[0001] 本发明涉及一种新的扁藻(Tetraselmis)提取物和获得该扁藻提取物的方法，发现该扁藻提取物在皮肤病治疗中具有益处并且能够作为局部化妆品施用。

[0002] 文献EP 2 193 785 A2涉及肩突四扁藻(Tetraselmis suecica)的提取，但该过程是在低温下进行的。这些提取物具有不同的组成，特别是关于氨基酸和糖成分。令人惊讶地，发现具有该组成的提取物对局部施用肩突四扁藻提取物的皮肤治疗性质有影响。

[0003] 皮脂腺(SGs)是在除了手掌和脚掌及脚背以外的身体皮肤上各处可见的皮肤附属器。皮脂腺由同一腺体内的一个或多个小叶组成。SGs分泌一种称为皮脂的天然油脂，其与汗液一起参与组成覆盖皮肤的水脂膜。人体皮脂是约40-60％的甘油三酯、甘油二酯和游离脂肪酸、25-30％的蜡酯、12-15％的角鲨烯、3-6％的胆固醇酯和1.5-2.5％的胆固醇的复杂混合物。

[0004] 在皮肤作为包括环境毒剂和UV光的环境压力屏障的角色中，皮肤由SGs支撑，并且皮脂对皮肤的健康状态和外观具有重要作用。其在屏障的保护和维持，尤其在经皮水分丢失量的调节、皮肤和毛发免受摩擦的保护、皮肤生物膜的维持和向皮肤表面输送抗氧化剂(角鲨烯、辅酶Q10和维生素E)的传输中发挥作用。此外，其涉及表皮发育、体臭和信息素的产生。皮脂直接涉及激素信号传导、表皮分化和防紫外线(UV)辐射。其还会调节皮肤的天然微生物群落的组成和增殖。

[0005] SGs存在两种类型：在毛囊皮脂腺单位内连接到毛囊的和独立存在的(与毛囊没有关联)哪些。当它们与毛囊相关联时，一个或多个腺体能够包围每个毛囊，并且腺体自身被立毛肌所包围。SGs在面部、头皮和背部中线中特别丰富。它们在面部总数能够达到400-900腺体/cm2。它们还存在于眼睑(称为睑板腺)、耳(盯聍腺)、鼻、阴茎、小阴唇、面颊的内口腔粘膜(福代斯氏斑(Fordyce’s spots))以及乳头的无毛区域(无毛的皮肤)。

[0006] 皮脂腺细胞(Sebocyte)是SGs内的主要细胞。其目的是通过完全成熟的细胞的分化和裂变来产生和分泌皮脂，这种独特的过程称为全分泌。皮脂腺细胞能够分类为布置在面向基膜的单层中的未分化细胞。因为其引起增殖和分化细胞的持续通量(continual flux)，所以其具有干细胞的特性。朝向腺体小叶中心生长，基底细胞逐渐分化为早期分化细胞型、晚期分化细胞型、全分化细胞型和成熟皮脂腺细胞。特征性地，脂质在皮脂腺细胞的细胞质中的积累随着晚期分化而增加。在完全分化的和在成熟的皮脂腺细胞中，细胞核变得扭曲和分裂，并且细胞破裂。皮脂排入到皮脂腺管中，进而释放到毛干周围的毛囊中。皮脂一经分泌，便会被各种异生物(xenobiotes)定殖，异生物的发育被几种防御机制和与环境氧的接触控制。氧和微生物转化“天然”皮脂，甘油三酯分解成脂肪酸是最明显的活性。

[0007] 皮脂腺细胞具有能够合成皮脂中存在的所有脂质种类的酶机械能力(enzymatic machinery competent)。皮脂脂肪酸的特征在于种类繁多，其包括具有奇数或偶数碳原子、长链和不寻常的不饱和度的直链和支链种类。乙酸酯、丙酸酯、异丁酸酯、异戊酸酯和2-甲基丁酸酯用于通过添加衍生自丙二酸单酰辅酶A的两个碳基团扩展来产生不同的脂肪酸。通过Δ6-去饱和酶(脂肪酸去饱和酶2)和Δ9-去饱和酶(硬脂酰辅酶A去饱和酶)的活性来发生去饱和。

[0008] 亚油酸被认为直接参与皮脂脂质合成，并且被吸收到漏斗腺(infundibulum)的表皮脂质中。通过β-氧化的活化，亚油酸被转化为二碳前体，其产生作为生物合成途径的起始物的乙酰辅酶A。后者导致角鲨烯和蜡酯的形成。由于亚油酸是必需脂肪酸，其血浆水平可以调节其在皮脂腺细胞中的浓度。脂肪酸随后用于合成甘油三酯、胆固醇和蜡酯。

[0009] 甘油三酯由脂肪酸和甘油合成。单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)将单酰基甘油转化为二酰甘油，二酰甘油用于甘油三酯合成的一个途径中的倒数第二步。脂酰辅酶A/二酰甘油酰基转移酶(DGAT)1和2是催化甘油三酯合成中最后步骤的关键酶。蜡酯在涉及脂肪酰基辅酶还原酶和蜡合酶的两步过程中产生。优选包括饱和脂肪酸而不是单不饱和的。酶脂酰辅酶A胆固醇酰基转移酶1(ACAT 1)在SG中高度表达，其允许胆固醇酯吸收到细胞质的脂滴中。胆固醇和角鲨烯共享其生物合成的初始步骤。角鲨烯是胆固醇生物合成中的最后一个线性中间体。

[0010] 肝X受体(LXRs)是NHR家族中的成员，其在胆固醇平衡和脂质代谢中起到关键作用。通过LXR配体对SZ95皮脂腺细胞的处理增进了脂滴在细胞中的积累，这能够通过诱导LXRα受体和已知的LXR靶标——诸如脂肪酸合酶(FASN)和固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)——的表达来解释。

[0011] 过氧化物体增殖物激活型受体(PPAR)是核激素受体(NHR)家族中的成员，并且充当包括那些涉及皮肤脂质代谢的多种基因的转录调节因子。各种脂肪酸、类花生酸和前列腺素类(包括前列腺素、前列环素和血栓素)激活PPARs。PPARs在人体SGs和人体SZ95皮脂腺细胞中表达。PPARγ激活皮脂腺细胞发育(增殖)和脂肪合成。PPARγ参与氧化应激介导的前列腺素E2的产生，并诱导人体SZ95皮脂腺细胞中的COX-2表达。

[0012] 前列腺素是响应多种生长因子和环境刺激而合成的脂质介质。前列腺素的产生依赖于环氧合酶(cyclooxygenase enzymes)(COX-1和COX-2)的活性。皮脂腺细胞在体内和体外产生环氧合酶2(COX-2)，也称为前列腺素合酶-2(PGHS-2)。在具有可诱导的COX-2同种型的靶向过表达的转基因小鼠中观察到COX-2在皮脂腺发育中的重要性。这些小鼠发生皮脂腺增生、皮脂分泌增加和毛发油腻，表明COX-2和前列腺素在皮脂腺细胞增殖和脂质代谢中的重要作用。

[0013] SGs的功能受诸如例如生长因子的多种其他因子的控制。胰岛素样生长因子1(IGF-1)在诱导人体皮脂腺细胞的脂质合成中起关键作用。IGF-1通过诱导SREBP-1增加脂质合成，SREBP-1优先调节脂肪酸合成的基因。

