技术领域
[0001] 本发明涉及功能性磁性微球领域，具体涉及一种磁性纳米颗粒及其应用。
相关背景技术
[0002] 细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）包括外泌体、微泡、凋亡小体，是机体释放到细胞外的膜性小囊泡，其作为细胞间信号传递者，在生理或病理情况下发挥重要调节作用。其中外泌体（Exosomes，EXO，30-150nm）作为一种可远距离传递生物信息的载体，参与调控重要的细胞生理活动，在维持组织稳态、免疫应答、细胞凋亡、血管生成、炎性反应等生理病理过程中均发挥重要作用，外泌体作用的发挥依赖于其在系统中的数量、转运和分布，外泌体可能通过调控机体免疫功能、促进肿瘤转移前微环境的形成、促进肿瘤血管生成以及直接作用于肿瘤细胞等途径，影响着肿瘤的转移。
[0003] 此外，外泌体的生物学分布在免疫反应及病毒传播中的作用同样备受关注。因此，根据具体疾病特征精确操纵内源性外泌体的生物学分布，以调控其生物学效应的发挥至关重要。
[0004] 然而，鉴于内源性循环外泌体分布规律的机理尚不清楚，通过对分子信号的调控难以实现精确操控其分布。随着纳米医学的快速发展，智能纳米颗粒被广泛应用于精确靶向及分子传递，应用较多的是被作为药物的输送载体，用于疾病特异性靶向治疗。但是，纳米颗粒在输送外泌体，特别是内源性外泌体方面的研究较少。
[0005] 据此，在功能性磁性微球领域，存在将纳米颗粒应用于输送外泌体，作为可按需设计和操作精确外泌体生物分布的工具的强烈需求。
具体实施方式
[0119] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚的呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0120] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。由此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
[0121] 在本发明中，CD9、CD63和CD81均为跨膜四分子蛋白，在不同细胞中与细胞生长、动力、信号传导和粘附效应有关；
MLC是指肌球蛋白轻链；
TEOS是指正硅酸乙酯；
KH570是指硅烷偶联剂；
DMSO是指二甲基亚砜；
Tween20是指吐温20；
PBS是指磷酸缓冲盐溶液；
PBST是指磷酸盐吐温缓冲液；
抗CD63单克隆抗体，也可描述为Anti-CD63，购自Santa Cruz Biotechnology公司，编号sc-5275；
抗MLC单克隆抗体，也可描述为anti-MLC，购自Abcam公司，编号ab680；
GMNPEC-EXO是指结合双功能抗体pH响应释放的磁性纳米颗粒GMNPEC与外泌体的复合
物；
GMNPN-EXO是指结合IgG抗体pH响应释放的磁性纳米颗粒GMNPN与外泌体的复合物；
扫描电镜购自日本日立公司，型号S-4800。
[0122] 在本发明中，术语“直径”是指颗粒表面上两个对映点之间的最大距离；
术语“核”是指每个磁性纳米颗粒中存在的磁芯，能够提供磁性；
术语“壳”是指覆盖磁性纳米颗粒核芯的外壳，能够保护磁性核心在中性或酸性环境中的磁性并保证后续功能性化学集团的连接；
术语“晕”能够保证磁性纳米颗粒在血液中长时间循环而不被吞噬，具有pH响应性释放并能结合功能性抗体以捕获体内囊泡；
术语“基团”是指与磁性纳米颗粒表面结合的化学基团，官能团可以共价或非共价地连接到磁性纳米颗粒的壳；
术语“抗体”包括免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或完全合成产生的，及其片段，该术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括多肽，其包含来自免疫球蛋白基因的框架区或其特异性结合并识别抗原的片段。术语“抗体”的使用意味着包括完整抗体，多克隆，单克隆和重组抗体，和其片段，并且还包括单链抗体，人抗体，人源化抗体，鼠抗体，嵌合体，小鼠-人，小鼠-灵长类动物，灵长类动物-人单克隆抗体，抗体片段，如scFv，Fab，Fab'，Fv，dAb，纳米抗体，Fd片段，双抗体和抗体相关多肽。
抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能即可；
在本发明中，磁性纳米颗粒的尺寸和结构允许其在水性介质中保持分散足够的时间以
允许磁性纳米颗粒与靶分子之间的结合。
[0123] 在本发明中，在一些实施例中，多个磁性纳米颗粒处于固态；在一些实施例中，多个磁性纳米颗粒分散在液体中；在另一些实施例中，组合物还包含水溶液。在实施例中，水溶液是水、乙醇、异丙醇、TE缓冲液、PBS、PBS-Tween20、TBS或TBS-Tween20。
[0124] 在本发明中，在一些实施例中，本发明磁性纳米颗粒还适用于体液检查；在一些实施例中，体液用作液体活组织检查以诊断和监测疾病，例如癌症。在一些实施例中，体液是血液、血清、血浆、唾液、脑脊液、尿液、精液或腹水；在具体的实施例中，体液是血液、血清或血浆；在另一些实施例中，从健康的人体液中收集体液；在另一些实施例中，从患有或怀疑患有疾病的个体收集体液；在另一些实施例中，从患有或怀疑患有癌症的患者收集体液；在另一些实施例中，从患有或怀疑患有传染病的患者收集体液；在具体的实施例中，从患有或怀疑患有急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死或心房心肌梗死的患者中收集体液。
[0125] 实施例1本实施例提供一种磁性纳米颗粒，所述磁纳米颗粒包含核、壳和晕，所述壳覆盖所述
核，所述晕覆盖所述壳。
[0126] 在一些实施例中，所述晕还包含蛋白质、多肽、多糖、适体或离子。
[0127] 在一些实施例中，所述晕还包含pH响应性基团。
[0128] 在一些实施例中，所述pH响应性基团在中性或酸性条件下响应。
[0129] 在一些实施例中，所述pH响应性基团包含包含腙键、酯键和醛基。
[0130] 在一些实施例中，所述蛋白质选自跨膜四分子蛋白。
[0131] 在一些实施例中，所述跨膜四分子蛋白选自CD9、CD63和CD81中的一种或几种。
[0132] 在一些实施例中，所述多肽选自CP05。
[0133] 在一些实施例中，所述蛋白质通过所述pH响应性基团连接于晕。
[0134] 在一些实施例中，所述蛋白质为抗体。
[0135] 在一些实施例中，所述多糖选自壳多糖、琼脂、菊糖和淀粉中的一种或几种。
[0136] 在一些实施例中，所述适体选自RNA、单链DNA和双链DNA中的一种或几种。
[0137] 在一些实施例中，所述离子选自气体元素离子、酸根、金属离子和非金属离子中的一种或几种。
[0138] 在具体的实施例中，所述气体元素离子为氧原子。
