[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种假病毒及其包装方法和药物评估系统。

[0002] 在病毒功能研究中，最直接高效的手段当然是操作野生型活病毒。但对于新型冠状病毒这类致病性和传染性很强的病毒，操作野生型活病毒需要在三级以上生物安全防护(P3)实验室里进行，目前国内只有40多家P3实验室，大多属于CDC系统，非常规科研用途。且P3实验室为了防止生物危害，有非常苛刻的防护条件，极大降低了操作效率。

[0003] 为了能在二级生物安全实验室进行新冠病毒的相关研究，假病毒技术是一种非常有效的替代研究手段。与活病毒相比，假病毒具有相似的细胞感染特点，可以模拟野生型病毒感染细胞的早期过程，而且假病毒内携带的报告基因，可以快速方便地进行各种检测和分析。因此，假病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的关系、克隆病毒的受体，更重要的是可以替代传统的中和试验，用于疾病的鉴别诊断、抗病毒药物的评估筛选及疫苗免疫效果的评价等研究。

[0004] SARS-CoV-2与SARS相似，具有相似的基因组构成和病毒结构特征，二者都是通过其包膜Spike蛋白的RBD(receptor binding domain)识别和结合位于靶细胞表面的ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)受体，通过膜融合，进入内体/溶酶体途径达到感染。Spike(S)蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，其含有两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。同样地，包装一种用于模拟2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染机制的假病毒，S蛋白也成为其设计的关键要素。

[0005] 驱动S蛋白表达的启动子的筛选难度大。CMV是人们从人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)中发现的强启动子。因此，只要CMV病毒能够感染的细胞，该启动子都能起始转录过程。是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子。然而，在2004年，科学家在包装SARS-CoV假病毒系统时发现，在包装细胞中，CMV启动子无法驱动野生型S蛋白的表达，通过密码子优化，S蛋白的量虽有所增加，但仍无法弥补启动子的不足。

[0047] 为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

[0048] 本发明的主要创新点在于：在包装假病毒时，选择以CBA为启动子驱动包膜蛋白Spike的表达、以人源表达优化的Spike DNA序列取代野生型Spike DNA序列，借此获得可高表达S包膜蛋白的慢病毒假病毒。在构建本发明新冠肺炎药物评估系统时，还构建了可过量、稳定表达hACE2受体的单克隆293T的细胞株，以放大假病毒对细胞的感染效应，有助于利用该系统做药效评估时，获得较准确的评估结果。在克隆纯化过程中，本发明独创了“澄清→核酸酶消化→阴离子交换层析→浓缩换液→分子排阻层析”五步式慢病毒载体的纯化方法，可获得高纯度的慢病毒假病毒，置于DMEM培养基或1mg/ml的BSA中于-80℃保存，可较长时间保存的病毒载体。

[0049] 以下结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案和效果。

[0050] 一、GFP假病毒的构建

[0051] (1)将启动子CBA promoter亚克隆到PBSK-MCS质粒，得到载体质粒PBSK-CBA。该克隆过程为：将PBSK-MCS质粒用限制性内切酶KpnI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约为2900bp。将CBA promoter进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和KpnI/XbaI酶切位点。PCR片段利用KpnI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为900bp。胶回收试剂盒分别回收PBSK载体和CBA启动子片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒PBSK-CBA，进行KpnI和XbaI双酶切鉴定后测序，PBSK-CBA载体构建成功。

[0052] (2)将Spike DNA序列进行人源表达优化，得到Spike-opt DNA序列。优化方法为：在苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成并对全序列进行人源表达优化。

[0053] 原始Spike DNA序列(WT)参见SEQ ID No:7，优化后Spike-opt DNA序列(opt)参见SEQ ID No:8所列序列。原始S蛋白表达序列和人源表达优化后的S蛋白表达序列的比对如下：

[0054]

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061] (3)将Spike-opt DNA序列亚克隆到PBSK-CBA载体质粒中，pSpike过表达质粒。克隆的操作过程为：

[0062] 将PBSK-CBA质粒用限制性内切酶XbaI和XhoI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约4000bp。将Spike-opt进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和XbaI/XhoI酶切位点。PCR片段利用XbaI和XhoI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为3800bp。胶回收试剂盒分别回收PBSK-CBA载体和Spike-opt片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行XbaI和XhoI双酶切鉴定后测序，PBSK-CBA-Spike-opt构建成功。

