[0001] 本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及生物标志物及其应用，更具体地，本发明涉及mtDNA点突变率作为卵子质量生物标志物的用途，试剂盒，试剂在制备试剂盒中的用途，药物组合物，试剂在制备药物中的用途，筛选药物的方法，以及判断卵子质量高低、判断药物治疗女性不孕不育有效性或判断女性不孕不育患者预后效果的系统。

[0002] 年龄是影响女性生育能力的关键因素之一。女性生育率通常在24岁时达到高峰，30岁后下降，50岁后很少发生妊娠。近年来，不孕和生育能力低下的现象日益增多，最可能的解释是由于环境的快速变化而导致。

[0003] 因而，现阶段找到一种新的特异性反应卵子质量的生物标志物，对于预防及治疗不育，意义重大。

[0037] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0038] 实施例1

[0039] 实验方法：发明人分析合作单位的卵胞质内单精子注射(ICSI)的女性患者的临床数据，根据年龄把女性患者分为年轻组(不超过30岁)和年老组(不低于38岁)，对2017年5月至2018年3月进行ICSI的157例年轻组和103例老年组的女性患者卵子的囊胚形成率进行了系统分析。实验结果如图1所示。

[0040] 图1显示了本发明中接受ICSI的157例年轻组和103例老年组的女性患者卵子的囊胚形成率。结果表明，年轻组的囊胚形成率高于老组，反应了年老女性患者的卵子质量比年轻女性患者的卵子质量差。

[0041] 实施例2

[0042] 实验方法：发明人从合作单位收集经历ICSI后不成熟的废卵，分别获得了9例年轻女患者的卵子和10例年老女患者的卵子，将每例患者1-4例不成熟的废卵置入含有20μL细胞裂解缓冲液的离心管中，裂解液配比为17.75μL H2O，2μL 10×KOD缓冲液，0.25μL蛋白酶K。裂解程序：55℃45分钟，94℃5分钟，4℃保持。然后取各取5μL卵子裂解液进行线粒体基因组的PCR扩增，4对引物分别用于扩增线粒体基因组3561-9794区域，9795-14567区域，14562-139区域和115-3560区域，这4个区域覆盖了线粒体基因组的全长。所用引物如表1所示，PCR条件：95℃变性5分钟，然后40个循环：94℃变性30秒，57℃退火45秒，68℃延伸，按照每分钟1000bp计算每个片段的延伸时间(3561-9794片段6分钟30秒，9795-14567片段5分钟，14562-139片段2分钟，115-3560片段3分钟30秒)；然后68℃延伸10分钟后，4℃保存。把四个PCR片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，把4个片段混合后，进行高通量二代测序，分析线粒体基因组的突变率。实验结果如图2所示。

[0043] 表1：用于扩增少量卵子的mtDNA的引物

[0044]引物名称 引物序列
3561-FP ATGAACCCCCCTCCCCATACCC(SEQ ID NO：1)
h1-9794-R1 TGTTGAGCCGTAGATGCCGTCGGAAAT(SEQ ID NO：2)
h1-9795-F2 TTTTTTGTAGCCACAGGCTTCCACGGACT(SEQ ID NO：3)
h1-14567-R2 TGTGGTCGGGTGTGTTATTATTCT(SEQ ID NO：4)
h1-14562-F3 CCACACCGCTAACAATCAAT(SEQ ID NO：5)
h1-139-R3 GAATCAAAGACAGATACTGCGACAT(SEQ ID NO：6)
h1-115-F4 ATGTCGCAGTATCTGTCTTTGATTC(SEQ ID NO：7)
3560-RP AGTAGAAGAGCGATGGTGAG(SEQ ID NO：8)

[0045] 图2显示了本发明中9例年轻女患者的卵子和10例年老女患者的卵子的线粒体基因组点突变数目。结果表明，年老女患者的卵子线粒体基因组点突变数目明显高于年轻女患者线粒体基因组点突变数目。

[0046] 实施例3

[0047] 实验方法：发明人对图2的结果进行进一步分析，分析线粒体基因组点突变的突变频率。实验结果如图3所示。

[0048] 图3显示了本发明中9例年轻女患者的卵子和10例年老女患者的卵子线粒体基因组点突变的突变频率。结果表明，年老女患者的卵子线粒体基因组点突变频率主要位于(0.002,0.005]之间，并且年老女患者卵子的这一区域的点突变数目明显高于年轻女患者。

[0049] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

[0050] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。