[0139] 在具体的实施例中，所述酸根为硫酸根离子。
[0140] 在具体的实施例中，所述金属离子为铁离子或亚铁离子。
[0141] 在具体的实施例中，所述非金属离子为碘离子或溴离子。
[0142] 在一些实施例中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。
[0143] 在一些实施例中，所述抗体来源选自兔源、鼠源、山羊源、绵羊源、鸡源和/或人源。
[0144] 在一些实施例中，所述抗体为单克隆抗体。
[0145] 在一些实施例中，所述抗体包含抗CD9单克隆抗体、抗CD63单克隆抗体和/或抗CD81单克隆抗体。
[0146] 在一些实施例中，所述抗体还包含疾病的治疗性抗体。
[0147] 在一些实施例中，所述疾病包含心肌梗死、自身免疫、病毒传播或肿瘤转移。
[0148] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0149] 在一些实施例中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0150] 在一些实施例中，所述心肌缺血梗死的治疗性抗体为抗MLC单克隆抗体。
[0151] 在一些实施例中，所述抗体的质量总和与磁性纳米颗粒的质量比为0.1-61%。
[0152] 在一些实施例中，所述抗CD9单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0153] 在一些实施例中，所述抗CD63单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0154] 在一些实施例中，所述抗CD81单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0155] 在一些实施例中，所述抗MLC单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为40%。
[0156] 在一些实施例中，构成所述核的材料包含金属氧化物。
[0157] 在一些实施例中，所述金属氧化物为氧化铁。
[0158] 在一些实施例中，所述氧化铁为四氧化三铁。
[0159] 在一些实施例中，构成所述壳的材料包含二氧化硅或二氧化钛。
[0160] 在一些实施例中，所述二氧化硅为无定形二氧化硅，所述二氧化钛为无定形二氧化钛。
[0161] 在一些实施例中，其中，所述二氧化硅为结晶形二氧化硅，所述二氧化钛为结晶形二氧化钛。
[0162] 在一些实施例中，所述晕包含腙键、聚乙二醇及醛基。
[0163] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为100 nm-2 μm。
[0164] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为600-800 nm。
[0165] 本发明的磁性纳米颗粒包含核、壳和晕，所述壳覆盖所述核，壳保护核，壳防止磁性材料从核泄漏；所述晕包含pH响应性基团，能够在中性或酸性条件下响应性释放；构成所述晕的材料包含聚乙二醇，能够保证纳米颗粒抗生物污染并在体内长时间循环；所述晕还提供用于结合靶分子的化学基团。
[0166] 实施例2本实施例提供一种可转移外泌体的磁性纳米颗粒，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒
的活性成分为实施例1所述的磁性纳米颗粒。
[0167] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的核为四氧化三铁，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的壳为二氧化硅，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的晕为腙键-聚乙二醇-醛基，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的抗体通过醛基连接于所述晕。
[0168] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的抗体包含抗CD63单克隆抗体和抗MLC单克隆抗体。
[0169] 实施例3本实施例提供一种组合物，所述组合物包含磁性纳米颗粒。
[0170] 在一些实施例中，所述磁纳米颗粒包含核、壳和晕，所述壳覆盖所述核，所述晕覆盖所述壳。
[0171] 在一些实施例中，所述晕还包含蛋白质、多肽、多糖、适体或离子。
[0172] 在一些实施例中，所述晕还包含pH响应性基团。
[0173] 在一些实施例中，所述pH响应性基团在中性或酸性条件下响应。
[0174] 在一些实施例中，所述pH响应性基团包含包含腙键、酯键和醛基。
[0175] 在一些实施例中，所述蛋白质选自跨膜四分子蛋白。
[0176] 在一些实施例中，所述跨膜四分子蛋白选自CD9、CD63和CD81中的一种或几种。
[0177] 在一些实施例中，所述多肽选自CP05。
[0178] 在一些实施例中，所述蛋白质通过所述pH响应性基团连接于晕。
[0179] 在一些实施例中，所述蛋白质为抗体。
[0180] 在一些实施例中，所述多糖选自壳多糖、琼脂、菊糖和淀粉中的一种或几种。
[0181] 在一些实施例中，所述适体选自RNA、单链DNA和双链DNA中的一种或几种。
[0182] 在一些实施例中，所述离子选自气体元素离子、酸根、金属离子和非金属离子中的一种或几种。
[0183] 在具体的实施例中，所述气体元素离子为氧原子。
[0184] 在具体的实施例中，所述酸根为硫酸根离子。
[0185] 在具体的实施例中，所述金属离子为铁离子或亚铁离子。
[0186] 在具体的实施例中，所述非金属离子为碘离子或溴离子。
[0187] 在一些实施例中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。
[0188] 在一些实施例中，所述抗体来源选自兔源、鼠源、山羊源、绵羊源、鸡源和/或人源。
[0189] 在一些实施例中，所述抗体为单克隆抗体。
[0190] 在一些实施例中，所述抗体包含抗CD9单克隆抗体、抗CD63单克隆抗体和/或抗CD81单克隆抗体。
[0191] 在一些实施例中，所述抗体还包含疾病的治疗性抗体。
[0192] 在一些实施例中，所述疾病包含心肌梗死、自身免疫、病毒传播或肿瘤转移。
[0193] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0194] 在一些实施例中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0195] 在一些实施例中，所述心肌缺血梗死的治疗性抗体为抗MLC单克隆抗体。