[0014] 每个皮脂腺细胞的高比率的皮脂分泌会导致皮脂酯中低水平的亚油酸酯，使毛囊上皮缺乏必需脂肪酸和导致粉刺形成的特征性角化过度。通过药物抑制皮脂分泌会提高皮脂中的亚油酸酯的浓度，并减轻毛囊角化过度。

[0015] 例如在脸上发生不期望的皮脂腺活性过强。此处，皮脂的过度产生给予皮肤油光发亮、油腻和不美观的外观(油性皮肤)，通常伴有大的毛孔。全球人口统计研究表明油性皮肤是70％的美国女性和62％的日本女性的共同关注。过量的皮脂堵塞毛孔，为生存在皮肤上的细菌提供营养。这能够促进其他轻微瑕疵，诸如粉刺。在一些情况下，存在过量皮脂会引发更加严重的病症，例如痤疮。寻常痤疮(Acne vulgaris)是最常见的炎性的皮肤病，其影响多达85％的青少年，并且经常持续到成年。发病机制是多因素的，并且包括皮脂腺过度活性；皮脂分泌率与痤疮严重程度相关并预测痤疮结果。皮脂腺是相对缺氧的并且支持诸如疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne)的兼性厌氧菌的生长，疮疱丙酸杆菌在痤疮中起重要作用并且其密度随着皮脂分泌率增加而增加。

[0016] 变大的皮肤毛孔是指在皮肤表面的明显可见局部变化的状况。尽管不是医疗问题，但变大的毛孔对于大量个体而言是美容问题。面部毛孔变大的主要临床原因有三种，即高皮脂分泌率、毛孔周围的弹性降低和毛囊体积增大。因此，减少皮肤毛孔对皮肤局部特征的影响的一种方式是减少皮脂的过度产生和累积。

[0017] 皮脂腺过度产生的皮脂在护发中具有重要作用。头皮的皮脂腺产生的过多的皮脂是导致毛发油腻的原因，这被认为是显著的美观问题。许多含药物的洗发剂和洗剂类型的化妆治疗被提出用于减轻头皮的皮脂的过度产生。然而，化妆品公司不断寻求新产品，特别是从天然成分获得。皮脂溢出与头皮屑的发生有关，头皮屑是一种以大量且松散粘附的薄片为特征的头皮疾病，通常伴有瘙痒。头皮屑影响了50％的世界人口。这种加重的头皮脱屑能够发展为脂溢性皮炎，其为伴随有炎症和红斑的严重类型的头皮屑。头皮屑和脂溢性皮炎的病因呈现取决于三个因素：皮脂腺分泌物、微生物群落(亲脂性真菌马拉色氏菌属，特别是球形马拉色氏菌(M.globosa)和局限马拉色氏菌(M.restricta))新陈代谢和个体易感性。因此，调节皮脂分泌是(预防头皮屑和脂溢性皮炎的核心问题，并且本发明尤其涉及该问题。

[0018] 最后，由于女性外生殖器具有许多皮脂腺，适于调节皮脂分泌的化合物也能够应用于私密卫生的产品中。阴阜、大阴唇、小阴唇和阴道前庭外侧富含皮脂腺，并且其皮脂分泌与细菌微生物群落相互作用，调节生殖区的pH。新的皮脂并不含有显著量的游离脂肪酸，但这些游离脂肪酸由于细菌产生的脂肪酶的作用而被释放，从而诱导生殖器环境的酸化。因此，皮脂的调节能够代表防止生殖器微生物群落的改变、刺激、瘙痒等的重要条件。

[0019] 因此，本行业对寻找适于减少皮脂产生的新的试剂非常感兴趣。理想地，试剂是原始天然的、易于生产、易于储存、安全且能够用于许多不同的制剂中，特别是用于皮肤和头发护理的化妆品和皮肤病制剂、以及用于私密卫生的制剂中。

[0020] 皮肤病文献包括的研究中引用了已被研究出减少皮脂能力的许多物质，诸如例如类视黄醇(retinoid)如13-顺式-维生素A酸(异维A酸)、全反式维甲酸、阿达帕林、其盐或衍生物，雄激素抑制剂如螺内酯和环丙孕酮、抗生素，优选氯林可霉素、红霉素和四环素、以及抗雄激素。然而，这些通常是主要用于治疗痤疮的处方药，其次是减少皮脂。其他已知的减少皮脂药剂包括例如烟酰胺、5-α-还原酶抑制剂、D-泛酰醇、α-羟基酸，诸如例如水杨酸和乳酸、丙酮酸(α-酮酸)，脂肪族二羧酸，诸如例如壬二酸、L-肉毒碱、补骨脂酚(bakuchiol)、1,2-癸二醇、洋川芎内酯-A(senkyunolide-A)、包括洋川芎内酯-A的芹菜籽油、皂皮树(Quillaja saponaria)提取物、绿花恩南蕃茄茎皮(Enantia chlorantha bark)提取物、榆绣线菊(Spiraea ulmaria)提取物、鳄梨油酸丁酯(butyl avocate)、维生素B6(也称为吡哆醇)或其盐、维生素B3(也称为烟碱酸或烟酸)或其盐或衍生物、过氧化苯甲酰(benzoyl peroxide)、根皮素、茶树(Camellia sinensis)提取物和含有的多酚诸如例如表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate)、红车轴草(假三叶草(Trifolium pretense))提取物、大豆(野生大豆(Glycine Soja))种子提取物、异黄酮或含有异黄酮提取物，优选鸡豆黄素A(biochanin A)、金雀异黄素(genistein)、大豆黄素(daidzein)、染料木苷(genistin)和黄豆苷元(daizin)。

[0021] 屏障/机械、粘附和紧密连接/分化：

[0022] 陆生动物和人体的体表暴露于空气和暴露于机械应力，两者在生物体与其环境之间的直接界面上都与活细胞持久性不相容。皮肤的表皮分层在物理上使生物体与其环境隔离，并作为其抵抗脱水、化学物质、物理损伤和微生物的结构和功能的第一道线。表皮的活细胞层在两个不同水平上对屏障的形成和维持至关重要。首先，角质形成细胞(keratinocyte)通过复杂的空间和时间的分化过程最终形成皮肤的最外层保护死层。例如在特应性皮炎中能够观察到这种分化的损伤(Impairment)导致角质层(SC)屏障功能降低。
其次，活细胞层本身通过在相同和不同表皮层的细胞之间提供紧密的机械内聚力而形成屏障。为了建立该屏障，存活的细胞必须通过使细胞间接触结合至细胞骨架的细胞间连接而彼此连接，例如紧密连接处、(角膜(corneo))桥粒和粘附连接处(adherens junction)。

[0023] 粘附连接处是细胞间结构，其将细胞间粘附耦合至细胞骨架，从而产生协调细胞群落行为的跨细胞网络。粘附连接处是动态实体并且还起到作为调节细胞骨架动态和细胞极性的信号平台的作用。这样，其除了粘附力外还调节各种各样的其他细胞过程，例如细胞形状、分裂、生长、细胞凋亡和屏障功能。粘附连接的分子主要成分由两种细胞粘着受体复合物形成，即典型的钙黏蛋白/连环蛋白复合物和连接素/胞黏蛋白复合物，其均能够结合至肌动蛋白细胞骨架。典型的钙黏蛋白是单跨膜Ca2+依赖性细胞粘着分子，其在其细胞质面上与连环蛋白相互作用。两类典型的钙黏蛋白在表皮中表达：主要在毛囊周围和毛囊内的基底层表达的P-钙黏蛋白(钙黏蛋白3)和在表皮的各层发现的E-钙黏蛋白(钙黏蛋白1)。