[0063] 经测序可知，PBSK-CBA-Spike-opt质粒的基因序列为SEQ ID NO:1。

[0064] (4)将全长编码GFP的cDNA亚克隆到pLVX-IRES-Puro载体质粒中得到报告基因载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro。上述过程条件为：将pLVX-IRES-Puro质粒用限制性内切酶EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约8800bp。将GFP进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和EcoRI/XbaI酶切位点。PCR片段利用EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为720bp。胶回收试剂盒分别回收pLVX-IRES-Puro载体和GFP片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-
16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定后测序，pLVX-GFP-IRES-Puro构建成功。

[0065] 经测序可知，报告基因载pLVX-GFP-IRES-Puro体质粒的基因序列为SEQ ID NO:2。

[0066] (5)将步骤(3)的载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro、步骤(3)的pSpike过表达质粒(PBSK-CBA-Spike-opt质粒)和包装辅助质粒psPAX2(购自Addgene，商品编号Addgene plasmid#12260)，共转染前一天接种于10层细胞工厂的293T细胞，转染后6小时更换新鲜DMEM培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化。

[0067] 转染条件和过程的条件为：转染前24小时接种1.00E+09 293T细胞于10层细胞工厂中。配置转染体系含80ml opti-MEM培养基，750ug pLVX-luciferase-IRES-Puro质粒，500ug psPAX2质粒，250ug pSpike质粒和转染试剂。转染体系加入10层细胞工厂，轻柔混匀。转染6小时后更换新鲜的DMEM 1000ml。继续培养细胞，转染完72小时后收获培养基(含假病毒)。

[0068] 纯化采用GE的AKTA avant层析系统，采用DEAE层析，切向流过滤和core700层析纯化工艺，纯化得GFP假病毒，具体纯化过程如下：

[0069] ①MF(澄清):病毒收获液经过滤(0.45μm)的处理，以除去293T细胞及碎片等不溶性微粒，提高溶液的澄清度，以便后续的层析纯化处理。

[0070] ②Benzonase treatment(核酸酶消化)：用25U/ml的Benzonase于37℃处理1小时，将转染过程残留的质粒DNA和死去的细胞释放的基因组等污染物去除85％以上。也可以将第一步的澄清液进行浓缩以后，再进行本步骤，如此既可以降低消化酶的使用成本，亦可进一步提高核酸的去除率。

[0071] ③IEX(阴离子交换层析)：采用整体柱CIM DEAE，进行阴离子交换层析，该步骤可以去除99％的蛋白和DNA污染物，病毒收率很高达80％以上，且可在高流速下保持更高的载量。如图3所示，为本步骤的DEAE纯化慢病毒图谱，图谱显示杂质蛋白在第一个峰出现，收集病毒峰(如图中箭头所指)。

[0072] ④UF/DF(浓缩换液)：IEX层析的洗脱液经浓缩换液后，再进行最后的分子排阻层析纯化。由于慢病毒的颗粒较大，直径约80-120nm，需要采用截留分子量500kDa的膜做TFF(切相流过滤)。在浓缩换液过程，一些小分子杂质可以有效去除，从而达到了提纯的目的。

[0073] ⑤SEC(分子排阻层析)：采用Core 700层析填料，将大于700kDa的病毒等粒子经外水体积排出，而分子量更小的杂质则进入填料的孔内，被吸附于其中，上样量大，除杂能力好。该步骤收率可达到40％。如图4所示，为本步骤的Core 700纯化慢病毒图谱，图谱显示病毒在第一个峰出现(如图中箭头所指)，杂质蛋白在第二个峰出现。

[0074] ⑥Storage(保存)：SEC纯化液，采用0.2um膜过滤，分装，于-80℃保存。由于在反复冻融中假病毒的感染能力会极大降低，因此将其置于DMEM培养基或1mg/ml的BSA中保存，提供冻融过程的保护。

[0075] 二、Luciferase假病毒的构建

[0076] 采用上述相同的方法和条件，只是将第(4)步中，将“全长编码GFP的cDNA”替换为“全长编码luciferase的cDNA”，亚克隆到pLVX-IRES-Puro，得到报告基因载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro。其余步骤则均按照第“一”部分的(1)—(3)、(5)的方法操作。