[0196] 在一些实施例中，所述抗体的质量总和与磁性纳米颗粒的质量比为0.1-61%。
[0197] 在一些实施例中，所述抗CD9单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0198] 在一些实施例中，所述抗CD63单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0199] 在一些实施例中，所述抗CD81单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0200] 在一些实施例中，所述抗MLC单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为40%。
[0201] 在一些实施例中，构成所述核的材料包含金属氧化物。
[0202] 在一些实施例中，所述金属氧化物为氧化铁。
[0203] 在一些实施例中，所述氧化铁为四氧化三铁。
[0204] 在一些实施例中，构成所述壳的材料包含二氧化硅或二氧化钛。
[0205] 在一些实施例中，所述二氧化硅为无定形二氧化硅，所述二氧化钛为无定形二氧化钛。
[0206] 在一些实施例中，其中，所述二氧化硅为结晶形二氧化硅，所述二氧化钛为结晶形二氧化钛。
[0207] 在一些实施例中，所述晕包含腙键、聚乙二醇及醛基。
[0208] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为100 nm-2 μm。
[0209] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为600-800 nm。
[0210] 本实施例组合物能够使得内源性外泌体富集迁移并作用于目标细胞，能够精确操纵内源性外泌体的生物学分布，提高了外泌体的生物利用率，为心肌梗死等与外泌体生物学分布相关疾病的治疗提供了新的治疗方式。
[0211] 实施例4本实施例提供一种组合物，所述组合物包含可转移外泌体的磁性纳米颗粒。
[0212] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的核为四氧化三铁，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的壳为二氧化硅，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的晕为腙键-聚乙二醇-醛基，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的抗体通过醛基连接于所述晕。
[0213] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的抗体包含抗CD63单克隆抗体和抗MLC单克隆抗体。
[0214] 本实施例组合物的pH响应性磁性纳米颗粒表面修饰的聚乙二醇具有良好的生物相容性，对外泌体的捕获量具有抗体浓度依赖性，通过功能性抗体的设计、修饰可捕获细胞外囊泡并靶向到不同病灶释放，具有显著的心脏保护作用，并且心肌梗死区域聚集了大量的外泌体具有促进新生血管生成的作用。
[0215] 实施例5本实施例提供一种试剂盒，所述试剂盒包含磁性纳米颗粒。
[0216] 在一些实施例中，所述磁纳米颗粒包含核、壳和晕，所述壳覆盖所述核，所述晕覆盖所述壳。
[0217] 在一些实施例中，所述晕还包含蛋白质、多肽、多糖、适体或离子。
[0218] 在一些实施例中，所述晕还包含pH响应性基团。
[0219] 在一些实施例中，所述pH响应性基团在中性或酸性条件下响应。
[0220] 在一些实施例中，所述pH响应性基团包含包含腙键、酯键和醛基。
[0221] 在一些实施例中，所述蛋白质选自跨膜四分子蛋白。
[0222] 在一些实施例中，所述跨膜四分子蛋白选自CD9、CD63和CD81中的一种或几种。
[0223] 在一些实施例中，所述多肽选自CP05。
[0224] 在一些实施例中，所述蛋白质通过所述pH响应性基团连接于晕。
[0225] 在一些实施例中，所述蛋白质为抗体。
[0226] 在一些实施例中，所述多糖选自壳多糖、琼脂、菊糖和淀粉中的一种或几种。
[0227] 在一些实施例中，所述适体选自RNA、单链DNA和双链DNA中的一种或几种。
[0228] 在一些实施例中，所述离子选自气体元素离子、酸根、金属离子和非金属离子中的一种或几种。
[0229] 在具体的实施例中，所述气体元素离子为氧原子。
[0230] 在具体的实施例中，所述酸根为硫酸根离子。
[0231] 在具体的实施例中，所述金属离子为铁离子或亚铁离子。
[0232] 在具体的实施例中，所述非金属离子为碘离子或溴离子。
[0233] 在一些实施例中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。
[0234] 在一些实施例中，所述抗体来源选自兔源、鼠源、山羊源、绵羊源、鸡源和/或人源。
[0235] 在一些实施例中，所述抗体为单克隆抗体。
[0236] 在一些实施例中，所述抗体包含抗CD9单克隆抗体、抗CD63单克隆抗体和/或抗CD81单克隆抗体。
[0237] 在一些实施例中，所述抗体还包含疾病的治疗性抗体。
[0238] 在一些实施例中，所述疾病包含心肌梗死、自身免疫、病毒传播或肿瘤转移。
[0239] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0240] 在一些实施例中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0241] 在一些实施例中，所述心肌缺血梗死的治疗性抗体为抗MLC单克隆抗体。
[0242] 在一些实施例中，所述抗体的质量总和与磁性纳米颗粒的质量比为0.1-61%。
[0243] 在一些实施例中，所述抗CD9单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0244] 在一些实施例中，所述抗CD63单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0245] 在一些实施例中，所述抗CD81单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0246] 在一些实施例中，所述抗MLC单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为40%。
[0247] 在一些实施例中，构成所述核的材料包含金属氧化物。
[0248] 在一些实施例中，所述金属氧化物为氧化铁。
[0249] 在一些实施例中，所述氧化铁为四氧化三铁。
[0250] 在一些实施例中，构成所述壳的材料包含二氧化硅或二氧化钛。
