技术领域
[0001] 本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程半月板支架及其制备方法。
相关背景技术
[0002] 由于创伤、退变等因素导致的例如半月板等软骨组织的损伤十分常见。在解剖学结构中，例如内侧1/3半月板等无血供区软骨组织进行再生和自我修复能力有限，且软骨组织的损伤形态多样，其损伤形态也对其再生及自我修复有着重要影响。因此，这些软骨组织一旦损伤，随着病情的继续发展，必然导致退行性关节变化，甚至出现骨性关节炎等并发症。
[0003] 组织工程技术为如半月板等软骨组织损伤的再生修复提供了希望。其中，组织工程支架作为种子细胞和生物信号分子的载体，对再生修复具有非常重要的作用。因此，需要提供一种优质的组织工程半月板支架。
具体实施方式
[0061] 为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。
[0062] 为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
[0063] 在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两个以上。
[0064] 本申请的上述发明内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。
[0065] 组织工程学是综合应用工程学和生命科学的原理与技术，在根据组织工程学修复半月板损伤的技术中，可以在体外预先构建一个有生物活性的半月板种植体(即组织工程半月板支架)，然后植入体内，达到修复半月板组织缺损和重建组织功能的目的。为了推动将组织工程支架应用于临床半月板损伤的治疗，本发明人进行了大量的研究，提供一种高度仿生的组织工程半月板支架及其制备方法。
[0066] 首先，本发明第一方面的实施例提供一种组织工程半月板支架的制备方法，该方法包括建模步骤S100、提供生物墨水的步骤S200、提供可降解高分子材料的步骤S300和生物3D打印步骤S400。
[0067] 建模步骤S100包括：构建待修复半月板初始形状的三维数据模型。
[0068] 在步骤S100，可以采集与待修复半月板相对应的完好半月板的医学影像数据，来构建待修复半月板初始形状的三维数据模型。在一些实施例中，步骤S100可包括：
[0069] S110，对与待修复半月板相对应的完好半月板进行微计算机断层扫描 (micro computed tomography，Micro-CT)，获取Micro-CT医学数据。
[0070] S120，采用三维重建软件对医学数据进行图像分割和编辑处理，重建完好半月板的三维数据模型；通过对完好半月板的三维数据模型进行镜像处理，得到待修复半月板初始形状的三维数据模型。
[0071] 在步骤S120，可以将Micro-CT扫描得到的dcm文件导入三维重建软件mimics(如mimics21.0)，进行建模。
[0072] S130，保存待修复半月板初始形状的三维数据模型。保存格式例如为 stl格式。
[0073] 在一些实施例中，在步骤130之前，还可包括：对待修复半月板初始形状的三维数据模型进行局部修正和曲面形态优化处理。
[0074] 在一些实施例中，在步骤S100还可包括：S140，对待修复半月板初始形状的三维数据模型进行切片分层处理，并进行半月板支架打印路径规划。作为示例，在步骤S140，可将待修复半月板初始形状的三维数据模型的stl文件导入biomaker生物打印机配套的分层与控制软件biomaker；由 biomaker对三维数据模型进行切片分层处理，并进行半月板支架打印路径规划。
[0075] 将建模步骤S100构建的待修复半月板初始形状的三维数据模型用于 3D打印半月板支架，能实现对个体半月板形态学的高度仿生。
[0076] 另外，通过对三维数据模型进行处理，获得多层切片的二维数据模型，并合理规划打印路径，由此可模拟正常半月板内的胶原纤维排列结构特点，使半月板支架具有高度仿生的生物力学特性，同时为组织再生提供了充分的孔隙结构，适于细胞黏附和迁移。
[0077] 提供生物墨水的步骤S200包括：提供生物墨水，其包含水凝胶材料、基质材料、固化剂和种子细胞。
[0078] 在步骤S200中，水凝胶材料可包括甲基丙烯酰胺基明胶(GelMA)、透明质酸(HA)和藻酸盐(Alginate)中的一种或多种，优选包括 GelMA。可选地，GelMA的甲基丙烯酰化程度(MA化程度)可以为50％～70％，优选为55％～65％，更优选为60％。
[0079] 基质材料可包括脱细胞半月板细胞外基质(dMECM)、脱细胞软骨细胞外基质、脱细胞脐带华通胶细胞外基质、I型胶原、II型胶原、细菌纤维素、蚕丝蛋白和糖胺多糖中的一种或多种，优选包括dMECM。
