[0001] 本发明涉及增强装置附近的样本中的光学处理的电场增强装置。具体而言，本发明涉及例如在物理、化学、生物学、生物成像和医学诊断领域中用于线性和非线性显微镜和光谱学应用的场增强装置的设计和制造。

[0002] 如今，许多光学测量技术被用来对物理、化学和生物学中的材料、结构、细胞和组织进行成像或表征。在许多这些技术中，要研究的样本被放置在合适的基板材料的表面上。许多技术还使用具有已知属性的光，诸如具有预定波长的激光。为了在这些情况下提高技术水平，放置样本的基板可能包含一些功能以增强测量处理。

[0003] 这些测量所依赖的光学处理包括荧光、多光子荧光、全内反射、二次谐波生成(SHG)、和频生成(SFG)、两个光子激发荧光(TPEF)以及基于与分子振动相互作用的处理，如拉曼散射(RS)、线性和非线性表面增强拉曼散射(SERS)、相干抗斯托克斯拉曼散射(CARS)和表面增强相干抗斯托克斯拉曼散射(SECARS)、尖端增强拉曼散射(TERS)、受激拉曼散射(SRS)。

[0004] 诸如CARS显微镜技术的非线性成像技术已开发用于无标记脂质成像。CARS基于集中激发脂质中高度丰富的C-H键的振动频率。目前，CARS显微镜只能观察细胞中大量脂质的沉积。然而，由于缺乏敏感性，无法解决生物学上通常更有趣、更小且动态的沉积物(例如那些在形成或倒退的脂质小滴或内体细胞器中的沉积物)。因此，提高脂质成像的敏感性对于例如了解疾病的进展非常重要。

[0005] 荧光显微镜凭借其分子和化学特异性，是生物学中使用最广泛的成像方法之一。荧光显微镜基于以下现象：某些材料，例如荧光团或染料，在特定波长处具有较大的吸收截面，并且在被特定波长的光照射时会发出较长波长的光。基本原理是用所需的波长照射样本，然后从激发光中分离出弱得多的发射(荧光)光。荧光物种标记的分子非常明亮，在荧光显微镜成像中可区分。在许多应用中需要始终提高荧光灵敏度以达到单分子检测的极限，这仍然是一个巨大的挑战。

[0006] 但是，光显微镜的空间分辨率受到光衍射到几百纳米的限制。这是至关重要的，因为在细胞内，生物分子的生命单位是纳米级的。另外，在细胞中，生物分子通常以低浓度即纳摩尔浓度存在，需要高的检测灵敏度。为了克服该限制，通过在纳米级操纵光来开发超分辨荧光显微镜。

[0007] 在现有技术的方法中，即使在超分辨荧光显微镜中，高强度的光也被引导到放置在盖玻片玻璃上的样本上。用于光学生物成像的本方法的缺点是缺乏查看细胞细节的敏感性。目前，共聚焦显微镜分别提供220nm和520nm的横向和深度分辨率。但是，放大到基本上所有分子和大部分亚细胞细胞器都小于该横向分辨率和深度分辨率的细胞或组织时，它成为详细可视化这些结构的障碍。

[0062] 接下来参考图1至图6描述根据本发明的场增强装置的不同实施方式。

[0063] 根据本发明的实施方式，场增强装置(100)可以以几种方式构造，但是它总是包含至少一个金属层(005)或由金属或介电条构成的金属或介电光栅(006，007)。通常，该装置构造在一些异质基板上(001)。当下一层是金属的时，粘合层(002)是有利的，但对于介电层，可能不需要粘合层。接下来要构造的层形成镜面结构，其对于简单的装置构造也可省略。镜面结构可以是金属镜面结构(003)或分布式布拉格反射器结构(DBR)(004)。下一层是薄金属层(005)，其也可省略。该层可被由金属条组成的一维金属光栅(006)或具有相似几何形状的介电光栅(007)覆盖。最后，可在结构的顶部上添加保护层(008)。