[0251] 在一些实施例中，所述二氧化硅为无定形二氧化硅，所述二氧化钛为无定形二氧化钛。
[0252] 在一些实施例中，其中，所述二氧化硅为结晶形二氧化硅，所述二氧化钛为结晶形二氧化钛。
[0253] 在一些实施例中，所述晕包含腙键、聚乙二醇及醛基。
[0254] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为100 nm-2 μm。
[0255] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为600-800 nm。
[0256] 实施例6本实施例提供一种试剂盒，所述试剂盒的活性成分为实施例2中所述的可转移外泌体
的磁性纳米颗粒或实施例4中所述的组合物。
[0257] 实施例7本实施例提供磁性纳米颗粒在制备用于治疗心肌梗死的药物中的用途。
[0258] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0259] 在具体的实施例中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0260] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0261] 在具体的实施例中，用于治疗的剂量为10 mg/kg。
[0262] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0263] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0264] 在具体的实施例中，所述剂量为静脉内剂量。
[0265] 在一些实施例中，所述磁纳米颗粒包含核、壳和晕，所述壳覆盖所述核，所述晕覆盖所述壳。
[0266] 在一些实施例中，所述晕还包含蛋白质、多肽、多糖、适体或离子。
[0267] 在一些实施例中，所述晕还包含pH响应性基团。
[0268] 在一些实施例中，所述pH响应性基团在中性或酸性条件下响应。
[0269] 在一些实施例中，所述pH响应性基团包含包含腙键、酯键和醛基。
[0270] 在一些实施例中，所述蛋白质选自跨膜四分子蛋白。
[0271] 在一些实施例中，所述跨膜四分子蛋白选自CD9、CD63和CD81中的一种或几种。
[0272] 在具体的实施例中，所述多肽选自CP05。
[0273] 在一些实施例中，所述蛋白质通过所述pH响应性基团连接于晕。
[0274] 在具体的实施例中，所述蛋白质为抗体。
[0275] 在一些实施例中，所述多糖选自壳多糖、琼脂、菊糖和淀粉中的一种或几种。
[0276] 在一些实施例中，所述适体选自RNA、单链DNA和双链DNA中的一种或几种。
[0277] 在一些实施例中，所述离子选自气体元素离子、酸根、金属离子和非金属离子中的一种或几种。
[0278] 在具体的实施例中，所述气体元素离子为氧原子。
[0279] 在具体的实施例中，所述酸根为硫酸根离子。
[0280] 在具体的实施例中，所述金属离子为铁离子或亚铁离子。
[0281] 在具体的实施例中，所述非金属离子为碘离子或溴离子。
[0282] 在一些实施例中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。
[0283] 在一些实施例中，所述抗体来源选自兔源、鼠源、山羊源、绵羊源、鸡源和/或人源。
[0284] 在一些实施例中，所述抗体为单克隆抗体。
[0285] 在一些实施例中，所述抗体包含抗CD9单克隆抗体、抗CD63单克隆抗体和/或抗CD81单克隆抗体。
[0286] 在一些实施例中，所述抗体还包含疾病的治疗性抗体。
[0287] 在一些实施例中，所述疾病包含心肌梗死、自身免疫、病毒传播或肿瘤转移。
[0288] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0289] 在一些实施例中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0290] 在一些实施例中，所述心肌缺血梗死的治疗性抗体为抗MLC单克隆抗体。
[0291] 在一些实施例中，所述抗体的质量总和与磁性纳米颗粒的质量比为0.1-61%。
[0292] 在一些实施例中，所述抗CD9单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0293] 在一些实施例中，所述抗CD63单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0294] 在一些实施例中，所述抗CD81单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0295] 在一些实施例中，所述抗MLC单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为40%。
[0296] 在一些实施例中，构成所述核的材料包含金属氧化物。
[0297] 在一些实施例中，所述金属氧化物为氧化铁。
[0298] 在一些实施例中，所述氧化铁为四氧化三铁。
[0299] 在一些实施例中，构成所述壳的材料包含二氧化硅或二氧化钛。
[0300] 在一些实施例中，所述二氧化硅为无定形二氧化硅，所述二氧化钛为无定形二氧化钛。
[0301] 在一些实施例中，其中，所述二氧化硅为结晶形二氧化硅，所述二氧化钛为结晶形二氧化钛。
[0302] 在一些实施例中，所述晕包含腙键、聚乙二醇及醛基。
[0303] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为100 nm-2 μm。
[0304] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为600-800 nm。
[0305] 实施例8本实施例提供实施例1中所述的磁性纳米颗粒在制备用于治疗自身免疫的药物中的用
途。
[0306] 在一些实施例中，所述自身免疫包含多发性硬化症、克罗恩氏病和自身免疫性葡萄膜炎。
[0307] 在具体的实施例中，所述自身免疫为多发性硬化症。
[0308] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0309] 在具体的实施例中，用于治疗的剂量为10 mg/kg。
[0310] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0311] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0312] 在具体的实施例中，所述剂量为静脉内剂量。
[0313] 实施例9本实施例提供实施例1中所述的磁性纳米颗粒在制备用于治疗病毒传播的药物中的用