[0080] 固化剂可以为本领域已知的用于使水凝胶材料发生交联固化的物质或混合物。作为示例，水凝胶材料包括GelMA和HA中的一种或几种，固化剂可包括光引发剂。进一步地，光引发剂可包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂盐(LAP)。该引发剂有利于获得较高的交联效率。尤其是，采用LAP能使水凝胶纤维的交联密度适当，从而有利于使支架获得良好的力学性能和孔隙结构。
[0081] 作为示例，种子细胞可包括纤维软骨细胞、透明软骨细胞、弹性软骨细胞和间充质干细胞中的一种或多种。其中间充质干细胞可包括半月板来源的间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎间充质干细胞、脐带间充质干细胞、滑膜间充质干细胞等中的一种或多种。种子细胞可来源于人体或其它动物，如猪、兔、羊、牛等。在一些实施例中，种子细胞包括半月板纤维软骨细胞(MFCs)。
[0082] 生物墨水包含上述水凝胶材料/基质材料的复合水凝胶，其用于打印半月板支架中的水凝胶纤维，能高度仿生半月板内细胞生长的天然微环境，使支架具有较高的生物相容性。水凝胶材料/基质材料的复合水凝胶还能提高生物墨水的打印精度，由此能使支架具有更加精细的微结构。另外，在生物墨水中负载种子细胞，能实现细胞在支架中的均匀分布，这有利于提高半月板再生修复的效果。进一步地，在生物墨水中负载种子细胞，实现活细胞打印支架，可以为进一步实现细胞的定点分配奠定研究基础，这对如半月板等组织的再生修复具有重大意义。
[0083] 在一些实施例中，基质材料的颗粒粒径≤400μm，或≤300μm，或≤200μm。优选地，粒径在200μm以下范围内的颗粒占颗粒总量的90％以上，如95％～100％。基质材料的颗粒粒径在适当范围内，能提高生物墨水的可打印性，防止堵塞打印喷头而造成的无法打印或者打印过程中断、不流畅等问题。因此，打印所得支架的结构精细度得到明显提高。
[0084] 基质材料可按照本领域已知的方法制备得到或商购获得。在一些优选的实施例中，基质材料可由如下的制备方法制得：
[0085] S10，提供基质材料的来源组织碎块。
[0086] 在步骤S10，基质材料的来源组织可以是半月板组织、软骨组织、脂肪组织等。基质材料的来源组织可来自于人、猪、牛、兔、羊等。
[0087] 在一些实施例中，组织碎块的体积≤1mm3。使组织碎块具有较小的体积，有利于后续步骤的处理，其中能简化后续步骤的操作，和/或提高后续步骤的效率。
[0088] 作为示例，基质材料为来源于半月板组织的dMECM。可以将新鲜的半月板(如猪半月板)剪去多余的滑膜组织，并将其剪成体积约为或小于 1mm×1mm×1mm的碎块。
[0089] S20，对组织碎块进行无菌处理。
[0090] 在步骤S20，可以采用任何不会明显损害细胞外基质成分的方法来对组织碎块进行无菌处理。在一些实施例中，步骤S20可采用过氧化氢溶液 (又称双氧水)对组织碎块进行灭菌，然后采用无菌的蒸馏水和/或PBS对组织碎块进行清洗。过氧化氢溶液清洗能对组织碎块起到很好的灭菌效果。蒸馏水和/或PBS清洗能除去过氧化氢残留，以使组织内的pH值保持在正常范围内，从而维持细胞外基质成分的稳定。
[0091] 在步骤S20，蒸馏水优选三蒸水。三蒸水是经过三次蒸馏收集的水。
[0092] 在本文中，可使用本领域公知的PBS。如购自美国Corning Cellgro公司的PBS。PBS的pH值可以为7.4(25℃)。
[0093] 在本文中，术语“无菌”指的是达到医学上的无菌要求。
[0094] 作为具体的示例，步骤S20可包括：
[0095] S21，使用过氧化氢溶液对组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min。例如，漂洗3次，每次5min。优选地，步骤S21使用的过氧化氢溶液为医用级。可选地，过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为2％～4％，如3％。
[0096] S22，使用无菌的蒸馏水和/或PBS对经步骤S210漂洗后的组织碎块漂洗3～4次，每次5min～8min。例如，漂洗3次，每次5min。
[0097] 在一些实施例中，在步骤S22可使用蒸馏水(如三蒸水)对经步骤 S21漂洗后的组织碎块漂洗。
[0098] 步骤S20优选在无菌的容器中进行。
[0099] 经步骤S20处理后得到无菌的组织碎块。例如，可取组织碎块样品送细菌培养，经证实无菌后再进行后续步骤。
[0100] S30，将无菌的组织碎块经湿法粉碎制成悬浮浆料。
[0101] 在步骤S30，湿法粉碎是以水为介质，机械粉碎组织碎块。水例如是蒸馏水，优选三蒸水。采用湿法粉碎能避免或大幅减少机械粉碎过程产生的热量，从而保护细胞外基质成分。
[0102] 步骤S30可以采用本领域已知的方法和装置进行。例如匀浆机。可将无菌的组织碎块加入蒸馏水中，用匀浆机破碎成悬浮浆料。
[0103] 在一些实施例中，在步骤S30，悬浮浆料的质量浓度可以为1g/100mL ～3g/100mL，如1g/100mL。
[0104] S40，将悬浮浆料进行差速离心处理，获得初始基质材料。