[0064] 本发明的目的是一种增强装置的表面和附近的电场的装置。这种增强在利用激光激发位于装置表面上的样本中的光学处理的某些显微和光谱测量中是有利的。

[0065] 该装置的功能基于金属和电介质界面处的表面等离子体激元(surface Plasmon polariton，SPP)或Tamm等离子体(Tamm plasmons，TP)的激发。当在表面上使用介电光栅时，衍射光栅效应也可增强场。与光仅聚焦在例如玻璃表面上的情况相比，当光聚焦在装置上时，这些激发在装置表面上提供了大大增强的电场。有利地将装置设计成使得入射光和装置的尺寸谐振。

[0066] 图1示出了装置的组成部分；如本文中其他地方所述，其中一些是可选的，并且在某些实施方式中可省略。利用这些部件，可设计几种不同的配置，从而导致提供有利地增强电场的多种装置构造。

[0067] 图3显示了可构造的装置的三个不同实例。

[0068] 场增强装置(100)包括：在其上制造装置的基板(001)；可选的粘合层(002)；可选的镜面结构(003，004)，该镜面结构可以是金属镜面结构(003)或分布式布拉格反射器(DBR)镜面结构(004)；等离子体光学结构(005，006)，包括全金属层(005)或金属光栅(006)或两者，按图1的顺序排列；可选的介电光栅(007)和最后可选的保护层(008)。

[0069] 基板可以是任何材料，最典型的是盖玻片玻璃或普通玻璃。可选的粘合层(002)特别在下一层是金属的时是有利的。这样可确保金属层不会从基板滚离，并提高了金属的导热性。粘合层顶部的金属可以是镜面结构(003)中的金属层(0031)或等离子体光学金属层(005)。粘合层可以是金属或电介质，最常见的是Ti。

[0070] 当装置(100)利用Tamm等离子体时，在构建顺序中接下来是镜面结构。有两个选项，金属镜面结构(003)或DBR结构(004)。金属镜面结构(003)由在底部的金属层(0031)和在其顶部的介电层(0032)组成。选择介电层的厚度，以便实现与入射光的谐振。DBR结构由具有不同折射率的不同材料的交替介电层(0041)和(0042)组成。层数可以是大于等于2的任何整数。用于装置(100)中的介电层的最常见的介电材料是Al2O3、TiO2和SiO2，但是可使用任何电介质。

[0071] 当使用TP时，在镜面结构(003/004)的顶部上制造薄的全金属层(005)。这种金属和相邻的电介质形成TP集中的界面。表面上增强的电场也可通过在结构的顶部上形成介电光栅(007)来实现。光栅由细长的介电条(0071)和条之间的空的间隔(0072)组成。介电条(0071)和它们之间的空的间隙(0072)的宽度被设计成使得电场分布尽可能均匀，以在表面上尽可能均匀地提供有利的增强。对于某些金属，必须保护金属层(005)例如免于氧化，然后在整个结构的顶部上形成保护介电层(008)，或者在形成介电光栅(007)之前涂覆保护介电层。

[0072] 当装置(100)利用SPP时，装置通常不需要在金属层(005)下方的镜面结构，但是可在基板(001)的顶部上使用粘合层(002)。全金属层与粘合层一起提供更好的热传导，以保持其顶部的金属光栅(006)的完整性。可选的金属光栅(006)包括细长的金属条和条之间的空的间隔。图2(顶部)从侧面显示了光栅的几何形状。选择金属条(0061)和它们之间的空的间隔(0062)的宽度以及周期(0063)，以使SPP和入射光谐振。同样，对于某些金属，保护层(008)可用作最顶层。装置(100)中的金属材料可以是任何金属，最常见的是金、银和铝。图2(底部)显示了制造的一维金光栅的扫描电子显微镜图像。

[0073] 在图3中示出了本发明的三个示例性实施方式：具有金属光栅的SP版本(左上方，装置101)，具有DBR镜的TP版本(右上方，装置102)，以及具有金属镜面结构和介电光栅的TP版本(底部，装置103)。