途。
[0314] 在一些实施例中，所述病毒传播包含病毒性肝炎、手足口病、水痘、风疹和结核病。
[0315] 在具体的实施例中，所述病毒传播为病毒性肝炎。
[0316] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0317] 在具体的实施例中，用于治疗的剂量为10 mg/kg。
[0318] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0319] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0320] 在具体的实施例中，所述剂量为静脉内剂量。
[0321] 实施例10本实施例提供实施例1中所述的磁性纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤转移的药物中的用
途。
[0322] 在一些实施例中，所述肿瘤转移包含黑色素瘤、脑部原发性肿瘤和泌尿系统恶性肿瘤。
[0323] 在具体的实施例中，所述肿瘤转移为黑色素瘤。
[0324] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0325] 在具体的实施例中，用于治疗的剂量为10 mg/kg。
[0326] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0327] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0328] 在具体的实施例中，所述剂量为静脉内剂量。
[0329] 实施例11本实施例提供可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于治疗心肌梗死的药物中的用
途。
[0330] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0331] 在具体的实施例中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0332] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0333] 在具体的实施例中，用于所述治疗的剂量为10 mg/kg。
[0334] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0335] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0336] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的核为四氧化三铁，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的壳为二氧化硅，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的晕为腙键-聚乙二醇-醛基，
所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的抗体通过醛基连接于所述晕。
[0337] 在具体的实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的抗体包含抗CD63单克隆抗体和抗MLC单克隆抗体。
[0338] 实施例12本实施例提供实施例2中所述的可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于治疗自身免
疫的药物中的用途。
[0339] 在一些实施例中，所述自身免疫包含多发性硬化症、克罗恩氏病和自身免疫性葡萄膜炎。
[0340] 在具体的实施例中，所述自身免疫为多发性硬化症。
[0341] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0342] 在具体的实施例中，用于治疗的剂量为10 mg/kg。
[0343] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0344] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0345] 在具体的实施例中，所述剂量为静脉内剂量。
[0346] 实施例13本实施例提供实施例2中所述的可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于治疗病毒传
播的药物中的用途。
[0347] 在一些实施例中，所述病毒传播包含病毒性肝炎、手足口病、水痘、风疹和结核病。
[0348] 在具体的实施例中，所述病毒传播为病毒性肝炎。
[0349] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0350] 在具体的实施例中，用于治疗的剂量为10 mg/kg。
[0351] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0352] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0353] 在具体的实施例中，所述剂量为静脉内剂量。
[0354] 实施例14本实施例提供实施例2中所述的可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于治疗肿瘤转
移的药物中的用途。
[0355] 在一些实施例中，所述肿瘤转移包含黑色素瘤、脑部原发性肿瘤和泌尿系统恶性肿瘤。
[0356] 在具体的实施例中，所述肿瘤转移为黑色素瘤。
[0357] 在一些实施例中，用于所述治疗的剂量为5-20 mg/kg。
[0358] 在具体的实施例中，用于治疗的剂量为10 mg/kg。
[0359] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0360] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0361] 在具体的实施例中，所述剂量为静脉内剂量。
[0362] 实施例15本实施例提供实施例2中所述的可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于增加血管形
成的心肌梗死药物中的用途。
[0363] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为5-20 mg/kg。
[0364] 在具体的实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为10 mg/kg。