[0105] 在步骤S40，差速离心是对悬浮浆料中的颗粒进行多级离心分离处理，且后一级离心分离处理的离心速度和时间均大于前一级离心分离处理的离心速度和时间。通过差速离心处理，能有效地去除例如半月板组织等组织中的细胞，同时较大限度地保留天然的外基质成分。
[0106] 优选地，离心速度小于5000rpm时，离心处理的温度可以为20℃～ 25℃；离心速度在5000rpm以上时，离心处理的温度可以为0℃～4℃。
[0107] 在一些优选的实施例中，步骤S40可包括：
[0108] S41，将悬浮浆料在20℃～25℃下以1200rpm～1500rpm离心3min ～5min，获得第一上清液。例如，在20℃以1500rpm离心5min。
[0109] S42，将第一上清液在20℃～25℃下以1800rpm～2000rpm离心10 min～15min，获得第二上清液。例如，在20℃以2000rpm下离心15 min。
[0110] S43，将第二上清液在0℃～4℃下以5000rpm～6000rpm离心15min ～20min，获得第三上清液。例如，在4℃以6000rpm离心20min。
[0111] S44，将第三上清液在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm离心25min ～30min，获得沉淀。例如，在4℃以10000rpm离心30min。
[0112] S45，将沉淀制成悬浮液，在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm对沉淀离心处理3～4次，每次离心处理的时间为25min～30min。例如，在 4℃以10000rpm对沉淀离心30min，重复3次。在步骤S45，可以将沉淀与蒸馏水或PBS混合，制成悬浮液。其中，蒸馏水优选三蒸水。
悬浮液的浓度可以为1g/100mL～3g/100mL，如1g/100mL。
[0113] rpm即r/min(转/分)。
[0114] 步骤S40可采用低温高速离心机进行，例如赛默飞，Sorvall RC6+型离心机。作为具体的示例，在低温高速离心机中，在20℃下以1500rpm对悬浮浆料离心5min，取上清液在20℃下以2000rpm离心15min，再次取上清液在4℃下以6000rpm离心20min，最后取上清液在
4℃下以10000rpm离心30min，收集沉淀。然后将沉淀与三蒸水混匀，继续在4℃下以
10000rpm离心30min，重复3次。
[0115] 通过采用适当的差速离心处理的温度、转速和时间，能极大地去除例如半月板组织等组织中的细胞，同时很好地保留天然的外基质成分，使所得例如dMECM等基质材料具有良好的生物相容性。
[0116] 之后可将步骤S40所得初始基质材料制成混悬液。可以是将初始基质材料分散于水中制成混悬液。水例如为蒸馏水，优选三蒸水。混悬液的浓度例如为3g/100mL～5g/100mL，如3g/100mL。可将混悬液保存备用，保存温度可以为4℃。
[0117] S50，将上述混悬液经无菌超声粉碎处理，获得具有目标颗粒粒径的基质材料。
[0118] 无菌超声粉碎处理步骤S50能进一步调整例如dMECM等基质材料的颗粒粒径。相较于使用胃蛋白酶消化来处理细胞外基质，超声方式处理简单便捷，且机械化操作过程的可控性较好，省时省力。尤其是，采用超声粉碎处理更容易调控基质材料的颗粒粒径。例如，可通过改变超声时间 (如数秒)即可制备不同粒径的基质材料。更尤其是，超声粉碎处理细胞外基质是一种物理方法，其对细胞外基质成分的损伤小，能更限度地保留细胞外基质成分。
[0119] 在一些优选的实施例中，在步骤S50，采用间歇脉冲模式对基质材料进行无菌超声粉碎处理，其中，处理温度为0℃～5℃，超声振幅为65％～ 75％，处理时间为80s～120s，间歇脉冲模式为：脉冲时间为3s～7s，间歇时间为3s～7s。进一步地，超声振幅为65％～70％，处理时间为90s～ 120s，间歇脉冲模式为：脉冲时间为3s～5s，间歇时间为3s～5s。
[0120] 通过使超声振幅、超声时间在适当范围内，能进一步减小超声粉碎处理过程对例如dMECM等基质材料的破坏。在超声过程中设置适当的脉冲时间和间歇时间，能大幅度减小超声过程的热效应，从而大大降低细胞外基质成分发生变性的概率。因此，这样能进一步提高细胞外基质的成分的完整性。
[0121] 处理温度为0℃～5℃是无菌超声粉碎处理在周围温度为0℃～5℃条件下进行。其中可将装有混悬液的容器(如试管)置于冷却介质中，以在周围温度为0℃～5℃条件下进行超声粉碎处理。在低温环境下进行超声处理，能提高散热速率，进一步减小超声过程对基质材料的破坏。优选地，将装有混悬液的容器(如试管)置于冰槽中进行超声粉碎处理。
[0122] 步骤S50可使用超声波破碎仪(如美国Qsonica，Q125)对基质材料进行超声粉碎处理。优选地，需要对超声粉碎仪进行无菌处理。