[0024] 桥粒是“机械”连接处，主要涉及细胞内聚力[14]。其由与类似粘附连接的典型的钙黏蛋白的桥粒钙黏蛋白组成，桥粒钙黏蛋白属于钙黏蛋白超家族的一部分。在人体表皮中发现了桥粒芯糖蛋白1-4和桥粒芯胶粘蛋白1-3。将桥粒钙黏蛋白的细胞间末端植入形成桥粒斑块的衔接蛋白的分子网络中，该桥粒斑块与角蛋白纤维结合。随着角质形成细胞穿过表皮层，其不断地在细胞边缘形成并回收桥粒。在此期间，构成连接处(甚至没有结构的物理解离)的分子也被不断地替换。根据角质形成细胞分化的水平，来自下表皮区室的桥粒芯糖蛋白2和3逐渐被上活表皮层中的桥粒芯糖蛋白1和4所代替。以相同的方式由桥粒芯胶粘蛋白1代替桥粒芯胶粘蛋白3。桥粒的这种分化依赖性组成与其机械稳定性的增加一致。

[0025] 紧密连接(TJ)是封闭连接。其密封表皮细胞间的细胞间隙，并且该结构的“紧密性”由环境因素动态调节并满足生理的需要。已经在人(和/或鼠)表皮及其培养的角质形成细胞中发现了许多TJ蛋白。其包括闭合蛋白(claudin)、TJ相关MARVEL蛋白(TAMP)和连接粘着分子(JAM)跨膜家族以及几种TJ斑蛋白(例如封闭小带/ZO和扣带蛋白)。有趣的是，大多数通过表皮的免疫染色发现的TJ蛋白定位于颗粒层(例如，紧密连接蛋白(cldns)-1、-4、-6、-7、-11、-12、-18、密封蛋白(occludin)、ZO-1、ZO-2、扣带蛋白)的细胞-细胞边界，其中已经发现了功能性TJ屏障。表皮屏障功能所需要的紧密连接成分的功能性证据来自闭合蛋白-1缺陷小鼠，其由于颗粒层的屏障功能受损而死于大量的经皮水分丢失(TEWL)。使用培养的角质形成细胞，显示出TJs形成对水和不同大小的分子以及离子的屏障。

[0026] 通过刺激连接基因和蛋白增强表皮完整性并由此增加防御功能的药剂也会促进头皮内环境动态平衡，因此期望能够对头皮屑也是有益的，尤其是如果这些药剂也具有减少皮脂活性的话。

[0027] 皮脂/屏障污染：

[0028] 根据世界卫生组织(WTO)标题为“全球空气状况2017(State of Global Air 2017)”的年度报告，超过90％的世界人口生活在空气不健康的地区。术语空气污染包括但不限于交通的废气，在本文中还包括工业的废气。在本文中，空气污染是指排放的气体污染物，但也指排放的颗粒。还包括橡胶轮磨损产生的颗粒。涉及到空气污染的颗粒可能已经与多环芳香烃(PAH)结合，但并不限于这些富含PAH的颗粒。打印机排放出的炭黑颗粒也是在室内发生的空气污染问题。另一个问题是通过室内加热以及使用煤或木柴烹调所产生空气污染。

[0029] 空气污染的最常见成分之一是颗粒物(PM)，根据颗粒的空气动力学直径，将颗粒物分为PM10、细PM和超细颗粒。PM10(直径小于10μm的颗粒)由来自灰尘、工业排放物和交通排放物的颗粒组成。小于2.5μm的较小的PM直径被定义为细PM(PM 2.5)；PM 2.5主要由有机碳化合物、硝酸盐和硫酸盐组成。对污染中的、特别是环境空气污染的流行病学调查表明：PM与诸如特应性皮炎、痤疮、银屑病和过敏反应的炎性的皮肤病的进程有关。

[0030] 环境/外源因素与分泌的皮脂的质量和数量有关。因此，例如污染：无论是天然还是由于人类活动(臭氧、工业、农业、吸烟等)，都会影响皮脂的组成并且还被认为会刺激其分泌。因此，低浓度(1和10μg/mL)的PM 2.5显示出促进培养的皮脂腺细胞(sebocyte)中的脂质合成(Q.Liu et al.,Int J Mol Med.2017,40(4),1029–1036)。

[0031] 此外，对人体角质形成细胞细胞系的研究证明，在皮肤屏障功能障碍的发展中的COX2/PGE2(前列腺素E2)和丝聚蛋白之间的相互作用，提供了PMs引起在COX2蛋白水平、mRNA表达、启动子活性和PGE2产生的显著性且剂量依赖性增加，而最终导致丝聚蛋白下调的证据。

[0032] 人体皮肤暴露于反复的空气污染还显示，支持由于角质形成细胞和黑色素细胞的串扰(crosstalk)的色素斑的形成，所述黑色素细胞是皮肤的黑色素产生细胞。

[0033] 因此，对于一方面减少皮脂腺的皮脂产生，并且另一方面通过刺激桥粒、粘附和紧密连接蛋白来增强表皮完整性，从而减少助长环境刺激(stimuli)的颗粒物的渗透和其他脂质合成的药剂是特别有利的。

[0034] 抗菌肽和蛋白质

[0035] 抗菌肽或蛋白质(AMPs)代表保护界面免受来自病原微生物感染的古老且有效的先天防御机制。在人体皮肤中，AMPs主要由角质形成细胞、嗜中性粒细胞、皮脂腺细胞或汗腺产生，并且为组成性地表达或在炎性刺激后表达。具有特应性皮炎的患者的皮肤受损显示为β-防御素和组织蛋白酶抑制素LL-37的表达减少。此外，AMPs水平降低与烧伤和慢性伤口有关。相反地，如在患有银屑病和红斑痤疮(很少导致重复感染的炎性皮肤病)的患者中所见，AMPs的过表达能够增强对皮肤感染的保护。在其他皮肤病例如寻常痤疮患者中，通常在发炎或感染的皮肤区域中发现AMPs水平增加，表明这些肽在免受感染的保护中的作用。抗菌活性的广谱性、细菌抗性的低发生率以及其作为免疫调节剂的功能是AMPs用于其临床应用的有吸引力的特征。

[0036] 包括α和β家族的防卫素(Defensin)是哺乳动物中最大且研究最多的AMPs的家族之一。人体防御素对抵抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、病毒、真菌和一些原生动物具有广谱的抗菌活性，并且是先天免疫系统的重要组成部分。

[0037] β防御素是具有抗菌活性的阳离子肽，其防御包括皮肤、胃肠道、泌尿道和呼吸道的上皮表面。人体β-防御素1肽(hBD-1)由DEFB1基因座(locus)编码并针对革兰氏阳性菌和阴性菌起作用。在二硫桥(disulphide-bridge)还原后，hBD-1成为抵抗机会致病性真菌白色念珠菌的有效的AMP。这显示出LL-37或溶菌酶抵抗金色葡萄球菌和大肠杆菌的协同效应。

[0038] S100蛋白是通过两种钙结合EF-手型基序(two calcium-binding EF-hand motifs)表征的低分子量阳离子蛋白。其参与诸如钙依赖性细胞信号传导、细胞生长和抗菌防御的多种细胞过程。