[0365] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0366] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0367] 实施例16本实施例提供实施例2中所述的可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于提高射血分
数形成的心肌梗死药物中的用途。
[0368] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为5-20 mg/kg。
[0369] 在具体的实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为10 mg/kg。
[0370] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0371] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0372] 实施例17本实施例提供实施例2中所述的可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于减少梗死区
面积形成的心肌梗死药物中的用途。
[0373] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为5-20 mg/kg。
[0374] 在具体的实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为10 mg/kg。
[0375] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0376] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0377] 实施例18本实施例提供实施例2中所述的可转移外泌体的磁性纳米颗粒在制备用于提高心脏收
缩功能形成的心肌梗死药物中的用途。
[0378] 在一些实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为5-20 mg/kg。
[0379] 在具体的实施例中，所述可转移外泌体的磁性纳米颗粒的剂量为10 mg/kg。
[0380] 在一些实施例中，所述的剂量间隔为每隔48小时至每隔96小时一次。
[0381] 在具体的实施例中，所述的剂量间隔为每隔72小时一次。
[0382] 实施例19本实施例提供本发明所述的磁性纳米颗粒在转移外泌体中的用途。
[0383] 在一些实施例中，所述磁纳米颗粒包含核、壳和晕，所述壳覆盖所述核，所述晕覆盖所述壳。
[0384] 在一些实施例中，所述晕还包含蛋白质、多肽、多糖、适体或离子。
[0385] 在一些实施例中，所述晕还包含pH响应性基团。
[0386] 在一些实施例中，所述pH响应性基团在中性或酸性条件下响应。
[0387] 在一些实施例中，所述pH响应性基团包含包含腙键、酯键和醛基。
[0388] 在一些实施例中，所述蛋白质选自跨膜四分子蛋白。
[0389] 在一些实施例中，所述跨膜四分子蛋白选自CD9、CD63和CD81中的一种或几种。
[0390] 在一些实施例中，所述多肽选自CP05。
[0391] 在一些实施例中，所述蛋白质通过所述pH响应性基团连接于晕。
[0392] 在一些实施例中，所述蛋白质为抗体。
[0393] 在一些实施例中，所述多糖选自壳多糖、琼脂、菊糖和淀粉中的一种或几种。
[0394] 在一些实施例中，所述适体选自RNA、单链DNA和双链DNA中的一种或几种。
[0395] 在一些实施例中，所述离子选自气体元素离子、酸根、金属离子和非金属离子中的一种或几种。
[0396] 在具体的实施例中，所述气体元素离子为氧原子。
[0397] 在具体的实施例中，所述酸根为硫酸根离子。
[0398] 在具体的实施例中，所述金属离子为铁离子或亚铁离子。
[0399] 在具体的实施例中，所述非金属离子为碘离子或溴离子。
[0400] 在一些实施例中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。
[0401] 在一些实施例中，所述抗体来源选自兔源、鼠源、山羊源、绵羊源、鸡源和/或人源。
[0402] 在一些实施例中，所述抗体为单克隆抗体。
[0403] 在一些实施例中，所述抗体包含抗CD9单克隆抗体、抗CD63单克隆抗体和/或抗CD81单克隆抗体。
[0404] 在一些实施例中，所述抗体还包含疾病的治疗性抗体。
[0405] 在一些实施例中，所述疾病包含心肌梗死、自身免疫、病毒传播或肿瘤转移。
[0406] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0407] 在一些实施例中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0408] 在一些实施例中，所述心肌缺血梗死的治疗性抗体为抗MLC单克隆抗体。
[0409] 在一些实施例中，所述抗体的质量总和与磁性纳米颗粒的质量比为0.1-61%。
[0410] 在一些实施例中，所述抗CD9单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0411] 在一些实施例中，所述抗CD63单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0412] 在一些实施例中，所述抗CD81单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为20%。
[0413] 在一些实施例中，所述抗MLC单克隆抗体的质量与磁性纳米颗粒的质量比为40%。
[0414] 在一些实施例中，构成所述核的材料包含金属氧化物。
[0415] 在一些实施例中，所述金属氧化物为氧化铁。
[0416] 在一些实施例中，所述氧化铁为四氧化三铁。
[0417] 在一些实施例中，构成所述壳的材料包含二氧化硅或二氧化钛。
[0418] 在一些实施例中，所述二氧化硅为无定形二氧化硅，所述二氧化钛为无定形二氧化钛。
[0419] 在一些实施例中，其中，所述二氧化硅为结晶形二氧化硅，所述二氧化钛为结晶形二氧化钛。
[0420] 在一些实施例中，所述晕包含腙键、聚乙二醇及醛基。
[0421] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为100 nm-2 μm。
[0422] 在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒的直径为600-800 nm。