[0123] 作为具体的示例，首先将超声破碎仪放入生物安全柜进行紫外线消毒，并将超声探头进行高温高压消毒；然后将装有混悬液的试管放入冰槽，设置超声振幅为70％，采用间歇脉冲模式对基质材料进行无菌超声粉碎处理90s，其中，间歇脉冲模式为：脉冲时间5s，间歇时间5s。基质材料例如是dMECM。
[0124] 经步骤S50处理后的基质材料能获得适当的颗粒粒径，同时还保留了更加完整的细胞外基质成分，从而使其能更好地发挥作用。采用本文的制备方法获得的基质材料还具有较低的免疫原性，降低受体对植入半月板支架的免疫排斥作用。
[0125] 在本文中，采用基质材料的来源组织制备基质材料的过程和基质材料的超声粉碎处理过程，均优选地在无菌条件下进行。这样能得到无菌的基质材料，因此可以省去后续灭菌处理(主要包括滤膜过滤和Co60射线消毒)，能进一步减小对基质材料的破坏。
[0126] 在一些优选的实施例中，生物墨水中，水凝胶材料的浓度为 10g/100mL～12g/100mL，基质材料的浓度为0.5g/100mL～1g/100mL。生物墨水中水凝胶材料和基质材料的浓度在适当范围内，能进一步提高生物墨水的打印性能，使打印支架的结构更精细。更优选地，生物墨水中水凝胶材料和基质材料具有适当的浓度和配比还能提高生物墨水的细胞相容性，使活细胞打印支架获得较高的细胞存活率。优选地，水凝胶材料为 GelMA，基质材料为dMECM。
[0127] 进一步地，固化剂的浓度可以为0.2g/100mL～0.25g/100mL。固化剂的浓度在适当范围内，能使生物墨水经交联得到的水凝胶纤维具有适当的交联度，在提高支架的结构稳定性的同时，还能改善支架内部的微结构。优选地，固化剂为光引发剂LAP。
[0128] 在一些实施例中，生物墨水中种子细胞的浓度为0.75×106个/mL～ 1×106个/mL。采用本发明的生物墨水可实现活细胞打印，且细胞成活率高。可选地，种子细胞包括MFCs。
[0129] 种子细胞可采用本领域已知的方法获得。作为MFCs培养方法的一个示例，可将1月龄的新西兰白兔用耳缘静脉空气栓塞法处死，常规膝关节备皮，碘伏酒精消毒，铺单，膝关节内侧入路切开皮肤，并游离皮下组织，打开关节囊，将髌骨外翻，切取半月板并放入加有双抗(青霉素-链霉素)的PBS内。将装有新鲜半月板组织的培养皿置于超净台内，然后转移入青霉素小瓶，PBS反复清洗3次。用眼科剪将半月板尽量剪碎，最终剪成体积小于或等于1mm×1mm×1mm的组织碎块。加入10倍于半月板体积的0.2％Ⅱ型胶原酶。然后将混悬液置于37℃、5％CO2培养箱内，每隔3h 收集一次酶解的混悬液，再重新加入新的0.2％Ⅱ型胶原酶，重复4次；收集的混悬液用含20％FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DMEM/F12 培养液终止胶原酶消化。离心并以0.75×106个原代细胞的密度将其种植于 75cm2的培养瓶内，待细胞长至80％～90％融合，用0.25％的胰酶消化后传代培养。可取P2～P5代细胞用于配制生物墨水，如P3代细胞。
[0130] 可以理解的是，MFCs的原代细胞也可以取自其它生物体，如猪、牛、羊等。
[0131] 在一些可选的实施例中，水凝胶材料为GelMA，基质材料为 dMECM，固化剂为光引发剂LAP，种子细胞为MFCs，且在生物墨水中，GelMA的浓度为10g/100mL～12g/100mL；dMECM的浓度为0.5g/100mL～ 1g/100mL；LAP的浓度为0.2g/100mL～0.25g/100mL；MFCs的浓度为 0.75×106个/mL～1×106个/mL。进一步地，生物墨水中，GelMA的浓度为 10g/100mL；dMECM的浓度为0.5g/100mL；LAP的浓度为0.25g/100mL； MFCs的浓度为1×106个/mL。
[0132] 进一步地，在生物墨水中还加入适量含FBS的DMEM/F12培养液，以为细胞提供营养。
[0133] 在一些可选的实施例中，上述生物墨水的示例性制备方法可包括：
[0134] S1，将GelMA加入PBS中，获得浓度为20g/100mL的GelMA溶液。作为示例，可将GelMA干粉加入PBS中，60℃水浴溶解2h，之后在4℃静置5min，然后再次于60℃水浴溶解2h，保证GelMA完全溶解。
[0135] S2，将上述制备的3g/100mL的dMECM混悬液和20g/100mL的GelMA 溶液按比例混合，并加入2.5g/100mL的LAP溶液和含20％(重量/体积) FBS的DMEM/F12培养液，配制成含有10g/100mL的GelMA、0.5g/100mL 的dMECM和0.25g/100mL的LAP的复合凝胶溶液。LAP的溶剂为PBS。
[0136] S3，在复合凝胶溶液中加入MFCs，得到生物墨水。作为示例，可将传代培养得到的P3代MFCs用胰酶消化后计数，之后使用低温高速离心机以1200rpm离心5min，得到MFCs；然后用上述配制的复合预凝胶溶液对 MFCs进行重悬，得到生物墨水。其中MFCs的浓度为1×106个/mL。
[0137] 本文制备的生物墨水为无菌的生物墨水。这样可以无需后续灭菌处理(如滤膜过滤、Co60射线消毒)，防止生物墨水成分变性。