[0039] 牛皮癣素(S100A7)是一种Ca2+结合S100蛋白，其在银屑病皮损中被发现，并且在正常的上皮细胞中以低水平表达。在与高密度的细菌相关的皮肤中，尤其在局部中，发现牛皮癣素的病灶性表达。此外，肽在分泌脂质的皮肤的表皮和皮脂腺中累积并分泌到皮肤外表面。其显示出优选针对大肠杆菌的抗菌活性。具有抗菌活性的S100A家族的另一个成员是钙卫蛋白(calprotectin)，即两种钙结合蛋白S100A8和S100A9的杂合物。钙卫蛋白表现出尤其对大肠杆菌、克留氏菌属某些种(Klebsiella spp.)、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌性质，以及对真菌白色念珠菌的抑真菌活性。

[0040] 肾上腺髓质素(AM)是由包括角质形成细胞的多种细胞产生的多功能肽。其具有作为皮肤的生长调节因子的作用并且在外皮的保护屏障中作为抗菌剂而作出贡献。

[0041] 表皮完整性/炎症/炎症后色素沉着：

[0042] 导致炎症的皮肤受损不仅能够诱导皮脂分泌，而且还能够导致炎症后色素沉着(PIH)，特别是对于皮肤较暗的人(皮肤III型至VI型)。在这样的受损中有例如痤疮。此外，空气污染/颗粒物(PM)成为黄褐斑和其他面部色素性皮肤变色症(dyschromias)发展的病因。

[0043] PGE2是花生四烯酸最丰富的代谢物之一，其通过受环氧合酶(COX)控制的酶级联反应而产生。COX-2响应于皮肤细胞中的多种炎性刺激而被诱导。PGE2通过导致PKC-ζ(蛋白激酶Cζ(protein kinase C zeta))激活的G蛋白偶联受体EP1和EP3调节其在黑色素细胞中的作用。PGE2刺激黑色素细胞树突形成和黑色素体转移。此外，在黑色素细胞中示出了COX-2显著地降低了酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、gp100和MITF的表达并且还降低了酪氨酸酶活性。
此外，COX-2siRNA转染的黑色素细胞显示出，诱导黑色素产生的α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)明显减少。

[0044] 因此，证明COX-2和PGE2在PIH中起重要作用。

[0045] 与化妆品和皮肤病的领域中的微藻开发相关的现有技术提供了一些实例：

[0046] FR 2980698 A1(Gelyma)公开了通过利用来自微藻类四爿藻(Tetraselmis chui)和大型藻类墨角藻(Fucus spiralis)的提取物的组合活性来调节皮脂产生。四爿藻是通过具有受控的代谢诱导培养过程的生物技术获得的，以诱导无机生物累积，目前为生物可利用锌。因此，该提取物由通过在富含锌的培养基中培养获得的四爿藻而制备，并且其特征在于，锌含量为10至2000ppm。根据本公开，四爿藻在其化学组成上不同于肩突四扁藻。仅示出了四爿藻和墨角藻的组合提取物对由于5α-还原酶抑制剂引起的减少皮脂活性，以及白介素(IL)-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α抑制剂的抗发炎功效，而并非针对单个提取物，因此尚不清楚其中只有一个具有这些活性或是两者都具有这些活性。

[0047] KR2013015037 A公开了一种用于从肩突四扁藻或椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)分离具有抗发炎和抗痤疮功能的物质的提取方法。有效的提取物是通过对微藻生物质进行脱盐和脱水并将其加工成粉末而获得的。在该预处理之后，将微藻直接用乙酸乙酯(TS-6000)进行提取或用1％的氢氢化钠溶液(＝碱提取)进行提取。然后用HCl中和碱性混合物，将提取液过滤分离，加入乙酸乙酯并分离有机相(TS-2000)。这两种亲脂性提取物抑制巨噬细胞的炎性细胞因子，即一氧化氮(NO)、IL-6和TNF-α的分泌。从抵抗疮疱丙酸杆菌的抑菌活性推理出该提取物的抗痤疮作用。这没有表明，肩突四扁藻提取物具有减少皮脂活性。

[0048] WO2016020339 A2(Cutech)公开了通过用从由C1-C4脂族醇、乙酸乙酯、水或其混合物的组成的组中选出的溶剂提取而获得的微藻、盐生植物和好砂植物的提取物，其显示出作为人体皮脂腺代谢的调节剂的活性。明确描述了获得自属于绿球藻属(Chlorococcum)、海链藻属(Thalassiosira)、蒜头藻属(Monodus)和角毛藻属
(Chaetoceros)的微藻的提取物的减少皮脂活性。并未公开来自扁藻的提取物。

[0049] FR 2894473 A1(Daniel Jouvance)公开了从一些微藻生物质糊剂或悬浮液(单鞭金藻属(Chromulina)、星杆藻(Asterionella)和扁藻)获得的制剂用于抑制参与脂肪酸和脂质代谢的酶，即在脂肪细胞或前脂肪细胞(pre-adipocyte)中的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、磷酸二酯酶(PDE)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(Ga3PDH)、脂肪酸合酶(FAS)、脂蛋白脂肪酶(LPL)。但并没有给出生物学数据。

[0050] C.sansone等人(Scientific Reports(2017),7,41215CODEN:SRCEC3；ISSN:2045-2322)描述了肩突四扁藻的乙醇/水提取物，其含有高水平的类胡萝卜素——诸如叶黄素、紫黄质、新黄质、花药黄质和绿藻黄素酯(loroxanthin ester)，以及其在被H2O2损伤的人肺癌细胞(A549)中减少活性的强抗氧化剂和前列腺素E2(PGE2)水平。

[0051] US2010143267 A1(Symrise)描述了从扁藻的某个种(Tetraselmis sp.)诸如此类获得的提取物在用于刺激角化包膜蛋白成分诸如丝聚蛋白和/或内披蛋白水平方面的用途。通过使用从由己烷、乙酸乙酯、乙醇、水、甲醇、异丙醇和两种或更多种这些提取剂的混合物组成的组中选出的液体提取剂在不超过50℃的温度下可持续长达24小时提取活的、冷冻干燥的或干燥细胞的扁藻某个种，优选肩突四扁藻来获得提取物。根据实施例33至40和41至48，以5μg/mL连续乙醇提取是用于增加体外人体皮肤中内披蛋白和丝聚蛋白的最有效提取。

[0052] WO 2017068424公开了用于治疗痤疮和易于产生痤疮的油性皮肤的化妆品或皮肤病组合物，其包括二氢杨梅素和锌盐，优选为葡萄糖酸锌，并且有利地包括鹰嘴豆芽素A或包括鹰嘴豆芽素A的植物提取物。组合物还能够含有多元醇，优选地选自木糖醇、山梨糖醇或甘露醇的组。在该组合物中没有给出多元醇的功能，并且没有表明多元醇本身具有减少皮脂活性。

[0053] EP 2583662也是如此，其公开了一种包括萜烯(meroterpen)的组合物来管控具有发展为易于痤疮的油性皮肤。

[0054] WO 2017120468描述了纳布啡用于治疗瘙痒病症的治疗用途，上述瘙痒病症包括例如特应性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹、寻常痤疮或并发有瘙痒的内脏疾病，使用甘露醇作为输送系统的一部分，用于持续释放包括约0.5％至约80％的刺槐豆胶、约5％至约80％的黄原胶、约20％至约80％的甘露醇和约0.5％至80％的脱水硫酸钙(calcium sulfate dehydrate)。并没有示出甘露醇的减少皮脂活性。

[0055] 微藻的生物多样性非常高，并且在很大程度上仍然是不确定的：迄今为止，已经描述了约35,000种的微藻，但是未知种的数目估计为200,000至800,000。这些生物体的适应性使它们能够合成稀有且具有生物活性的化合物，适合于维持特定和多样化的环境压力或与其他生物体成功竞争。通常已知不同的生物物种包括不同的物质。因此，通过使用一种微藻种可以获得的效果不能够用于预测通过使用不同微藻种可以获得的效果。