[0423] 实施例20本实施例提供一种可转移外泌体的磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1.Fe3O4纳米颗粒制备；
S2.Fe3O4@SiO2-C=C纳米颗粒制备；
S3.Fe3O4@SiO2-NH-NH2纳米颗粒制备；
S4.双醛基聚乙二醇制备；
S5.Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒制备；
S6.结合功能性抗体的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒制备；
在一些实施例中，所述功能性抗体包含抗CD9单克隆抗体、抗CD63单克隆抗体和/或抗
CD81单克隆抗体。
[0424] 在一些实施例中，所述功能性抗体还包含疾病的治疗性抗体。
[0425] 在一些实施例中，所述疾病包含心肌梗死、自身免疫、病毒传播或肿瘤转移。
[0426] 在一些实施例中，所述心肌梗死包含急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死、心肌缺血梗死和心房心肌梗死。
[0427] 在具体的实施例中，其中，所述心肌梗死为心肌缺血梗死。
[0428] 在具体的实施例中，所述心肌缺血梗死的治疗性抗体为抗MLC单克隆抗体。
[0429] 步骤S1中所述的Fe3O4纳米颗粒制备具体为：取三氯化铁0.1 g，乙二醇40 mL，混合均匀后加入3 g尿素，50℃恒温搅拌30 min至全部溶解，随后将溶解液移入高压反应釜中，在200℃条件下反应12 h，磁分离后所得产物经乙醇、水各洗涤3次，在60℃真空烘箱中干燥12 h，将干燥后产物置于管式炉中，500℃下通氮气煅烧1 h，即得Fe3O4纳米颗粒。
[0430] 步骤S2中所述的Fe3O4@SiO2-C=C纳米颗粒制备具体为：取步骤S1制备得到的Fe3O4纳米颗粒0.1 g均匀分散于80 mL乙醇和20 mL水中，加入1
mL氨水，剧烈搅拌下加入50 μL TEOS，室温下反应8 h，磁分离后所得产物经乙醇、水各洗涤
3次，在60℃真空烘箱中干燥12 h，即得Fe3O4@SiO2纳米颗粒；
将上述Fe3O4@SiO2纳米颗粒均匀分散于100 mL乙醇中，加入1 mL氨水，剧烈搅拌下加入
1.25 mL KH570，室温下反应8 h，磁分离后所得产物经乙醇、水各洗涤3次，在60℃真空烘箱中干燥12 h，即得Fe3O4@SiO2-C=C纳米颗粒。
[0431] 步骤S3中所述的Fe3O4@SiO2-NH-NH2纳米颗粒制备具体为：取步骤S2制备得到的Fe3O4@SiO2-C=C纳米颗粒50 mg均匀分散于20 mL甲醇/四氢呋喃
混合溶剂中，磁力搅拌下加入1mL巯基丙酸和60mg安息香双甲醚，搅拌均匀后在365 nm紫外光照下反应1 h，磁分离后所得产物经乙醇、水各洗涤3次，在60℃真空烘箱中干燥12 h，即得Fe3O4@SiO2-COOH纳米颗粒；
取上述Fe3O4@SiO2-COOH纳米颗粒均匀分散于20 mL甲醇中，磁力搅拌下加入1 mL 80%
水合肼，80℃回流反应12 h，磁分离后所得产物经乙醇、水各洗涤3次，在60℃真空烘箱中干燥12 h，即得Fe3O4@SiO2-NH-NH2纳米颗粒。
[0432] 步骤S4中所述的双醛基聚乙二醇制备具体为：取10g PEG4000溶于50 mL DMSO中，升温至50℃使其全部溶解，随后在磁力搅拌下缓慢滴加9.5 mL 0.1 mol/L 醋酸酐，使醋酸酐与羟基的摩尔比为20:1，室温下反应8 h后，用水透析处理四天，冷冻干燥所得样品即为CHO-PEG4000-CHO。
[0433] 步骤S5中所述的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒制备具体为：取步骤S3制备得到的Fe3O4@SiO2-NH-NH2纳米颗粒50 mg均匀分散于20 mL甲醇中，磁力搅拌下加入过量的CHO-PEG4000-CHO与CHO-PEG4000，并滴加20 μL冰醋酸，室温反应12 h，磁分离后所得产物经乙醇、水各洗涤3次，在60℃真空烘箱中干燥12 h，即得含有pH响应性基团的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒，利用扫描电镜对最终产物进行分析。
[0434] 步骤S6中所述的结合功能性抗体的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒制备具体为：取步骤S5制备得到的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒均匀分散于5 mg/mL PBS中，向其中加入抗CD63单克隆抗体和抗MLC单克隆抗体，充分混匀，4℃于摇床上反应过夜，磁分离后PBS洗涤3次，重悬于PBS即得结合功能性抗体的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒。
[0435] 在一些实施例中，所述甲醇/四氢呋喃混合溶剂的体积比为1:1。
[0436] 在一些实施例中，所述CHO-PEG4000-CHO与CHO-PEG4000的摩尔比为1:3。
[0437] 在一些实施例中，所述抗CD63单克隆抗体和抗MLC单克隆抗体的质量总和与结合功能性抗体的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒的质量比为0.1-61%。
[0438] 在一些实施例中，所述抗CD63单克隆抗体占步骤S5制备得到的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒的质量比为10%、20%、40%或60%，所述抗MLC单克隆抗体与步骤S5制备得到的Fe3O4@SiO2-PEG-CHO纳米颗粒的质量比为50%、40%或20%。
[0439] 使用本发明可转移外泌体的磁性纳米颗粒的制备方法制备的可转移外泌体的磁性纳米颗粒，能够实现对内源性循环外泌体捕获、靶向运输及按需响应性释放的过程。该可转移外泌体的磁性纳米颗粒包含四氧化三铁核、二氧化硅壳和腙键-聚乙二醇-醛基晕，晕通过醛基连接抗CD63单克隆抗体和抗MLC单克隆抗体，所述抗CD63单克隆抗体能够捕获内源性外泌体并精确控制其生物学分布，使得体内的内源性外泌体富集于本发明的磁性纳米颗粒；所述抗MLC单克隆抗体能够与心肌梗死靶蛋白MLC结合，在外加磁场作用下，磁性纳米颗粒趋向心肌梗死区域，从而提高了具有治疗作用的外泌体在心肌梗死区域的浓度并利用pH响应性释放大量的外泌体修复梗死心肌组织、提高心脏能力、促进血管形成，以实现自体治疗，从而取代传统的药物治疗，同时避免了体内的免疫反应。
[0440] 而且，该制备方法操作简单，易于工业化生产，节约成本，具有良好的应用价值。
