[0001] 本发明涉及包含奥兰西丁或其药理学上可接受的盐作为有效成分的抗炎剂。

[0002] 奥兰西丁是化学名为1-(3,4-二氯苄基)-5-辛基双胍的具有高杀菌活性的化合物。作为其葡萄糖酸盐的奥兰西丁葡萄糖酸盐具有广杀菌谱，在短时间内显现杀菌效果，且其活性持续长时间。此外，奥兰西丁葡萄糖酸盐的水溶液的稳定性高，能够长期保存，并且对皮肤的刺激性、毒性低，在安全性方面也优异。此外，奥兰西丁葡萄糖酸盐的水溶液在颜色、气味及味道方面没有问题，因此容易制剂化(专利文献1)。因此，奥兰西丁葡萄糖酸盐主要用于手术部位(术野)的皮肤的消毒。

[0003] 然而，目前尚不知晓奥兰西丁或其盐显示抗炎作用。此外，由于奥兰西丁葡萄糖酸盐对粘膜具有刺激性，因此奥兰西丁葡萄糖酸盐难以应用于口腔粘膜等粘膜。

[0004] 现有技术文献

[0005] 专利文献

[0006] 专利文献1：日本特开2005-289959公报

[0050] 本发明的组合物为包含奥兰西丁或其药理学上可接受的盐的用于改善及/或预防炎症的组合物。作为奥兰西丁的药理学上可接受的盐，可以使用药理学上已知的盐，例如，可示例盐酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、乳酸盐、乙酸盐、葡庚糖酸盐、酒石酸盐等，从在水中的溶解性的观点考虑，优选奥兰西丁葡萄糖酸盐。

[0051] 本发明的组合物中，奥兰西丁只要以能够显示抗炎作用的浓度被包含即可，以奥兰西丁葡萄糖酸盐换算计，可示例0.001～20％(W/V)、优选0.005～15％(W/V)、更优选0.01～10％(W/V)、进一步优选0.1～5％(W/V)。另外，在将本发明的组合物应用于口腔粘膜等粘膜的情况下，奥兰西丁的浓度以奥兰西丁葡萄糖酸盐换算计，优选为0.01～1.5％(W/V)，更优选为0.05～0.5％(W/V)，进一步优选为0.1～0.3％(W/V)。需要说明的是，在将本发明的组合物应用于口腔粘膜的情况下，奥兰西丁葡萄糖酸盐的浓度低于0.01％(W/V)时，无法充分获得对口腔细菌的杀菌效力，超过1.5％(W/V)时，对口腔粘膜的刺激变得过强，故不理想。

[0052] 为了降低对应用部位的刺激，本发明的组合物可以还包含一种或两种以上的泊洛沙姆。此处，作为泊洛沙姆，只要为由聚氧丙烯链(POP)及夹着该POP的两个聚氧乙烯链(POE)形成的嵌段共聚物、且为降低对应用部位的刺激的物质即可，没有特别限制，优选为选自聚氧乙烯(42)聚氧丙烯(67)二醇(Pluronic P-123)、聚氧乙烯(54)聚氧丙烯(39)二醇(Pluronic P-85)、及聚氧乙烯(196)聚氧丙烯(67)二醇(Pluronic F-127)中的一种或两种以上的泊洛沙姆，其中，可示例聚氧乙烯(42)聚氧丙烯(67)二醇(Pluronic P-123)、聚氧乙烯(3)聚氧丙烯(17)二醇(Pluronic L-31)、聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)二醇(Pluronic L-44)、聚氧乙烯(120)聚氧丙烯(40)二醇(Pluronic F-87)、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇(Pluronic F-68)。

[0053] 上述泊洛沙姆中，优选选自聚氧乙烯(42)聚氧丙烯(67)二醇(Pluronic P-123)、聚氧乙烯(54)聚氧丙烯(39)二醇(Pluronic P-85)、及聚氧乙烯(196)聚氧丙烯(67)二醇(Pluronic F-127)中的一种或两种以上的泊洛沙姆，其中，更优选聚氧乙烯(42)聚氧丙烯(67)二醇(Pluronic P-123)。

[0054] 作为泊洛沙姆的浓度，没有特别限制，可举出0.1～5.0％(W/V)、优选0.1～4.0％(W/V)、更优选0.1～3.0％(W/V)、进一步优选0.1～2.0％(W/V)、最优选0.1～1.5％(W/V)。另外，奥兰西丁葡萄糖酸盐与泊洛沙姆的浓度比优选为1：2～1：20，更优选为1：5～1：10。将本发明的组合物应用于口腔粘膜的情况下，在奥兰西丁葡萄糖酸盐浓度0.3％(W/V)以上的高浓度范围，由奥兰西丁葡萄糖酸盐带来的对口腔粘膜的刺激更强，因此，从抑制由奥兰西丁葡萄糖酸盐带来的刺激(角化过度)的方面考虑，优选进一步增多泊洛沙姆量。