[0263] 实验部分

[0264] 实施例1：肩突四扁藻提取物的制备

[0265] 将3g冷冻干燥的肩突四扁藻生物质和30g水混合，并在80℃下搅拌2小时。从生物质中分离出液体提取物，将30g水加入到提取的生物质中，并将混合物在80℃下再搅拌2小时。通过离心将液体与生物质分离，将两次提取溶液合并，并通过冷冻干燥除去水。用3个不同的生物质批次进行提取。

[0266] 为了比较，根据US2010143267 A1的说明书从相同的3个生物质批次中制备含水提取物，并通过冷冻干燥除去水。

[0267] 表1：在室温和80℃下通过提取获得的肩突四扁藻提取物

[0268]

[0269] 与在室温下的提取相比，加热同时提取可得到相当的、略微降低的、高的提取率，但令人惊讶的是其提供了浅得多的有色提取物，这对于用作化妆品成分特别有利，因为消费者更喜欢浅色产品。另外，热处理还具有附加的益处是生物质中的酶被灭活，这在使用活的或非灭活的生物质时尤其有利。此外，尤其对于使用水的提取或水含量高的提取剂体系具有挑战性的细菌、真菌或酵母的微生物污染，可通过在高温(>50℃)下的提取被阻止。

[0270] 表2：通过在80℃下提取而获得的肩突四扁藻提取物的组分

[0271]

[0272]

[0273] *经水解和衍生化后通过GC测定

[0274] **由氮分析仪(nitrogen analyzer)确定

[0275] 比较在室温(RT)和80℃下提取物的值，显而易见的是，相应于较低温度提取时某些组分被保留(conserved)，而其他组分变化(shifted)。特别地，半乳糖和葡萄糖的含量显著不同(分别从7.8至9.7wt-％和从3.5至7.0wt-％增加)。同样，某些氨基酸的含量显著提高，诸如精氨酸和天冬酰胺(分别为从0.17至0.8wt-％和从0.19至0.39wt-％)。一些其他氨基酸选择性地减少，诸如天冬氨酸从0.76wt-％下降至0.27wt-％以及鸟氨酸从1.26wt-％下降至0.54wt-％。总体而言，除磷酸盐外，大多数无机化合物都被保留。

[0276] 实施例2：液体形式(version)的肩突四扁藻提取物的制备

[0277] 将97g水、79g甘油(99.5％)、0.5％的苯甲酸钠和0.2％的山梨酸钾(两者基于液体混合物的总重量)加入至根据实施例1在80℃下提取获得的4.6g肩突四扁藻提取物干物质，并借助于乳酸将混合物的pH调节至4.5，得到米色至浅棕色溶液，折射率(n20/D)：1.396，甘露醇含量：0.29％。

[0278] 对于另一种液体形式，将根据实施例1在80-90℃下提取而获得的25g肩突四扁藻提取物干物质溶于483g水中，并加入392g甘油(99.5％)和100g 1,2-戊二醇(Hydrolite-5)。获得浅黄绿色，澄清至轻微混浊的溶液；根据L*a*b*颜色系统的颜色：L*88.4、a*-13.6、b*47.5，pH 7.6、甘露醇含量：0.28％。

[0279] 实施例3：肩突四扁藻提取物(干燥的)对离体人体皮脂腺的总脂质含量的影响[0280] 进行从人体皮肤外植体显微解剖的人体皮脂腺的器官培养，以评价根据实施例1中所述制备的肩突四扁藻提取物对皮脂水平的调节活性。提取物以干燥形式施用。

[0281] 去除全厚皮肤样品的表皮后，使用显微(微型)手术剪和解剖刀小心地移出皮脂腺。然后将显微解剖皮脂腺以8个分为一组，在浸入500μL改良Williams’E培养基的24孔板(well plate)中培养至第6天。适应24小时后，更换培养基并用含有待测试的提取物的培养基代替。在培养的第3天和第5天更新培养基。在第6天，收集腺体，并用于定量脂质和蛋白质。为了使生物质可变的腺体的估计生产率具有可比性，对其总皮脂含量进行估算并除以从腺体组织中的提取的蛋白质，获得生成的皮脂与组织蛋白质之间的比例(即脂质mg/蛋白质mg)。

[0282] 为此，将每个皮脂腺组在100μL异丙醇中均质化，以提取脂质，并使蛋白质不溶解。离心后，收集并分析含有提取的皮脂的上清液。使用真空干式蒸发器(vacuum dry evaporator)干燥剩余的沉淀(pellet)，而后在50μL蛋白质裂解缓冲液的存在下切碎(mince)。在适当的培养时间之后，将该提取混合物离心，并且对上清液进行收集和分析。使用直接检测红外光谱仪(Direct Detect IR Spectrometer，Millipore)，通过红外光谱对溶解在异丙醇中的脂质和溶解在裂解缓冲液中的蛋白质进行定量。通过量化的脂质相对量化的蛋白质的归一化(即脂质mg/蛋白质mg)以获得总脂质量。将从被处理组获得的归一化脂质的量与未处理的对照组的量相比较，并以百分比计算调节活性，该归一化脂质即每组皮脂腺产生的皮脂。作为阳性对照，在实验设计中加入5μM辣椒素(Capsaicin)处理。辣椒素是辣椒的有效成分，适用于抑制皮脂生成(sebogenesis)[Tóth et al.,J.Invest.Derm.(2009),129:329-339]。为了进行统计分析，组间差异通过单因素方差分析(one-way anova)和排列检验(permutation test)进行评估，随后进行Dunnett排列测试(Dunnett’s permutation test)。

[0283] 为了更好地理解对提取物的反应，在器官培养的第1天和第6天并行进行了生存力(viability)测试。将刃天青(resazurin)加入孔中(1:11)，并培养2小时。在培养结束时，用荧光计(激发：560nm，发射：590nm)读取培养基的等量样本。然后将培养基替换为普通培养基持续2小时，以除去残留的刃天青。之后，将培养基再次替换为包括测试样品的培养基。以第6天与第1天之间的百分比差值来衡量每个孔中的生存力。

[0284] 为了评估供者反应率(responsiveness)和个体间差异，对从三个不同供者的皮肤样本中获得的皮脂腺进行了提取物测试。

[0285] 表3：肩突四扁藻水提取物(干燥的)对显微解剖人体皮脂腺的脂质和生存力的影响

[0286] 在目前的离体和体外细胞测试中，并通常用于生物学测试，使用干燥形式的扁藻提取物以避免溶剂、甘油或防腐剂体系引起的副作用。

[0287]

[0288] *与未处理相比，所有结果均具有统计学意义，p<0.01

[0289] 结果表明，在80℃下提取获得的肩突四扁藻水提取物(干燥的)出人意料地是一种归一化总脂质的高效的减少剂，而不影响他们的生存力，该归一化总脂质即人体皮脂腺的皮脂含量。其比阳性对照辣椒素更有效，并且即使浓度低5倍也是如此。此外，从所有三个供者获得的皮脂腺对提取物有反应(供者反应率：100％)。