[0074] 在本发明的另一个有利的实施方式中，该装置包括基板、粘合层、具有介电层的金属镜面结构和介电光栅。该装置然后还可包括保护层。该装置的该实施方式使用衍射光栅效应。在该结构中，金属镜也可用DBR镜代替。在这种情况下，还可在DBR镜和介电光栅之间添加附加的介电层。

[0075] 有利的是，此版本的装置可与TE和TM模式激光一起使用。

[0076] 该装置的各种实施方式非常适合并且稳定以与诸如水、磷酸盐缓冲溶液或细胞组织培养基之类的各种介质相邻。

[0077] 可组合装置的组件和版本以实现期望的效果，例如，以在一个波长处实现增加的谐振，或在数个不同波长处实现谐振。

[0078] 下面描述场增强装置(100)的最普通的制造方法，但是也可用不同的制造技术来构造该装置。粘合层(002)、镜(0031)中的金属、全金属(005)和用于金属光栅(006)的起始层通常通过金属蒸发器或溅射器沉积。通常通过等离子体增强化学气相沉积(PECVD)或通过原子层沉积(ALD)来沉积介电层(0032，0041，0042，008)和用于介电光栅(007)的起始层。对于光栅(006，007)的制造，典型地通过电子束光刻(EBL)或纳米压印光刻(NIL)来限定特征，之后，应用剥离工艺或干法和湿法蚀刻工艺。

[0079] 图4示出了在30×30μm2的面积上具有200nm的凹槽宽度和100nm的间距的SP纳米光栅结构的反射率测量结果。SP纳米光栅结构的光学反射属性以1(空气)、1.33(水)和1.49(PMMA)的不同折射率来表征。沿一维纳米光栅结构照射入射的TM偏振光，反射的光由光谱仪收集。测量光谱示出相对于预定的一维纳米光栅结构的表面等离子体谐振波长。谐振时反射率降低(即吸收增加)(基于光栅的尺寸和环境的折射率)表明了该结构的有效性。本发明涉及本文公开的纳米光栅结构在与激发的激光束和分子振动频率谐振以增强线性和非线性拉曼散射、TPEL、SHG、SFG和FWM信号强度中的用途。

[0080] 图5示出了示例性装置102的反射光谱。仅镜面结构004的反射光谱(曲线a)示出了从350nm至1000nm的高反射率。当测量整个装置102时(曲线b)，在设计波长处可清楚地看到与等离子体有关的特征反射最小值或吸收倾角。通过改变结构的尺寸，该波长可在很宽的范围内变化。

[0081] 图6示出了计算的装置100构造的横向磁(TM)和横向电(TE)反射光谱，该构造使用Tamm等离子体、表面等离子体和光栅衍射，它们被耦合以实现高信号放大。从图中可看出，该装置可在显微镜的TM和TE模式下使用。吸收倾角波长在450至500nm之间。

[0082] 通过使用根据本发明实施方式的SP纳米结构的纳米光栅凹槽，FWM、TPEL、SHG和SFG信号强度的非线性相干发射得到了显著增强。本发明可用于生物学、生物成像、医学诊断、病理学和化学应用中，其中，对检测和识别样本中的少量分子是有用的。

[0083] TAMM等离子体的谐振频率可通过装置的金属和介电层的厚度来调节。

[0084] 图7示出了根据本发明的实施方式的装置104的一个示例性结构，其中SEBI基板针对绿色荧光蛋白(GFP)进行了优化。所示的结构可用于固定的或活的细胞。

[0085] 周期0077定义了光栅结构的表面等离子体谐振波长。周期0077可在250到350nm之间变化，以与绿色荧光蛋白(GFP)激发波长(在488nm)谐振。在一个有利的实施方式中，周期0077为大约300nm。