[0055] 本说明书中，所谓“炎症”，是指下述生物体反应：因自身免疫疾病等内部因素、或者细菌·病毒感染、外伤、物理刺激(热、寒冷、放射线、电等)、化学物质等外部因素而产生发红、发热感、肿胀、疼痛这样的体征。作为本发明中的炎症，只要为能够应用本发明的组合物的炎症即可，没有特别限制，优选可举出Toll样受体参与的炎症，更优选可举出由细菌感染导致的炎症。另外，作为炎症部位，可示例脑、眼、气管、血管、肺、肝脏、心脏、胰脏、胃、肠、肠系膜、肾脏、皮肤、鼻粘膜、口腔粘膜、牙龈或关节，具体而言，可举出脑炎、支气管炎、血管炎、肺炎、肝炎、心肌炎、胰腺炎、肠炎、胃炎、腹膜炎、肾炎、口腔炎、口腔粘膜炎、牙龈炎、关节炎、由缺血后再灌流损伤引起的炎症、由移植后免疫排斥引起的炎症、由烧伤、多发性器官损害引起的炎症、手术后产生的炎症、及由动脉硬化症引起的炎症，其中，可优选示例口腔炎、口腔粘膜炎、牙龈炎、及肺炎。本说明书中，所谓口腔粘膜炎，是指因治疗癌症而在口腔粘膜中产生的炎症，所谓口腔炎，是指口腔粘膜中产生的并非因癌症的治疗而导致的炎症。另外，本发明的组合物可以为具有用于改善及/或预防因癌症的治疗而导致的口腔粘膜炎这样的特定用途的组合物，但在一个方式中，本发明不包括具有用于改善及/或预防因癌症的治疗而导致的口腔粘膜炎这样的用途的组合物在内。

[0056] 本发明的组合物能够应用于炎症部位的皮肤、口腔粘膜、牙龈、消化道、气管、肺等的粘膜。作为施予方法，可举出注射(静脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹腔内等)、经口、经皮、吸入、向口腔内的涂布、向牙龈的涂布、含嗽等，可适宜地与这些施予方法相适应地进行制剂化。另外，可选择的剂型也没有特别限定，可广泛地从例如注射剂(溶液、混悬液、乳浊液、用于在使用时溶解的固态剂等)、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、含嗽剂、脂化剂、软膏剂、凝胶剂、外用散剂、喷雾剂、吸入散剂等中选择。另外，制备这些制剂时，可以使用惯用的赋形剂、稳定剂、粘合剂、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂、pH调节剂、以及着色剂、崩解剂等通常药物中使用的成分。

[0057] 在将本发明的组合物应用于口腔内的情况下，可以为适于在口腔内使用的任意剂型，优选可举出液体制剂、含嗽剂。另外，可以为饴糖类、糖果类、橡皮糖类、含片类、胶类等在口腔中逐渐溶解或崩解的固态组合物。此外，根据需要，可以进一步含有出于赋予风味香味或者进行着色的目的而使用的各种添加物。作为以赋予风味香味为目的的添加物，例如可举出合成香料、天然香料、阿斯巴甜、乙酰磺胺酸钾、蔗糖素、阿力甜、钮甜、甘草提取物(甘草酸)、糖精、糖精钠、甜菊提取物、甜菊粉末等甜味剂。作为以着色为目的的添加物，可举出焦糖、天然着色剂、合成着色剂。另外，本发明的组合物可以含有乳化剂(丙三醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、卵磷脂等)、稳定剂、防腐剂等添加物。这些添加剂可以单独使用，也可以组合两种以上而使用。

[0058] 将本发明的组合物以液体制剂或含嗽剂的形式施予的情况下，作为每次的施予量，可根据炎症产生的部位、严重程度而任意地确定，可举出1～100mL、优选2～50mL、更优选5～40mL、最优选10～30mL。

[0059] 作为施予本发明的组合物的时间点，可根据炎症产生的部位、严重程度、或者炎症的改善度而任意地确定，可举出吃饭后或者起床后或睡觉前。或者，也可以以2～8小时的间隔、优选4～6小时的间隔进行施予。另外，通过对手术前的患者、口腔护理后的患者施予本发明的组合物，从而能够预防炎症。

[0060] 作为本发明的组合物的施予时间，可根据炎症的改善度而任意地确定，可举出1周～3个月、优选1周～两个月、更优选1周～1个月、最优选1～2周。

[0061] 本发明中，作为癌症的治疗，可举出癌症的化学疗法、放射线治疗、或者同时并用化学疗法与放射线治疗的疗法。所谓癌症的化学疗法，是指基于抗癌剂的全部癌症治疗。作为本发明中使用的抗癌剂，可举出容易引起口腔粘膜炎的氟尿嘧啶(5-FU)、替加氟/吉美嘧啶/奥替拉西钾(S-1)、替加氟·尿嘧啶(UFT)等氟化嘧啶系代谢拮抗剂、甲氨蝶呤等叶酸代谢拮抗剂、道诺霉素、阿霉素、表柔比星、博来霉素、培洛霉素、放线菌霉素D等抗肿瘤抗生素、紫杉醇、多西紫杉醇、长春新碱、依托泊苷等植物生物碱、顺铂、卡铂、奈达铂等铂制剂，尤其可优选示例5-FU等氟化嘧啶系代谢拮抗剂。这些抗癌剂可以单独使用，也可以并用两种以上。