[0290] 实施例4：肩突四扁藻提取物(干燥的)和烟酰胺对离体人体皮脂腺的总脂质含量的协同效应

[0291] 使用与实施例3中所述相同的实验布置(set-up)来评价肩突四扁藻提取物和烟酰胺的组合的协同活性。

[0292] 使用Kull方程(Kull’s equation)计算协同指数SI：

[0293] SI＝C×D/A+C×E/B

[0294] 其中

[0295] A＝通过浓度为x的肩突四扁藻提取物的脂质减少

[0296] B＝通过浓度为y的烟酰胺的脂质减少

[0297] C＝通过浓度为x/2的肩突四扁藻提取物和浓度为y/2的烟酰胺的组合的脂质减少[0298] D＝肩突四扁藻提取物的系数＝>0.5(由于组合中测试了一半浓度)

[0299] E＝烟酰胺的系数＝>0.5(由于组合中测试了一半浓度)

[0300] 对于两个组合的成分的加和活性，获得SI＝1，而SI<1证明具有拮抗活性(观察到的功效低于加和)，并且SI>1证明具有协同活性(观察到的功效高于加和)。实验结果总结于表4。

[0301] 表4：肩突四扁藻提取物和烟酰胺对离体人体皮脂腺的总脂质含量的影响[0302]

[0303] *与未处理相比，所有结果均具有统计学意义，p<0.01

[0304] SI＝13×0.5/11+13×0.5/6＝1.674

[0305] 所获得的SI为1.674清楚地证明肩突四扁藻水提取物和烟酰胺的组合令人惊讶地协同降低了总脂质含量，即人体皮脂腺的皮脂水平。

[0306] 实施例5：肩突四扁藻提取物(干燥的)对人体皮脂腺细胞的基因表达的影响[0307] 根据供应商的说明，将真皮原代人体皮脂腺细胞(来自面部(T区)局部，白种人供者，购自Zen-bio)在37℃下在5％的CO2皮脂基础培养基中进行培养。使用0.01％和0.1％的根据实施例1通过在80℃下提取获得的肩突四扁藻水提取物或DMSO作为媒介物对照(vehicle control)，处理皮脂腺细胞24小时。每个实验进行三次。与DMSO处理相比，通过RT-qPCR测量提取物处理过的细胞中的基因组靶标表达水平。

[0308] 按照制造商的说明，使用Qiaquick RNA分离试剂盒(来自Quiagen)提取并纯化来自经提取物刺激超过24小时的皮脂腺细胞的带有miRNA的总RNA。对于mRNA靶标定量，根据制造商的说明，用Superscript VILO cDNA合成试剂盒(ThermoFisher)对总RNA进行逆转录。分离的RNA的纯度通过分光光度法确定：比率260/280光度法确至2(RNA提取物无蛋白质污染)。计算RQ值并将结果相对于内源性对照GAPDH表达归一化。使用双尾非配对T检验(two-tailed unpaired T-test)进行统计分析(*p值<0.05)。该实验的结果被总结在表5中。

[0309] 表5：用肩突四扁藻水干燥提取物(Tetraselmis suecica water dry extract)处理后的原代人体皮脂腺细胞的基因表达的调节

[0310]

[0311] 结果清楚地表明：肩突四扁藻水提取物抑制参与脂肪酸、甘油三酯和胆固醇产生的大部分基因，从而减少脂质，即皮脂腺细胞的皮脂产生。涉及分析和了解调节脂质合成和储存以及皮脂腺大小的主要途径。

[0312] 肩突四扁藻水干燥提取物能够调节参与脂质产生和储存的基因，并且能够调节专用途径。该脂质诸如：脂肪酸(SREBF1、SCD、APOC1)、甘油三酯(DGAT1)和胆固醇(ACAT1)。该专用途径包括：脂联素(ADIPOR1、APPL1)、LXR/RXR/PPARA(SREBPF1、NH1H3(LXRa)、ACAT1和前列腺素(PTSG2(COX2))。

[0313] 用0.01％的肩突四扁藻水提取物进行处理，在统计学下调了7种基因(APOC1、SREBPF1、APPL1、ADIPOR1、MGAT1、ACAT1、PTSG2(COX-2))。

[0314] 用0.1％的肩突四扁藻水干燥提取物进行处理，在统计学下调了8种基因(SREBF1、NR1H3(LXRa)、APPL1、ADIPOR1、DGAT1、MGAT1、SCD、PTSG2(COX-2))。

[0315] 提取物能够通过抑制参与脂肪酸产生(SREBF1、SCD、APOC1)、甘油二酯(MGAT1)、甘油三酯(DGAT1)和胆固醇(ACAT1)的基因来减少脂质产生。

[0316] IGF-I在诱导人体皮脂腺细胞中的脂质合成中起关键作用。在SEB-1皮脂腺细胞中，IGF-1通过诱导SREBF1增加脂肪生成，SREBF1优先调节脂肪酸合成的基因。

[0317] SCD在皮脂腺中高表达；SCD是一种Δ9一脂肪酸去饱和酶，其分别主要催化饱和脂肪酸棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)转化为顺式-单不饱和脂肪酸(MUFA)棕榈油酸(16:1n7)和油酸(18:1n9)。MUFA在皮脂的成分甘油三酯、胆固醇酯和蜡酯的形成中是重要的酯化底物。

[0318] 过表达的APOC1的转基因小鼠患有发育不良的皮脂腺和高甘油三酯血症。

[0319] 在甘油三酯合成中，DGAT1催化最终和限速步骤。

[0320] MGAT1参与蛋白质结合的和脂质结合的寡糖的合成。脂酰辅酶A：单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)基因因其在肠道内的脂肪吸收的作用而为人们所熟知。已显示MGAT1在哺乳动物细胞系中表现出MGAT活性，通过将脂肪脂酰辅酶A掺入二酰基甘油来特异性地催化二酰基甘油合成。

[0321] ACAT1是催化由游离胆固醇形成胆固醇酯的酶，并在皮脂腺中高表达，其允许胆固醇酯掺入细胞质脂滴中。

[0322] 诱导脂质产生和储存的主要途径是LXR/RXR/PPARA和脂联素。的确，其示出了用LXR配体处理SZ95皮脂腺细胞增强了脂滴在细胞中的累积，并且在用脂联素处理的皮脂腺细胞中脂质合成显著增强。因此，提取物抑制编码负责LXR/RXR/PPARA途径激活的核受体的NR1H3(LXRa)。

[0323] 脂联素受体ADIPOR1及其配体APPL1负责脂联素途径的活化，并且脂联素受体ADIPOR1及其配体APPL1减少。在皮脂腺细胞的3D培养中，通过脂联素处理的皮脂腺细胞中脂质合成显著增强。

[0324] 令人惊讶的是，在PTGS2(COX-2)的基因表达水平上观察到了明显的效果。PTGS2(COX-2)在皮脂腺细胞功能中起主要作用。由于皮脂腺增生，过度表达环氧合酶-2(COX-2)的转基因小鼠表现出皮脂水平增加。因此，期待PTGS2(COX-2)减少以使得皮脂腺大小和皮脂产生的减少。

[0325] 实施例6：肩突四扁藻提取物(干燥的)减少体内皮脂

[0326] 进行两组每组十五名白种人志愿者的随机半脸(split-face)研究。志愿者在家中每天两次(早上和晚上)在两个半额(semi-forehead)上使用测试产品，持续四周。测试产品是具有和不具有通过根据实施例1在80℃下提取而制备的0.05％的肩突四扁藻提取物的水分散凝胶。作为阳性对照/参考，使用在水分散凝胶中配制2％烟酰胺和1％D-泛醇的组合(Z.D.Draelos et al.J.Cosmet.Laser Ther.2006,8:2,96-101)。读数为日常皮脂水平(Casual sebum level)(皮脂计)、皮脂表面百分比(Sebum surface percentage)和活性孔(active pores)的数量(均装有 箔的 )并且在基线(t0)和4周后(t1)进行读取。