[0138] 提供可降解高分子材料的步骤S300中，可降解高分子材料可选自聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA)、聚乳酸-聚己内酯共聚物(PCLA)、聚氨基酸(PAA)及聚乙醇酸(PGA)中的一种或多种。进一步地，可降解高分子材料的数均分子量可以为1×104～100×104，如2×104～20×104。
[0139] 在上述的可降解高分子材料中，PCL因具有良好的力学性能和可生物降解性，因此优选。充分考虑支架的力学性能和可降解性能等因素，PCL 的数均分子量优选为2×104～54 4 5 4
×10，更优选为4×10～5×10，尤其优选为 4.5×10。
[0140] 生物3D打印步骤S400包括以生物墨水作为水凝胶纤维的原料、以可降解高分子材料作为可降解高分子材料纤维的原料，依据三维数据模型打印支架。经生物3D打印得到的支架呈C形、且与待修复半月板的初始形状一致，支架包括在自身高度方向依次层叠设置的多个支架层，每个支架层包括间隔设置的多根可降解高分子材料纤维和位于多根可降解高分子材料纤维之间的间隙中的水凝胶纤维，且相邻两个支架层的可降解高分子材料纤维之间相交。
[0141] 在支架中，可降解高分子材料纤维构成支架的主体框架，能使支架具有良好的力学性能，在半月板损伤修复过程中能起到长期可靠的支撑作用。位于主体框架内的水凝胶材料/基质材料的复合水凝胶纤维，能高度仿生半月板内细胞生长的天然微环境，使支架具有较高的生物相容性。可降解高分子材料纤维和水凝胶纤维共同构成支架内的孔隙结构，有利于细胞的黏附和迁移。在水凝胶纤维的原料(即生物墨水)中还负载有活细胞，实现了活细胞3D打印，同时还能使细胞在支架中的均匀分布，有利于提高半月板再生修复的整体一致性。优选地，每相邻两根可降解高分子材料纤维之间均设有水凝胶纤维。
[0142] 在一些实施例中，上述多个支架层包括在支架高度方向交替设置的多个第一支架层和多个第二支架层，其中，第一支架层中的可降解高分子材料纤维基本沿支架的径向延伸，第二支架层中的可降解高分子材料纤维基本沿支架的环向延伸。这样高度仿生了正常半月板内的弧形胶原纤维和辐射状胶原纤维的交叉排列特性，仿生度更高。该半月板支架具有合适的压缩模量和拉伸模量，由此能满足半月板组织修复过程中力学支撑需求，同时并未对股骨踝造成明显的损伤。
[0143] 在一些实施例中，上述多个支架层包括在支架高度方向交替设置的多个第一支架层和多个第二支架层，其中，第一支架层中的可降解高分子材料纤维基本沿支架的径向延伸，第二支架层中的可降解高分子材料纤维与第一支架层中的可降解高分子材料纤维基本垂直(如图4所示)。这样高度仿生了正常半月板内胶原纤维的交叉排列结构，该半月板支架同样能具有合适的压缩模量和拉伸模量。该半月板支架也能满足半月板组织修复过程中力学支撑需求，同时并未对股骨踝造成明显损伤。此外，该支架的打印难度明显降低，可操作性更强。
[0144] 本发明实施例提供的组织工程半月板支架能较好地仿生半月板的取向结构和成分分布，使支架具有较高的结构稳定性的同时，为细胞生长提供良好的天然微环境和微结构。本发明的半月板支架有利于细胞黏附，并促进细胞的生长、迁移、增殖及再分化，提高半月板损伤的再生修复效果。
[0145] 在一些实施例中，相邻两个可降解高分子材料纤维的中心线间距优选为1200μm～1500μm。该支架能高度仿生半月板组织中的大孔结构，以及在大孔结构内部的小孔结构，使得支架具有较高的力学性能及生物相容性的同时，还能够让细胞更易于迁移，并在迁移过程中完成增殖和分化，实现更好的再生修复效果。
[0146] 进一步地，各支架层的高度可以为500μm～700μm，如550μm～650 μm。
[0147] 进一步地，可降解高分子材料纤维的丝径可以为400μm～600μm，如 450μm～550μm。
[0148] 步骤S400可在具有至少两个打印喷头的3D生物打印机中进行，如上普博源(北京)生物科技有限公司的biomaker打印机。可以将生物墨水和可降解高分子材料分装于打印机的两个料筒中，该两个料筒各自与对应的打印喷头连接，控制打印喷头按照预设的打印路径进行打印，以得到组织工程半月板支架。
[0149] 进一步地，3D生物打印机可具有至少三重控温系统，以对装有生物墨水的料筒、装有可降解高分子材料的料筒和打印平台进行独立地温度控制。其中，可采用高温熔融方式打印可降解高分子材料。这样可以提高可降解高分子材料纤维的一致性。可采用低温控温方式打印生物墨水，例如在凝胶状态下挤出生物墨水。这样能提高水凝胶纤维的打印精度，同时确保细胞外基质成分的完整性和较高的细胞存活率。
[0150] 在一些实施例中，步骤S400包括：
[0151] S410，设置打印平台的温度为35℃～37℃。
[0152] S420，采用具有第一喷头和第二喷头的生物打印机在打印平台上逐层打印支架，包括：