[0077] 上述过程条件为：将pLVX-IRES-Puro质粒用限制性内切酶EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约8800bp。将luciferase进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和EcoRI/XbaI酶切位点。PCR片段利用EcoRI和XbaI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收PCR片段，约为1650bp。胶回收试剂盒分别回收pLVX-IRES-Puro载体和luciferase片段，T4 DNA连接酶连接室温反应15分钟，连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物5ul转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定后测序，pLVX-luciferase-IRES-Puro构建成功。

[0078] 经测序可知，报告基因载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro的基因序列为SEQ ID  NO:3。其余操作步骤和条件参照第“一”部分的(1)-(3)、(5)进行，最终包装得luciferase假病毒。

[0079] 三、采用不同启动子构建假病毒时S蛋白的表达量比较

[0080] 采用上述相同的方法和条件，只是替换利用不同的启动子(CBA、CMV、EF1a)和野生型Spike DNA序列(未进行人源表达优化)来构建假病毒。

[0081] 分别将启动子CBA、CMV、EF1a亚克隆到PBSK-MCS质粒，分别纯化得到载体质粒PBSK-CBA、PBSK-CMV和PBSK-EF1a。

[0082] 将野生型Spike DNA序列分别亚克隆到载体质粒PBSK-CBA、PBSK-CMV和PBSK-EF1a中，得到PBSK-CBA-Spike质粒(基因序列为SEQ ID No:5)、PBSK-CMV-Spike质粒和PBSK-EF1a-Spike质粒(CMV和EF1a为现有常用启动子)。

[0083] 采用Western Blot检测，上述三种不同质粒包装的假病毒中，S蛋白的表达情况，结果如图1所示。结果证明以CMV,CBA和EF1a三种不同启动子比较，以CBA promoter为启动子驱动S蛋白表达最强。

[0084] 四、野生型Spike DNA和人源表达优化型Spike-opt DNA构建假病毒时S蛋白的表达量比较

[0085] 采用上述相同的方法和条件，只是在第(2)步中，采用野生型的(WT)Spike DNA序列亚克隆到PBSK-CBA载体质粒中，再利用GE的AKTA avant层析系统纯化，得到PBSK-CBA-Spike质粒(其序列为SEQ ID No:5)，比较野生型Spike DNA和优化型Spike-opt DNA构建的假病毒中S蛋白的表达情况。

[0086] 采用Western Blot检测，检测由PBSK-CBA-Spike质粒和PBSK-CBA-Spike-opt(其序列为SEQ ID No:1)质粒包装的假病毒中S蛋白的表达情况，其结果如图2所示。结果证明以，野生型的(WT)Spike DNA与密码子优化的Spike DNA-opt相比，经过密码子优化后的S蛋白表达更强。

[0087] 五、GFP假病毒和Luciferase假病毒感染活力的检测

[0088] (1)Luciferase假病毒：将高表达hACE2的293T细胞接种在培养皿中,感染前1小时更换含polybrene培养基。分别以0.05μL、0.5μL、5μL的Luciferase假病毒感染细胞。16小时后，换新鲜培养基。感染72小时后，利用荧光素酶报告系统检测病毒感染活力，荧光素酶活性与假病毒用量呈正比。结果如图5所示，Luciferase假病毒的感染活性为5E+10RLU/ml。

[0089] (2)GFP假病毒：将高表达hACE2的293T细胞接种在培养皿中,感染前1小时更换含polybrene培养基。分别以0.0005μL、0.005μL、0.05μL、0.5μL、5μL的GFP假病毒感染细胞。16小时后，换新鲜培养基。感染72小时后，利用荧光显微镜检测病毒感染活力，荧光强度与假病毒用量呈正比。结果如图6所示，GFP假病毒感染活性为7E+07TU/ml。