[0441] 实施例21本实施例提供一种磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒包含核、壳和晕，其中，所述壳覆盖所述核，所述晕覆盖所述壳。
[0442] 本发明的磁性纳米颗粒包含核、壳和晕，所述壳覆盖所述核，壳保护核，壳防止磁性材料从核泄漏；所述晕包含pH响应性基团，能够在中性或酸性条件下响应性释放；构成所述晕的材料包含聚乙二醇，能够保证纳米颗粒抗生物污染并在体内长时间循环；所述晕还提供用于结合靶分子的化学基团。
[0443] 效果验证：一、实施例2制备的可转移外泌体的磁性纳米颗粒的表面形貌结果分析
图2扫描电镜结果显示GMNP磁性纳米颗粒表面由于PEG-CHO有机层而
较光滑，GMNP的干态粒径为200 nm左右，表明本发明成功合成了粒径均一，有利于体内长循环的磁性纳米颗粒。
[0444] 二、实施例2制备的可转移外泌体的磁性纳米颗粒的磁分离性能结果分析GMNPEC是由anti-CD63和anti-MLC与醛基团功能化的磁性纳米颗粒（Fe3O4@SiO2-PEG-
CHO，简写为GMNP）偶联而成。简言之，GMNP溶液（浓度为1 mg/mL）经磁分离纯化，使用PBS重悬，加入anti-CD63和anti-MLC混合均匀，将混合物在4℃下搅拌得到GMNPEC。其中以罗丹明B标记的GMNP代替没有标记的GMNP制备荧光GMNPEC。结合anti-CD63和anti-MLC的GMNPEC用PBS洗三次，分散于PBS并置于带盖玻璃瓶中，可见GMNPEC分散液呈黑棕色。利用銣铁硼强磁铁对GMNPEC纳米颗粒的磁分离性能进行测定。
[0445] 磁分离测定结果显示：当銣铁硼强磁铁接近GMNPEC分散液时，黑棕色磁性纳米颗粒聚集展现了良好的磁分离性能，为纳米颗粒在体内心脏磁靶向提供了基础。
[0446] 其中，本发明中所用磁性纳米颗粒的缩写、结构及结合抗体情况如表1所示。
[0447] 表1 本发明中所用磁性纳米颗粒的缩写、结构及结合抗体情况缩写 结构 结合抗体
GMNP Fe3O4@SiO2-PEG-CHO -
GMNPEC MNP@PEG-CHO Anti-CD63；anti-MLC
GMNPN MNP@PEG-CHO IgG
GMNPEN MNP@PEG-CHO Anti-CD63；IgG
三、GMNPEC体外血清中捕获外泌体的结果分析
取100 μL血清，加入实施例2中制备的GMNPEC的分散液（含GMNPEC 100 μg)，37℃充分混匀2 h，磁分离后PBS洗涤3次，重悬于100 μL PBS中，即得GMNPEC-EXO，用荧光标记磁性纳米颗粒（红色）及外泌体（绿色）制备荧光标记GMNPEC-EXO，于共聚焦显微镜下拍照，并用蛋白免疫印迹法检测外泌体的特征蛋白CD63。简言之，用RIPA缓冲液裂解纯外泌体（阳性对照）、GMNPEC-EXO、GMNPN-EXO，裂解液经离心分离后，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，冲洗膜后用抗CD63单克隆抗体的一抗进行孵育（抗CD63单克隆抗体与PBS的体积稀释比为1:500），与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体的二抗（羊抗鼠IgG单克隆抗体与PBS的体积比为1:3000）室温孵育1 h；
PBST洗膜3次，每次5 min，加上ECL发光底物，化学发光凝胶成像系统下进行检测。
[0448] 实验结果如图3-4所示。
[0449] 图3为荧光共聚焦显微镜照片，利用罗丹明B标记GMNPEC，PKH67标记外泌体。共孵育后，外泌体（绿色）与GMNPEC（红色）共定位，直观地证实了GMNPEC捕获外泌体的能力。
[0450] 通过图4 进一步测定GMNPEC的特异性捕获外泌体能力，以GMNP（N 抗CD63单克隆抗体替换IgG同型对照抗体）为对照，与GMNPN相比，图4中western结果确认GMNPEC与血清共孵育的裂解产物表达外泌体特征蛋白CD63，而GMNPN因为不具有特异性捕获血清中外泌体的能力故而其蛋白裂解物几乎不表达CD63，再次证实GMNPEC可从血清中捕获外泌体。
[0451] 四、GMNPEC结合受损心肌细胞能力培养原代心肌细胞并制细胞爬片，4℃经通透固定液（BD）透化5 min，以模拟受损心肌细胞，PBS洗涤三次后分别与GMNPEN 、GMNPEC孵育1 h，PBS洗涤三次后复染细胞核，用共聚焦拍照。
[0452] 实验结果如图5所示，图5中RhB为罗丹明B标记的磁性纳米颗粒，Hoechst为细胞核染色剂。
[0453] 图5为GMNPEC、GMNPEN结合心肌细胞荧光图，从图5中蓝色细胞核与红色纳米颗粒的共定位现象，可以看出含有靶向受损心肌细胞抗体的GMNPEC与受损心肌细胞结合，表明结合抗MLC单克隆抗体有利于提高GMNPEC对受损心肌细胞的靶向性，进而提高GMNPEC在病灶部位靶向性。而GMNPEN组因微球几乎不与受损心肌细胞共定位，不具有靶向受损心肌细胞的能力。
[0454] 五、GMNPEC释放外泌体的能力取微球与外泌体复合物GMNPEC-EXO，置于pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液中4 h后，将溶液磁分离取清液即为GMNPEC所释放外泌体。用蛋白免疫印迹法检测外泌体的特征蛋白CD63与CD81。简言之，用RIPA缓冲液裂解纯外泌体（阳性对照）、释放外泌体。裂解液经离心分离后，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。冲洗膜后用抗CD63单克隆抗体（抗CD63单克隆抗体与PBS的体积稀释比为1:500）和抗CD81单克隆抗体（抗CD81单克隆抗体与PBS的体积稀释比为1:500）的一抗进行孵育，与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体的二抗（羊抗鼠IgG单克隆抗体与PBS的体积稀释比为1:3000）室温孵育1 h；PBST洗膜3次，每次5 min，加上ECL发光底物，化学发光凝胶成像系统下进行检测。
[0455] 实验结果如图6所示。
[0456] 图6为GMNPEC所释放外泌体的裂解物表达外泌体特征蛋白的结果图，western结果证实GMNPEC-EXO在酸性条件（pH=6.8）下可释放外泌体且所释放外泌体表达外泌体特征蛋白CD63及CD81，表明GMNPEC所释放外泌体表达其特征蛋白质组学，提示体内使用可转移磁性纳米颗粒转运并释放的外泌体仍具有调控功能。
[0457] 应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
[0458] 本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