[0153] S421，使第一喷头以3mm/s～5mm/s的速度沿根据三维数据模型规划的打印路径移动，同时在第一挤出温度下挤出可降解高分子材料，以打印可降解高分子材料纤维。其中可降解高分子材料在第一挤出温度下呈熔融状态。
[0154] 在步骤S421，可将可降解高分子材料加入生物打印机的与第一喷头相连的料筒中，设置保温温度为第一挤出温度。在一些实施例中，第一挤出温度可以为80℃～90℃，如80℃～85℃。作为具体的示例，可降解高分子材料可为数均分子量为4.5×104～5×104的聚己内酯，第一挤出温度可以为80℃～85℃。
[0155] 进一步地，第一喷头的内径可以为400μm。进一步地，第一喷头可采用高精密点胶喷头(如上普博源(北京)生物科技有限公司提供)。
[0156] S422，使第二喷头以3mm/s～5mm/s的速度沿根据三维数据模型规划的打印路径移动，同时在第二挤出温度下挤出生物墨水于可降解高分子材料纤维之间的间隙中，以打印水凝胶纤维。其中生物墨水在第二挤出温度下呈凝胶状态。
[0157] 在步骤S422，可将生物墨水加入生物打印机的与第二喷头相连的料筒中，设置保温温度为第二挤出温度。在一些实施例中，第二挤出温度可以为18℃～30℃，例如18℃～22℃，再例如19℃～20℃。
[0158] 作为具体的示例，在生物墨水中，水凝胶材料为GelMA且浓度为10g/100mL～12g/100mL，基质材料为dMECM且浓度为0.5g/100mL～ 1g/100mL，固化剂为光引发剂LAP且浓度为0.2g/100mL～ 0.25g/100mL，种子细胞为MFCs且浓度为0.75×106个/mL～1×106个 /mL；
第二挤出温度可以为18℃～22℃，再例如19℃～20℃。
[0159] 进一步地，第二喷头的内径可以为500μm。进一步地，第二喷头可采用水凝胶喷头TT(如上普博源(北京)生物科技有限公司提供)。
[0160] S423，每一层在打印完成后进行预交联。
[0161] 在步骤S423，经预交联，可使生物墨水初步成胶，防止其流动，由此能提高支架的结构精细度。
[0162] 在步骤S423，可采用本领域已知的方法和设备进行预交联，例如热预交联和/或辐照预交联。例如，固化剂包括LAP，可采用蓝光辐照来进行光预交联。作为具体的示例，光预交联可采用打印机自带蓝光进行辐照。辐照强度可以为90mW/cm2。进一步地，光预交联的时间可以为2s。
[0163] 按照步骤S421～S423打印每一支架层。
[0164] S424，打印完成所有层后，得到初始支架，初始支架经交联，得到半月板支架。
[0165] 在步骤S424，可采用本领域已知的方法和设备进行预交联，例如热预交联和/或辐照预交联。例如，固化剂包括LAP，可采用蓝光辐照来进行光交联。作为具体的示例，光交联的蓝光强度可以为90 mW/cm2。进一步地，光交联的时间可以为10s。
[0166] 在步骤S424，经交联后的组织工程半月板支架能获得较高的力学性能。交联处理还能改善水凝胶纤维的降解速率，防止其收缩变形，从而有利于保持支架的外观形态及其内部的微结构，因此能提高半月板再生修复效果。
[0167] 步骤S400打印得到的半月板支架可加入培养基，在37℃，5％CO2的培养箱培养。
[0168] 本发明根据不同材料的不同特性设计了针对性的打印方案，能将不同材料的优点结合起来，实现高度仿生的半月板支架打印。本发明的打印方案使半月板支架具有较高的结构稳定性和生物相容性，更优选地，还具有较高的细胞存活率。采用本发明的半月板支架可以很好地促进缺损半月板的再生修复，使新生半月板组织具有优良的形态、力学性能及生理功能。
[0169] 本发明为组织工程修复半月板缺损提供了新方法，并且为生物3D打印技术的进一步发展提供了一定的实践经验。
[0170] 接下来，本发明还提供一种组织工程半月板支架。半月板支架呈C 形、且与待修复半月板的初始形状一致，支架包括在自身高度方向依次层叠设置的多个支架层，每个支架层包括间隔设置的多根可降解高分子材料纤维，且相邻两个支架层的可降解高分子材料纤维之间相交；其中，支架层的多根可降解高分子材料纤维之间的间隙中还设有水凝胶纤维，水凝胶纤维由生物墨水经交联得到，生物墨水中包含水凝胶材料、基质材料、固化剂和种子细胞，其中水凝胶材料包括甲基丙烯酰胺基明胶(GelMA)、透明质酸(HA)和藻酸盐中的一种或几种，基质材料包括脱细胞半月板细胞外基质(dMECM)、脱细胞软骨细胞外基质、脱细胞脐带华通胶细胞外基质、I型胶原、II型胶原、细菌纤维素、蚕丝蛋白和糖胺多糖中的一种或几种。
[0171] 半月板支架能实现对个体半月板形态学的高度仿生。在支架中，可降解高分子材料纤维构成支架的主体框架，能使支架具有良好的力学性能，在半月板损伤修复过程中能起到长期可靠的支撑作用。位于主体框架内的水凝胶材料/基质材料的复合水凝胶纤维，能高度仿生半月板内细胞生长的天然微环境，使支架具有较高的生物相容性。可降解高分子材料纤维和水凝胶纤维共同构成支架内的孔隙结构，有利于细胞的黏附和迁移。在水凝胶纤维的原料(即生物墨水)中还负载有活细胞，实现了活细胞3D打印，同时还能使细胞在支架中的均匀分布，有利于提高半月板再生修复的效果。优选地，每相邻两根可降解高分子材料纤维之间均设有水凝胶纤维。
