGACGTTATCGAGATAACATCATTAAGGTTGTACC SEQ ID No：190

[0197] >PP8-F1RTTCCAAGACGGATTCGAACCGTCACTAGTACAAGG SEQ ID No：188

[0198] 基因中断16522-17937(尾蛋白)：

[0199] >PP8-F1F

[0200] ACAAATAGTGAAGAGATAAACCAGGTTGAGCAAG SEQ ID No：185

[0201] >PP8-hyp2-mut-R

[0202] TTGAATAAACCGTTATCGCCTTCTTAAAGCAACCTGTATTGCGTTCTGC SEQ ID No：191[0203] >PP8-hyp2-mut-F

[0204] TTGCTTTAAGAAGGCGATAACGGTTTATTCAACAAACCCTCATTTCATT G SEQ ID No：192[0205] >PP8-F1R

[0206] TTCCAAGACGGATTCGAACCGTCACTAGTACAAGG SEQ ID No：188

[0207] 基因中断34777-37020(尾蛋白)：

[0208] >PP8-F3F

[0209] TTCTTAAGGAGGGTTATGAATGTGTTATACAGG SEQ ID NO：158

[0210] >PP8-tape-mut-R

[0211] TCTGTGTAGTTCGGCCAACTGTAGTGTGCGAATGATGCAGCGAACATTC SEQ ID No：193[0212] >PP8-tape-mut-F

[0213] TTCGCACACTACAGTTGGCCGAACTACACAGATACCATGAAGCAGTACTC SEQ ID No：194[0214] >PP8-F3R

[0215] GTGGTAAGGTAAGGTATGGAAGGATGGCAGTAG SEQ ID NO：167

[0216] 突变体噬菌体可以包括四个ORF：ORF 1位于46090位；ORF 2位于73195位；ORF 3位于19991位；ORF 4位于60431位。

[0217] 使用针对ORF1(在46,090和46,091位核苷酸之间)的修饰引物EV31/0RF1/F和EV31/ORF1/R和针对ORF 2(在73,195和73,196位核苷酸之间)的EV31/ORF2/F和ORF2/R以及无细胞克隆生成了三个EV31突变体构建体。EV31(ORF1)、EV31(ORF2)和EV31(ORF1/2)。在ORF2的构建体中，首先从EV31中去除了天然结合域，并添加了多限制性酶盒。该盒随后用于添加新的细菌结合域。

[0218] 使用限制性消化同时进行同源重组和插入。对于限制性消化，酶TspRI允许插入多克隆位点(MCS)。在一个实例中，ORF位于3ev31/pp8序列中的19991处。在此实例中，通过使用TspRI完成MCS的插入。一旦插入MCS后，可以通过使用MCS中的限制性酶切位点来实现所选择的黏附基因的插入。用于ORF3的MCS的实例：GCCGGCAGTGGATCCCCGGGGAAGATATTC SEQ ID NO：153。此MCS携带NaeI、TspRI、XmnI、SmaI的酶位点。用于将MCS添加19991位的引物是：EV31 ORF3引物f GCTACACTGCTGAGA SEQ ID NO：154；EV31 ORF3引物r TCTCAGCAGTGTAGC SEQ ID NO：155。

[0219] 第四个ORF位于ev31/pp中的60431处。在此实例中，将通过使用TspRI完成MCS的插入。一旦插入MCS后，可以通过使用MCS中的限制性酶切位点来实现所选择的黏附基因的插入。用于将MCS添加到60431位的引物是：EV31 ORF4引物f CATCAGATGCTGG SEQ ID NO：156；EV31 ORF4引物r CCAGCATCTGATG SEQ ID NO：157。

[0220] 例6–整合

[0221] 对EV31/PP8基因组的分析显示，可能的溶源基因位于60351-62336。通过在60431(ORF4)位点产生ORF来突变基因。一旦溶原基因失活，我们就进行整合研究以确保不会发生整合。结果显示在图9a和9b中。