[0327] 表6：日常皮脂水平、皮脂表面百分比和活性孔的数量的平均调节

[0328]

[0329]

[0330] n.s.＝无显著性

[0331] 结果清楚地证明，肩突四扁藻水提取物还具有在体内强有力的减少皮脂活性。提取物是能够显著降低所有三种读数(日常皮脂水平为-10.8％，皮脂表面百分比为-31.3％，活性孔的数量为-25.7％)的唯一活性物质。对于阳性对照/参照，2％烟酰胺和1％D-泛醇的组合显著减少日常皮脂水平-16.5％，但并未能够使皮脂表面百分比和活性孔的数量显著减少。安慰剂对三个读数中的任何一个均无显著影响。

[0332] 实施例7：肩突四扁藻提取物(干燥的)对人体角质形成细胞基因表达的影响[0333] 根据供应商的说明，将新生的人体表皮角质形成细胞(nHEK)在包括HKGS-Kit(Gibco)的EpiLife培养基(Gibco)中在5％CO2、37℃条件下进行培养。

[0334] 将根据实施例1通过在80℃下提取获得的肩突四扁藻水提取物以0.025％或培养基作为媒介物对照处理细胞24小时。相较于培养基处理，通过RT-qPCR测量提取物处理过的细胞中的基因组靶标表达水平。

[0335] 使用 Mini Kit(Qiagen)进行RNA分离。使用μCuvetteG 1.0和生物分光光度计(Eppendorf)通过测量260nm处的吸光度来测定总RNA浓度。同时计算纯度对照值(purity control values)，如E260/280和E260/230。根据供应商的说明，使用大容量Applied  Biosystems的RNA-to-cDNA试剂盒)进行逆转录。在PCR热循环仪(PCR Thermocycler,Biometra)中处理样品。对于快速实时PCR，用无核糖核酸酶(RNase)的水和TaqManTM Fast Universal PCR Master Mix(Applied biosystems)稀释cDNA。使用StepOnePlus快速实时荧光定量PCR仪(StepOne Plus Fast Real Time PCR Instrument)(Applied biosystems)进行实时PCR定量。使用StepOne-软件(StepOne-Software)和2-ΔCT方法(相对内源性对照HTRP1的表达进行归一化)进行分析。

[0336] 认为对于上调RQ值≥2和对于下调RQ值<0.5是相关的。

[0337] 表7a：用0.025wt.％的肩突四扁藻水提取物(通过再次溶解干燥的提取物来制备)处理后的人体表皮角质形成细胞的基因表达调节

[0338]

[0339]

[0340]

[0341] 结果清楚地表明，扁藻提取物令人惊奇地对涉及表皮连接，诸如桥粒(“机械”)、紧密、粘附和间隙连接的与细胞之间粘着相关的许多基因有效地上调表达，并且允许在皮肤细胞中相邻细胞之间离子、第二信使和小的代谢物的交换。这些粘着结构不仅对于维持细胞结构和完整性是必要的，而且对于组织发育和形态建立也是必要的。桥粒内的突变是例如许多皮肤脆弱疾病的根本原因。

[0342] 此外，通过用扁藻提取物处理来调节与分化、再上皮化和水/甘油转运相关的基因。

[0343] 在另一个实验中，将根据实施例1通过在80℃或在室温(18-23℃)下提取获得的来自不同的微藻生物质批次的肩突四扁藻水干燥提取物以0.025％或培养基作为媒介物对照处理细胞24小时。相较于上述培养基处理，通过RT-qPCR测量在提取物处理过的细胞中所选基因的基因组靶标表达水平。

[0344] 表7b：用0.025％肩突四扁藻水提取物(通过重新溶解干燥的提取物制备的)处理后的人体表皮角质形成细胞的基因表达调节

[0345]

[0346]

[0347] 结果显示，通过在80℃制备的提取物使六种基因(KRT1、KRT10、CSP14、DCS1、DSP、CTNNB1)上调表达，而在室温下制备的提取物没有影响。六种所选基因(SPRRA1、SPRR1B、DSG1、CLDN1、OCLN、CGN)均被以上两种提取物上调表达。

[0348] 实施例8：肩突四扁藻提取物(干燥的)对AMPs的基因表达的影响

[0349] HaCaT角质形成细胞在EpiLife培养基(Gibco)中在5％CO2，37℃条件下培养。

[0350] 将根据实施例1通过在80℃下提取获得的肩突四扁藻水干燥提取物以0.05％或培养基作为媒介物对照处理细胞24小时。相较于培养基处理，通过RT-qPCR测量提取物处理过的细胞中的基因组靶标表达水平。

[0351] 使用 Mini试剂盒(Qiagen)进行RNA分离。使用μCuvetteG 1.0和生物分光光度计(Eppendorf)测量在260nm处的吸光度来测定总RNA浓度。同时计算纯度对照值，如E260/280和E260/230。根据供应商的说明，使用Applied Biosystems的RNA-to-cDNA试剂盒进行逆转录。在PCR热循环仪(PCR Thermocycler,Biometra)中处理样品。

[0352] 对于快速实时PCR，用无核糖核酸酶(RNase)的水和TaqManTM Fast Universal PCR Master Mix(Applied biosystems)稀释cDNA。使用StepOnePlus快速实时荧光定量PCR仪(Applied biosystems)进行实时PCR定量。使用StepOne-Software和2-ΔCT方法(相对内源性对照HTRP1的表达进行归一化)进行分析。

[0353] 认为对于上调RQ值≥2.5对于和下调RQ值<0.5是相关的。

[0354] 表8：用0.05％的肩突四扁藻水干燥提取物处理后的HaCaT角质形成细胞中AMPs的基因表达的调节

[0355] 基因 RQ值DEFB1[β-防卫素1] 20.8
DEFB103A；DEFB103B[β-防卫素103A/103B] 3.1
ADM[肾上腺髓质素] 3.1
S100A7[牛皮癣素、S100钙结合蛋白A7] 7.4

[0356] 结果清楚地表明：令人惊奇地，扁藻提取物还上调了皮肤细胞中如诸如β-防卫素、肾上腺髓质素和牛皮癣素的抗菌肽的基因表达。

[0357] 实施例9：环氧合酶(COX)-2抑制试验

[0358] COX-2是前列腺素例如PGE2，的合成的可诱导的限速酶。COX-2/PGE 2由角质形成细胞和皮脂腺细胞表达。将测试物质肩突四扁藻水干燥提取物溶解在试验缓冲液(Tris-HCl pH 8.0，100mM)中，并放入96孔半面积微孔板(96-well half area microplate)中。加入辅酶HEME、荧光底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(ADHP)和COX-2。将半面积微孔板在微孔板振荡器上以600rpm的速度培养两分钟。然后加入底物花生四烯酸。COX-2将花生四烯酸转化为前列腺素内过氧化物G2(PGG2)，PGG2还原为相应的醇PGH2。在此反应期间，ADHP产生荧光试卤灵。试卤灵在535nm的激发波长和590nm的发射波长下进行定量。

[0359] 根据以下公式计算在测试物质存在下对COX-2活性的抑制作用：

[0360]