[0172] 本发明提供的组织工程半月板支架融合了形态学、力学和生物学的多方面优势，从而可以很好地促进缺损半月板的再生修复，使新生半月板具有优良的形态、力学性能及生理功能。
[0173] 在一些实施例中，上述多个支架层包括在支架高度方向交替设置的多个第一支架层和多个第二支架层，其中，第一支架层中的可降解高分子材料纤维基本沿支架的径向延伸，第二支架层中的可降解高分子材料纤维基本沿支架的环向延伸。
[0174] 在一些实施例中，上述多个支架层包括在支架高度方向交替设置的多个第一支架层和多个第二支架层，其中，第一支架层中的可降解高分子材料纤维基本沿支架的径向延伸，第二支架层中的可降解高分子材料纤维与第一支架层中的可降解高分子材料纤维基本垂直。
[0175] 本发明提供的组织工程半月板支架可以是采用前文所述的任意一种制备方法制备得到。因此，半月板支架也具有相应的有益效果。
[0176] 实施例
[0177] 下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
[0178] 以下实施例中采用的：
[0179] PBS：美国Corning Cellgro公司提供，pH＝7.4(25℃)。
[0180] 0.2％Ⅱ型胶原酶：美国sigma-aldrich公司提供。
[0181] FBS：北京元亨圣马生物科技有限公司提供。
[0182] DMEM/F12培养液：美国Corning公司提供。
[0183] GelMA干粉和2.5g/100mL的LAP溶液：上普博源(北京)生物科技有限公司提供。
[0184] 生物打印机：Biomaker，上普博源(北京)生物科技有限公司提供。
[0185] 实施例1
[0186] (1)dMECM制备：将新鲜的猪半月板剪去多余的滑膜组织，并将其剪成体积≤1mm×1mm×1mm的组织碎块。将半月板组织碎块装入无菌的容器中，使用医用双氧水(3％)对半月板组织碎块漂洗3次，每次5min。再使用三蒸水对半月板组织碎块漂洗3次，每次5min。取上述处理后的半月板组织碎块样品送细菌培养。经证实无菌后，将无菌的半月板组织碎块加入三蒸水中，用匀浆机破碎成悬浮浆料。该悬浮浆料的质量浓度为1g/100mL。在赛默飞Sorvall RC6+型低温高速离心机中，在20℃下以 1500rpm对悬浮浆料离心5min，取上清液在20℃下以2000rpm离心 15min，再次取上清液在4℃下以6000rpm离心20min，最后取上清液在4℃下以10000rpm离心30min，收集沉淀。然后将沉淀与三蒸水混匀，继续在 4℃下以
10000rpm离心30min，重复3次。得到dMECM。将所得dMECM 与三蒸水混合，制成浓度为3g/
100mL的混悬液。4℃保存。
[0187] 将美国Qsonica Q125型超声破碎仪放入生物安全柜进行紫外线消毒，并将超声探头进行高温高压消毒。然后将装有混悬液的试管放入冰槽，设置超声振幅为70％，采用间歇脉冲模式对dMECM进行无菌超声粉碎处理 90s，其中间歇脉冲模式为：脉冲时间为5s，间歇时间为5s。获得具有目标颗粒粒径的dMECM。
[0188] 对所得dMECM进行粒径分析。结果如图1所示，该dMECM的颗粒粒径基本在300μm以下，且大部分在200μm以下。因此，该dMECM可通过内径400μm的打印喷头，具备可打印性。
[0189] (2)MFCs的原代培养：将1月龄的新西兰白兔用耳缘静脉空气栓塞法处死，常规膝关节备皮，碘伏酒精消毒，铺单，膝关节内侧入路切开皮肤，并游离皮下组织，打开关节囊，将髌骨外翻，切取半月板并放入加有双抗的PBS内。将装有新鲜半月板组织的培养皿置于超净台内，然后转移入青霉素小瓶，PBS反复清洗3次。用眼科剪将半月板尽量剪碎，最终剪成体积小于1mm×1mm×1mm的组织碎块。加入10倍于半月板体积的0.2％Ⅱ型胶原酶。然后将混悬液置于37℃、5％CO2培养箱内，每隔3h收集一次酶解的混悬液，再重新加入新的0.2％Ⅱ型胶原酶，重复4次；收集的混悬液用含20％FBS的DMEM/F12培养液终止胶原酶消化。离心并以 0.75×106个原代细胞的密度将其种植于75cm2的培养瓶内，待细胞长至80％～90％融合，用0.25％的胰酶消化后传代培养。
[0190] (3)生物墨水配制：将GelMA干粉加入PBS中，60℃水浴溶解2h，之后在4℃静置5min，然后再次于60℃水浴溶解2h，GelMA完全溶解，获得浓度为20g/100mL的GelMA溶液。将(1)中所得dMECM混悬液和 GelMA溶液按比例混合，并加入2.5g/100mL的LAP溶液和含20％FBS的 DMEM/F12培养液，配制成含有10g/100mL的GelMA，0.5g/100mL的 dMECM和0.25g/
100mL的LAP的复合凝胶溶液。将传代培养后的MFCs 用胰酶消化后计数，之后使用低温高速离心机以1200rpm离心5min；然后用上述配制的复合凝胶溶液对细胞进行重悬，得到生物墨水。其中含 MFCs为1×106个/mL。