[0222] 在促进整合的条件下，确认PP8缺乏整合能力。凝胶电泳照片确定了由噬菌体(噬菌体诱导对照)证明的整合事件，该整合事件通过对整个细菌细胞的聚合酶链反应(PCR)确定。如果将噬菌体遗传材料整合到纯化(无噬菌体颗粒)的细菌菌落中，则每个噬菌体的相应引物组将给出阳性PCR信号(右图；泳道5)。相反，PP8无法整合到细菌宿主细胞中，如照片中没有PP8序列阳性信号的情况所示(左图；泳道5-7)。

[0223] 创造整合条件

[0224] 在Luria-Bertani(LB)液体培养基中制备来自甘油原液的细菌宿主(大肠杆菌C)的新鲜过夜培养物。一旦饱和，将培养物在补充有2mM CaCl2的新鲜LB培养基中稀释(1：100)，并温育直至OD600为0.6。将在3mL熔化的软琼脂中的宿主(100μL大肠杆菌C)和噬菌体(100μL，感染复数为5)的混合物铺在事先干燥的LB琼脂平板上。过夜温育后，从每个平板中挑选三个菌落，重新划线到新鲜的LB-琼脂平板上，并温育过夜，进行三轮。将纯化的菌落(不含污染性噬菌体颗粒)接种到LB-2mM CaCl2培养基中，温育过夜。

[0225] 分析潜在的整合事件

[0226] 按照制造商的建议设置 DNA聚合酶(Promega)以及每种待评估噬菌体的引物的聚合酶链反应(PCR)主混合物。将每种过夜培养物中的5μL加入到各自的PCR反应中。改变循环条件，以包括在初始变性阶段使全细菌细胞煮沸(95℃持续10分钟)和59℃的退火温度。以5μL完成的PCR反应物进行1％琼脂糖凝胶电泳，染色并在紫外线(UV)下可视化。结果显示在图9a和9b中。

[0227] 例7-ORF1插入SP5黏附蛋白(46,090和46,091之间)

[0228] 使用PP8，我们利用PP8模板开发了MRSA特异性PP8结合噬菌体，我们去除了天然黏附基因，并利用同源重组在ORF 1位置(46,090和46,091之间)添加了黏附蛋白SP5。用于该同源重组的引物组是：

[0229] 1.PP8片段(加粗)和SP5基因(下划线)在5’同源重组的引物组

[0230] >PP8-F3F

[0231]

[0232] >PP8-SP5-R

[0233]

[0234] 2.SP5(下划线)的扩增：

[0235] >SP5-F

[0236] ATGTACAAAATAAAAGATGTTGAAACGAG_SEQ ID NO：161

[0237] >SP5-R

[0238] CACCCCTTAATTAAATAAAGTGTATTAGGGTC SEQ ID NO：162

[0239] 3.PP8片段(加粗)和与SP5基因(下划线)在3’同源重组的引物组

[0240] >PP8-SP5-F

[0241]

[0242] >PP8-F3R

[0243]

[0244] 插入序列(MRSA黏附蛋白SR5)示于SEQ ID NO：168。

[0245] 例8–噬菌体对MRSA的功效

[0246] 我们针对MRSA感染患者的样本1至6测试了本发明的新PP8(SP5)噬菌体。这些样本1至6是来自临床分离的MRSA阳性患者的样本。该方法的概况如图10所示，结果如图11和12所示。使用PP8(SR5)裂解患者样品1、2、4、5、6。患者样品3仅显示了部分结合曲线，这表明结合的特异性可能不足以提供100％的裂解率。阳性对照是有SA黏附位点的PP8噬菌体。

[0247] 在对患者样品3进行序列分析之后，通过序列分析和源序列(blast)搜索黏附位点，发现了新的结合位点。

[0248] 例9-ORF1插入SP6黏附蛋白(46,090和46,091之间)

[0249] 我们还生成了PP8 SR6突变体，并针对金黄色葡萄球菌对其进行了测试。结果如图13所示。

[0250] 我们然后产生了新的PP8株以黏附并裂解患者样品3。通过将黏附蛋白SP6添加到原始PP8模板的ORF 1中以生成PP8(SR5,SR6)，使用同源重组产生了PP8(SR5,SR6)突变体。用于该同源重组的引物组是：