[0361] 缩写含义如下：

[0362] ·试卤灵测试物质：

[0363] 含测试物质和COX-2的孔的试卤灵浓度

[0364] ·试卤灵对照：

[0365] 无测试物质但有COX-2的孔的试卤灵浓度

[0366] ·试卤灵无COX-2对照：

[0367] 没有测试物质并且没有COX-2的孔的试卤灵浓度

[0368] 结果是至少两个独立实验的平均值。

[0369] 表9：肩突四扁藻水提取物(干燥的)对COX-2的抑制

[0370] 测试浓度 相比于对照的COX-2抑制0.025％ 34±5％

[0371] 结果示出了扁藻提取物也抑制COX-2酶活性。

[0372] 实施例10：离体人体皮肤-丝聚蛋白

[0373] 在与培养基(改良的Williams'E培养基)接触的不锈钢穿孔环的气-液界面中培养约8×3mm 的皮肤样品长达六天。在适应24后，将根据实施例1通过在80℃下提取获得的的肩突四扁藻水干燥提取物以0.3ppm或培养基作为媒介物对照局部施用于人体皮肤外植体(每次处理六个外植体)。在培养的第六天，将皮肤样品包埋在适当的培养基中并在液氮中冷冻。在接受特定免疫荧光染色的恒冷箱切片上进行丝聚蛋白的定量分析。用所选择的抗体(丝聚蛋白：兔多克隆(rabbit polyclonal)，圣克鲁斯(SantaCruz))对每次处理的十二个皮肤切片进行免疫染色。通过使用荧光显微镜拍摄每个切片，并分析所得图像。通过评估表皮(无角质层)内染色剂的强度和分布，评估每个玻片中存在的抗原量。然后将获得的数据根据基底层(basal lamina)的长度归一化。

[0374] 表10：离体人体皮肤丝聚蛋白调节

[0375]

[0376] 结果清楚地表明：肩突四扁藻提取物在局部施用后提高了离体人体皮肤的表皮丝聚蛋白水平。

[0377] 实施例11：颗粒物(PM)引起的离体人体皮肤的屏障破坏

[0378] 为了评估肩突四扁藻水提取物(干燥的)对柴油颗粒物引起的皮肤屏障破坏的保护作用，使用了离体人体皮肤外植体。Standard Reference  1650b是从美国国家标准与技术研究院(US National Institute of Standards and Technology，NIST)获得的，旨在用于评估测定在柴油颗粒物和类似基质中选定的多环芳烃(PAHs)和硝基取代的PAHs(nitro-PAHs)的分析方法。在200发动小时的颗粒积累后，从热交换器的稀释管设备中将其收集。使用几种在各种条件下运行的直喷式四冲程柴油发动机(direct injection four-cycle diesel engines)来产生这种颗粒物，并且其应该代表重型柴油发动机(heavy-duty diesel engine)颗粒物的排放。在与培养基(改良的Williams'E培养基)接触的不锈钢穿孔环中，在环境湿度下，培养约8×3mm 的皮肤样品长达三天。将1650b悬浮在PBS中。配制不含(安慰剂)并且含有0.01和0.05％的肩突四扁藻水干燥提取物的水分散凝胶(表12)。在适应24小时后，将制剂局部施用于皮肤外植体上，然后将颗粒物1650b施用于培养箱外90分钟以使其干燥。然后，将柴油颗粒以10μg/cm2局部施用于处理过的和未处理的皮肤上。制剂的施用和用1650b的处理是每天重复(renewed)的。

[0379] 在第三天，收获皮肤外植体以评估皮肤屏障性质。罗丹明B不能穿透完整的皮肤，因此在表皮内部检测到的罗丹明B越多，皮肤屏障的破坏就越大。因此，将皮肤外植体用罗丹明B染色、低温固定(cryo-fixed)并在低温恒温器上切割，以进行随后的图像采集和分析。罗丹明B荧光的分析在表皮区域进行。对于每个皮肤外植体，取两个切片并获取荧光图像。对于每个图像，通过Image-J应用程序(Image-J application，NIH，USA)评估荧光来分析上真皮(upper dermis)。然后将获得的值根据所选区域的尺寸进行归一化。

[0380] 表11：制剂

[0381]

[0382]

[0383] 表12：罗丹明B渗透的离体人体皮肤结果

[0384]

[0385] 如所期望的，用颗粒物1650b对人体皮肤外植体进行局部处理，显著增加了罗丹明B向皮肤的渗透，从而增加了皮肤屏障的破坏。

[0386] 与单独的1650b处理相比，安慰剂使罗丹明B的渗透降低了15％。肩突四扁藻提取物使得罗丹明B渗透的剂量依赖性与单独的1650b处理相比，降低了30％和45％，并且与安慰剂+1650b处理相比，降低了19％和35％。

[0387] 实施例12：TEER试验

[0388] 跨膜电阻(TEER)是广泛接受的用于测量上皮单层的细胞培养物模型中紧密连接动态的完整性的定量技术。TEER值是细胞屏障完整性或强度的强指标。组织的阻力增加是更高密度的结果。因此，增加的阻力涉及改善的皮肤屏障。

[0389] 将新生的人体表皮角质形成细胞(nHEKs)以1.5×105细胞/植入物(cells per inserts)的浓度接种在0.47cm2细胞培养植入物(cell culture insert)中。在细胞培养基中培养四天后，将根据实施例1中给出的描述制备的肩突四扁藻提取物在细胞培养基中以如下所示的最终体积系统性地施用八天。在物质处理后，测定TEER。细胞培养基用作对照。

[0390] 表13：TEER试验结果

[0391]

[0392] *不植入细胞

[0393] 结果清楚地表明：与未处理(培养基对照)相比，肩突四扁藻提取物提高了TEER值。

[0394] 实施例13：制剂实施例

[0395] 在制剂1至22中，以下两种芳香油PFO 1和PFO 2分别用作香精(DPG＝二丙二醇)。

[0396] 表14：具有玫瑰气味的芳香油PFO 1(成分量b.w.)(amounts in parts b.w.)[0397]

[0398]

[0399] 表15：具有白花和麝香气味的芳香油PFO 2(成分量b.w.)

[0400]

[0401]

[0402] 表16：化妆品制剂(成分量b.w.)

[0403] 1＝敏感油性皮肤的皮肤镇静香膏(calming balm)

[0404] 2＝着色面香膏SPF 15(Tinted Face Balm，SPF 15)

[0405] 3＝适合油性皮肤的冲洗型净化面膜(Rinse-off purifying mask)

[0406] 4＝晚霜W/O

[0407] 5＝面部清洁凝胶

[0408] 6＝油性皮肤的面部滋补剂

[0409] 7＝用于油腻的头发的去头皮屑洗发露

[0410] 8＝用于易于痤疮皮肤的防晒液SPF 30

[0411] 9＝用于不纯净油性皮肤的亮肤日间护理液O/W

[0412] 10＝抗痤疮皮肤霜

[0413] 11＝三合一皮肤净化洗净+磨砂+面膜

[0414]

[0415]

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[0419]

[0420]

[0421]

[0422]

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[0424]

[0425]

[0426] 表17：化妆品制剂12至22(成分量b.w.)

[0427] 12＝毛孔收缩液

[0428] 13＝用于不纯净皮肤的卸妆液

[0429] 14＝抗痤疮清洁摩斯

[0430] 15＝用于油性皮肤的三相清除卸妆乳液(洗液)

[0431] 16＝溶液胶束(Eau micellaire)

[0432] 17＝净化/抗瑕疵混合物(Purifying/Anti-Imperfections Cocktail)

[0433] 18＝用于年轻肌肤的紧致精华液

[0434] 19＝遮瑕棒

[0435] 20＝发膜

[0436] 21＝水性基头发和头皮精华液

[0437] 22＝护发素

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