[0191] (4)对(3)中所得复合凝胶溶液进行流变学分析：复合凝胶溶液的流变性能使用奥地利安东帕高级旋转流变仪(Anton Paar MCR301)进行测量。平行板选用磨砂型几何体，直径25mm。同时在复合凝胶溶液的周围用油密封，以防止变干。在15℃到37℃的范围内测量复合凝胶溶液的温敏特性，用储能模量G’和损耗模量G”评估其粘弹性。测试条件为：温度每分钟升高1℃，应变为2％，频率是1Hz。
[0192] 测试结果如图2所示，复合凝胶溶液具有明显的温敏性特征，由此，确定生物墨水的打印温度为20℃。
[0193] (5)半月板支架的3D打印：如图3所示，对半月板进行CT扫描；利用软件minics21.0构建半月板的三维数据模型；利用生物打印机自带软件biomaker进行半月板打印路径规划，完成打印模型设计。然后以(3) 中所得生物墨水作为水凝胶纤维的原料、以分子量为4.5W的PCL作为 PCL纤维的原料，采用生物打印机逐层打印半月板支架，包括：内径 400μm的高精密点胶喷头通过高温熔融的方式打印PCL，挤出温度 T1＝85℃，喷头移动速度v＝
5mm/s。内径为500μm的水凝胶喷头为低温控温打印生物墨水，挤出温度T2＝20℃，喷头移动速度v＝5mm/s。丝间距 (即相邻两个PCL纤维的中心线间距)为1.5mm。打印平台温度为37℃。每一层打印完成后，以打印机自带蓝光辐照进行光预交联，辐照强度为90 mW/cm2，时间为2秒，使生物墨水初步成胶，防止流动。所有层打印完成后，在辐照强度为90mW/cm2下光交联10秒，得到半月板支架。可将半月板加入培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
[0194] 扫描电镜(日本日立公司(Hitachi,Tokyo,Japan)的S-4800型)观察的半月板支架的结构如图4所示。其中，半月板支架呈C形、且与待修复半月板的初始形状一致，支架包括在自身高度方向依次层叠设置的多个支架层，每个支架层包括间隔设置的多根PCL纤维和位于每相邻两根PCL纤维之间的水凝胶纤维。具体的，多个支架层包括在支架高度方向交替设置的多个第一支架层和多个第二支架层，第一支架层中的PCT纤维基本沿支架的径向延伸，第二支架层中的PCL纤维与第一支架层中的PCL纤维基本垂直。
[0195] 支架的镜下观如图4b所示，其中，PCL纤维呈白色，丝径为500±50 μm；水凝胶纤维呈透明状，丝径为1000±100μm。
[0196] 半月板支架的力学性能可以采用日本岛津的EZ-LX型单柱式电子万能试验机(载荷容量500N)测试。测试方法包括：
[0197] 压缩模量测试采用直径d＝5mm，高度h＝2.5mm的圆柱模型；室温 (25℃)下，以1mm/min的压缩速率对其进行压缩，同样以1mm/min的回复速率使样品回弹，往复循环3次，形变量为10％。
[0198] 拉伸模量测试采用长宽均为6mm，高2.5mm的模型；室温(25℃) 下，以3mm/min的拉伸速率对进行拉伸，应变量为5％。
[0199] 以上每个测试均重复三个样品，根据应力应变曲线趾部区域之后的线性部分计算模量。
[0200] 如图5所示。可以看出，该半月板支架的压缩模量为12.63MPa，高于人类的半月板0.3MPa～2MPa；拉伸模量为24.86MPa，接近于人类的半月板4MPa～20MPa。总体来说，半月板支架的力学性能较为接近人类的半月板，结构稳定性良好，完全能够满足力学支撑的需求，同时能避免对股骨踝的摩擦损伤。
[0201] 半月板支架的细胞存活率共聚焦显微镜观察：用活/死细胞染色试剂盒(美国Biovision公司)染色，用荧光共聚焦显微镜(德国Leica公司的 TCS SP8型)拍照观察，评估支架细胞的存活率。结果如图6、图7和图8 所示。本发明的活细胞打印方案得到的半月板支架中，细胞存活率在90％左右，细胞存活率高。
[0202] 半月板支架用于羊体内半月板缺损再生修复的测试：沿髌韧带内侧依次切开皮肤，皮下组织，关节囊，暴露关节腔，髌骨脱位，用角膜钻在内侧半月板前角钻两个直径5mm的孔，外侧半月板打一个直径5mm的孔，将准备好的支架植入，缝合，然后依次将关节囊，皮下组织，皮肤分层缝合，切口消毒，允许动物自由活动。到达既定时间后对羊进行安乐死，取材并进行后续评估。
[0203] 图9为支架植入羊体内进行半月板缺损修复的示意图。a图为植入3个月的结果，表明支架基本能够融入组织。c图是植入6个月的结果，已经明显看到新生组织填补了缺损。b和d图分别是对应的股骨髁，表明股骨踝比较光滑，没有受到不利影响。证明采用本发明组织工程半月板支架的再生修复效果较好。
[0204] 以上结果表明，本发明实施例提供的组织工程半月板支架，其生物相容性好且力学强度高，适用于半月板缺损的移植，能够很好地促进缺损半月板组织的再生修复。
[0205] 以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