[0090] 以上结果表明，本发明所包装的Luciferase假病毒和GFP假病毒都对细胞具有很强的病毒感染活力，且感染活力可直接采用荧光检测设备得到直观体现。

[0091] 六、新冠病毒药物评估系统的构建

[0092] (1)慢病毒载体制备

[0093] 将pLVX-IRES-Puro质粒用限制性内切酶EcoRI和MluI于37摄氏度进行双酶切1小时，琼脂糖电泳后切胶回收载体片段，约7600bp。将ACE2-IRES-BSD进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上25bp同源臂。PCR片段琼脂糖电泳后切胶回收，约为3500bp。胶回收试剂盒分别回收pLVX载体和ACE2-IRES-BSD片段，加入10ul无缝克隆体系，50摄氏度反应15分钟，无缝克隆产物转化至大肠杆菌：取5ul产物转化感受态DH5a 100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-
16h。挑取单克隆菌落接种于4ml含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h。质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行EcoRI和XbaI双酶切鉴定后测序，pLVX-ACE2-IRES-BSD构建成功(结构如图7所示)。经测序，载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD的基因序列为SEQ ID NO:4。然后，以载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD、包膜蛋白质粒pMD2.G(购自Addgene，商品编号为Addgene plasmid#12259)和包装质粒psPAX2(购买自Addgene,商品编号为Addgene plasmid#12260)，转染293T，包装得到hACE2慢病毒载体。

[0094] (2)基于LentiQ工艺的慢病毒载体纯化

[0095] hACE2慢病毒载体的纯化，按照第“一”部分步骤(5)中①-⑥所列的“澄清→核酸酶消化→阴离子交换层析→浓缩换液→分子排阻层析”五步式纯化方法进行纯化，使产物纯度极高；同时采用0.2um膜过滤，分装，置于DMEM培养基或1mg/ml的BSA中于-80℃保存，可较长时间保存的病毒载体。

[0096] (3)获得稳定表达hACE2的单克隆293T的细胞株

[0097] 利用VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD感染293T细胞，感染24小时后更换新鲜培养基，加入抗生素blasticidin(浓度为30ug/ml)筛选10-12天并利用无限稀释法使细胞单克隆化，已经获得过量表达hACE2的293T混合克隆和单克隆细胞株。

[0098] 通过Western Blot验证hACE2的表达，结果如图8所示，图示结果可知，混合克隆和单克隆细胞株中hACE2均有稳定表达。

[0099] (4)筛选感染灵敏度提高数倍的单克隆细胞株

[0100] 通常情况下，经过上述第(3)步，已获得了稳定高表达hACE2基因的混合克隆和单克隆细胞株。本步骤是优选步骤而非必经步骤。

[0101] 本步骤进一步筛选感染灵敏度更高的单克隆细胞株。具体是：

[0102] ①将过表达和ACE2的293T细胞混合克隆和单克隆细胞株利用胰蛋白酶消化并计数，接种于1.5E+5个细胞于12孔板每孔中。

[0103] ②24小时后，更换含有8ug/ml polybrene的新鲜DMEM新鲜培养基500ul。加入2E+6vg携带报告基因GFP的假病毒(前述制备的GFP假病毒)。

[0104] ③感染24小时后更换含有2ug/ml puromycin的新鲜培养基，继续培养，每2-3天更换培养基。

[0105] ④培养一周以后，筛选计数GFP阳性集落数，获得比混合细胞克隆感染灵敏度提高数倍的单克隆细胞株。

[0106] 结果如图9所示，经进一步筛选后，得到表达ACE2受体能力最强的YJ1B09单克隆细胞株。相比混合克隆和其它单克隆细胞株，YJ1B09更容易被假病毒感染。因此，本发明的评估系统中，优选以本步骤筛选的YJ1B09细胞株作为药物评估假病毒试剂盒中的固定搭配。

[0107] 七、新冠病毒药物评估系统的应用

[0108] 现以DLVT001和DLVT002两种药物为例，举例说明本发明的包含“GFP假病毒或luciferase假病毒、过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株”的药物评估系统(试剂盒)，在评估新冠肺炎药物有效性中，应用方法如下：

[0109] (1)、细胞接种：接种过量表达人ACE2基因的293T细胞株于六孔板中，至过夜20-30％密度为宜。

[0110] (2)、药物提前处理：感染前1小时更换含polybrene培养基，同时加入阳性对照(Ctrl组)和合适浓度药物(分别是DLVT001和DLVT002)。

[0111] (3)、假病毒感染：加入层析纯化的高滴度GFP假病毒，24小时后更换含有抗生素的新鲜培养基。每三天更换一次。

[0112] (4)、显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的细胞。细胞筛选7-10天后，观察细胞集落，待肉眼可见后，吸光培养基，进行结晶紫染色。

[0113] 结果如图10所示，与Ctrl组相比，DLVT001和DLVT002两组的绿色荧光强度明显减弱，由此说明，这两种药物均能明显抑制假病毒对细胞的感染。