[0251] 1.PP8片段(加粗)和SP6基因(下划线)在5’同源重组的引物组

[0252] >PP8-F3F

[0253]

[0254] >PP8-SP6-R

[0255]

[0256] 2.SP6的扩增(下划线)：

[0257] >SP6-F

[0258] ATGTACAAAATAAAAGATGTTGAAACGAG SEQ ID NO：164

[0259] >SP6-R

[0260] TCACCCCTTAATTAAGTAAAGTGTATTAGGGTC SEQ ID NO：165

[0261] 3.PP8片段(蓝色)和与SP6基因(下划线)在3’同源重组的引物组

[0262] >PP8-SP6-F

[0263]

[0264] >PP8-F3R

[0265]

[0266] 插入序列(MRSA黏附蛋白SP6)示于SEQ ID NO：169。

[0267] 所得的新噬菌体株称为PP8(SP5,SP6)。我们将这种新噬菌体与PP8(SP5)结合使用，以确定是否可以使用这两种新的修饰噬菌体裂解患者样品1至6。如图14和15所示，新的突变体噬菌体裂解了所有六种患者样品，证明向本发明的PP8模板中添加了新的黏附基因可以特异性靶向细菌。

[0268] 例10-ORF2内溶基因插入(在PP8中73195处插入)

[0269] 1.PP8片段(加粗)和与外源基因(下划线)在5’同源重组的引物组

[0270] >PP8-F5F

[0271]

[0272] >PP8-内溶素-R

[0273]

[0274] >内溶素-F

[0275] ATGCGATTCAGTGACAACGGTCTAAGATTTACGGCAGC SEQ ID NO：172

[0276] >内溶素-R

[0277] TTATGCTGCGTTACGCCCGATTTTCTCGGCAACGTCC SEQ ID NO：173

[0278] >PP8-内溶素-F

[0279]

[0280]

[0281] 使用常规分子生物学技术进行内溶基因的插入。插入序列示于SEQ ID NO：176。

[0282] 例11–在ORF 1和ORF 2中插入黏附蛋白

[0283] ORF1中的同源重组

[0284] 1.PP8片段(加粗)和与外源基因(下划线)在5’同源重组的引物组

[0285] >PP8-F3F

[0286]

[0287] >PP8-黏附蛋白-R

[0288]

[0289] 2.外源基因(下划线)的扩增：

[0290] >黏附蛋白-F

[0291] ATGTCGCGACTGGCGCAGGATATGAAAAAACTGG SEQ ID NO：178

[0292] >黏附蛋白-R

[0293] TCAATCAGTATACCCGTATACCTGCTC SEQ ID NO：179

[0294] 3.PP8片段(加粗)和外源基因(下划线)在3’同源重组的引物组

[0295] >PP8-黏附蛋白-F

[0296]

[0297] >PP8-F3R

[0298]

[0299] ORF2中的同源重组

[0300] 1.PP8片段(加粗)和外源基因(下划线)在5’同源重组的引物组

[0301] >PP8-F5F

[0302]

[0303] >PP8-黏附蛋白-R

[0304]

[0305] 2.外源基因(下划线)的扩增：

[0306] >黏附蛋白-F

[0307] ATGTCGCGACTGGCGCAGGATATGAAAAAACTGG SEQ ID NO：182

[0308] >黏附蛋白-R

[0309] TCAATCAGTATACCCGTATACCTGCTC SEQ ID NO：183

[0310] 3.PP8片段(加粗)和与外源基因(下划线)在3’同源重组的引物组

[0311] >PP8-黏附蛋白-F

[0312]

[0313] >PP8-F5R

[0314]

[0315] 例12–靶向大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌物种的噬菌体开发[0316] 对目前在加拿大家禽场引起死亡的所有致病性大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌物种进行序列分析，从而可以评估和产生通用的结合域，该结合域用于基因设计可破坏这些致病性细菌的噬菌体。实现该目标的过程如下：