[0086] 深度0707(基本上对应于光栅的深度)确定谐振波长的强度。深度0700的值可在20-60nm之间。在有利的实施方式中，深度0707为大约20nm。

[0087] 在图7的实施方式中，该装置包括基板001，在该特定示例性实施方式中，该基板可以是玻璃。对于玻璃基板，该装置可以在反射和透射模式两者下使用。

[0088] 粘合层(002)在图7中可包含TiO2，而介电光栅(007)也可包含TiO2。粘合层(002)的厚度可为20-150nm，有利地为69nm。装置的总厚度可为约89nm。该结构可被优化以在绿光区域中操作，因此对于GFP可以是有利的。

[0089] 可通过原子层沉积(ALD)方法来沉积TiO2的粘合层(002)。可通过电子束光刻或纳米压印光刻技术形成介电光栅。

[0090] 图8示出了可用根据图7的实施方式的装置获得的反射光谱。衍射峰可在484nm和540nm处(在水中测量，折射率1.33)被观察到。

[0091] 图9给出了根据本发明实施方式的装置(105)的另一示例性结构，其中，SEBI基板针对GFP进行了优化。光栅的周期(0079)可在250-350nm之间变化，以与绿色GFP激发波长谐振。在一个实施方式中，周期(0079)是300nm。图9的结构可与固定的或活的细胞一起使用，并且可在反射模式下使用。在此，可从相同方向收集激发和发射。

[0092] 光栅的深度(0709)可在20-60nm之间，并且有利地，可使用大约25nm的深度。

[0093] 基板001可以是玻璃或硅，有利地是硅，而粘合层(002)可以是Ti，其厚度为2-6nm，有利地为大约5nm。全金属层(005)可以是具有50-100nm，有利地约80nm的厚度的Ag。金属光栅(006)可以是厚度为25nm的Ag，以便有利地形成25nm的深度(0709)。保护层(008)可以是Al2O3，其厚度为2-10nm，有利地为约5nm。

[0094] 钛粘合层(002)和/或银金属可通过蒸发或溅射技术沉积。可通过原子层沉积来沉积保护层(008)。ALD可提供共聚焦生长的益处，这对于避免荧光成像中的漂白或猝灭作用可能是重要的。

[0095] 图10示出了根据本发明的实施方式的装置(106)的又一个示例性结构，其针对mCherry蛋白和/或与SECARS一起使用而被优化并且主要可用于红外区域。光栅的周期(0710)可在500-600nm之间变化，以与红色荧光蛋白激发波长(其可以是561nm)谐振。在一个实施方式中，周期(0710)为大约580nm。图10的结构可用于固定的或活的细胞，并且可在反射模式下使用。同样在这里，可从相同方向收集激发和发射。

[0096] 基板(001)可以是玻璃或硅，有利地是硅。粘合层(002)可以是Ti，其厚度在2-6nm之间，有利地在5nm左右。全金属层(005)可以是Au，其厚度为50-100nm，有利地为约80nm。金属光栅(006)可以是具有25nm的厚度的Au，以便有利地形成25nm的深度(0710)。

[0097] 可通过蒸发或溅射技术来沉积粘合层(002)。金属层的光栅可通过电子束光刻或纳米压印光刻技术形成，而金金属可通过蒸发或溅射沉积。该表面层质量和粗糙度值对于生物医学成像应用可能很重要。可优化生长和/或沉积参数以获得高表面质量。

[0098] 图11示出了可用根据图9的实施方式的装置获得的反射光谱(在水中测量，折射率1.33)。该光谱示出了在494nm处的表面等离子体倾角。

[0099] 图12示出了可用根据图10的实施方式的装置获得的反射光谱(在空气中测量，折射率为1)。该光谱示出了在613nm处的表面等离子体激元倾角。

[0100] 上面已经参考前述实施方式说明了本发明，并且已经证明了本发明的几个优点。显然，本发明不仅限于这些实施方式，而且包括在发明思想和所附权利要求书的精神和范围内的所有可能的实施方式。

[0101] 除非另有明确说明，否则从属权利要求中记载的特征可相互自由组合。