[0317] 1)序列分析：

[0318] 从曼尼托巴省(Manitoba)的家禽场收集了粪便和其他排泄物样本，用于鉴定大肠杆菌和肠炎沙门氏菌。产气荚膜梭菌样品由行业伙伴提供。所有这些样品均用于分离加拿大家禽群中存在的致病性细菌以及噬菌体(用于构建我们的噬菌体库)。一旦获得了致病性细菌的纯培养物，就使用Illumine Miseq 2000对细菌进行序列分析。对这些序列进行分析之后，可以获得每种细菌的普遍黏附区域。使用Clone Manager遗传程序，确定了各种细菌物种表面上的保守黏附区域，并对可以黏附到保守细菌结合域的遗传克隆的产生进行了反向工程。

[0319] 2)将保守的黏附区插入模板并在酵母菌株(CP109)中繁殖：

[0320] 该普遍黏附构建体被亚克隆到所公开的噬菌体模板中。通过在酵母菌株CP 109中转化和繁殖而产生感染性噬菌体，该酵母菌株CP 109具有保持多份噬菌体模板的能力。这通过两种方法实现：

[0321] a)在体内转化并最终诱导酵母细胞中的噬菌体模板，或

[0322] b)通过使用酵母细胞的细胞提取物进行体外培养。

[0323] 无论使用哪种方法，使用这些方法进行繁殖的优势在于避免了经典的噬菌体繁殖，在传统的噬菌体繁殖中，潜在危险水平的细菌内毒素会污染制剂。这些噬菌体生产方法消除了这一障碍，因为酵母细胞被用于培养噬菌体。

[0324] 3)确定噬菌体靶向和感染多种大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌致病性细菌物种的能力：

[0325] 对噬菌体进行生长表征以确保普遍黏附蛋白的适当插入。感染大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和产气荚膜梭菌，并分析噬菌体的生长。进行了裂解测试，以确保不发生整合。进行了细胞毒性测试以验证酵母中的无毒提取方法。已经分析了噬菌体的结合能力，并准备评估肉鸡中的噬菌体治疗。

[0326] 参考文献

[0327] Bonilla,N.,Rojas M.I.,Netto Flores Cruz,G.,Hung,S.H.,Rohwer,F.,Barr,J.J.2016.Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks.PeerJ.,4,e2261.

[0328] Bourdin,G.,Schmitt,B.,Marvin Guy,L.,Germond,J.E.,Zuber,S.,Michot,L.,Reuteler,G.,Brüssow,H.2014.Amplification and purification of T4-like escherichia coli phages for phage therapy：from laboratory to pilot scale.Appl Environ Microbiol.80,1469-1476.

[0329] Kropinski,A.M.,Mazzocco,A.,Waddell,T.E.,Lingohr,E.,Johnson,R.P.2009.Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay.Methods Mol Biol.501,69-76.

[0330] Pausz,C.,Clasen,J.L.,Suttle,C.A.2009.Isolation independent methods of characterizing phage communities 1：strain typing using fingerprinting methods.Methods Mol Biol.502,255-278.

[0331] Sillankorva,S.2018.Isolation of Bacteriophages for Clinically Relevant Bacteria.Methods Mol Biol.1693,23-30.

[0332] Van Twest,R.,Kropinski,A.M.2009.Bacteriophage enrichment from water and soil.Methods Mol Biol.501,15-21.

[0333] Gasset,M.(2010).Bacteriophage Holins and their Membrane Disrupting Ability,123–148.https：//doi.org/10.1002/9780470570548.ch6

[0334] Fischetti,V.A.(2008).Bacteriophage  lysins  as effective antibacterials.Current Opinion in Microbiology,11(5),393–400.https：//doi.org/
10.1016/j.mib.2008.09.012

[0335] Borysowski,J.,Weber-Dabrowska,B.,&Gorski,A.(2006)Bacteriophage Endolysins as a Novel Class of Antibacterial Agents.Experimental Biology and Medicine,366-377.http：//journals.sagepub.com/doi/10.1177/153537020623100402