[0062] 另外，本发明中，所谓放射线治疗，是指以对恶性肿瘤部位照射放射线来抑制癌细胞的增殖为目的的治疗，作为该治疗中使用的放射线，可举出X射线、电子射线等。另外，所谓同时并用化学疗法与放射线治疗的疗法，是指通过将作为癌症的局部疗法的放射线疗法与抗癌剂并用来增强放射线的效果的治疗方法。放射线治疗的对象部位没有特别限制，可示例对头颈部、尤其是口腔内、咽部的放射线治疗。

[0063] 以下，利用实施例更具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不限定于这些示例。

[0064] 实施例1

[0065] 1.使用了食蟹猕猴的口腔内杀菌效力试验

[0066] 本试验中，并用简易细菌计数器和培养法，将试验物质(作为杀菌消毒剂的0.1％(w/v)奥兰西丁葡萄糖酸盐及0.47％聚维酮碘，作为阴性对照药的生理盐水)对食蟹猕猴口腔内细菌的杀菌效力进行比较、研究。

[0067] 1-1试验物质

[0068] 受试物质以将1.5％Olanedine(注册商标)消毒液(以下称为“1.5％OPB”等，其是包含1.508％(w/v)奥兰西丁葡萄糖酸盐的液体，株式会社大塚制药工场制)稀释15倍而使得奥兰西丁葡萄糖酸盐浓度成为0.1％(w/v)的方式进行制备(0.1％OPB)。作为对照物质的7％聚维酮碘含漱液(以下称为“7％PVP-I”等，Meiji Seika Pharma株式会社制)稀释15倍(0.47％PVP-I)后使用，生理性盐水(生理盐水(Saline)，株式会社大塚制药工场制)直接使用。

[0069] 1-2试验动物

[0070] 使用了在使用时年龄为2岁11个月～3岁11个月的食蟹猕猴(雄性，柬埔寨产，株式会社Eib Bioscience Co.,Ltd制)。

[0071] 1-2-1组构成

[0072] 将各动物的口腔内作为试验部位。使用9只动物，涂布0.1％OPB、0.47％PVP-I及生理盐水，因此每一组的试验部位为3处。在试验物质涂布前、涂布10分钟后、6小时后及24小时后采集细菌，共计4次。

[0073] 1-2-2动物编号及试样编号

[0074] 以下述表1的方式分配动物编号及试样编号。需要说明的是，测定动物编号1～3的基线细菌数，以细菌数多的顺序供于利用生理盐水、0.1％OPB、0.47％PVP-I的试验。同样地，动物编号4～6以细菌数多的顺序供于利用0.1％OPB、0.47％PVP-I、生理盐水的试验，动物编号7～9以细菌数多的顺序供于利用0.47％PVP-I、生理盐水、0.1％OPB的试验。

[0075] [表1]

[0076]

[0077] 1-3试验方法

[0078] 1-3-1麻醉

[0079] 针对食蟹猕猴，将盐酸氯胺酮(以氯胺酮计为50mg/mL，Daiichi  Sankyo Propharma株式会社制)与2％Celactal注射液(以甲苯噻嗪计为2.0g/100mL，拜耳药品株式会社制)的2：1的混合液以每1kg体重为0.5mL的方式进行肌肉注射，进行全身麻醉。

[0080] 1-3-2涂布

[0081] 〔1〕将100mL试验物质注入至放有2块小鼠纯口腔护理海绵(川本产业株式会社制)的容器(250mL，Corning株式会社制)中。

[0082] 〔2〕将海绵内的空气挤掉，充分地浸渍。

[0083] 〔3〕在口腔内涂布约2分钟。

[0084] 1-3-3细菌采集1

[0085] 〔1〕用灭过菌的手套使用无菌棉棒，从猴口腔内采集细菌(来回摩擦口腔内两侧壁各2次)。

[0086] 〔2〕将棉棒放入5mL样品液(10％(w/v)聚山梨酯80、0.04％(w/v)磷酸二氢钾、0.1％(w/v)TritonX-100、1.01％(w/v)无水磷酸一氢钠、2％(w/v)大豆卵磷脂、5％(w/v)聚氧乙烯(20)十六烷基醚、H7.8～7.9)中。

[0087] 1-3-4细菌采集2

[0088] 〔1〕将作为测定消耗品(DU-AC02NP-H，Panasonic Healthcare公司制)的棉棒安装至定压检体采集器具(DU-AE01NT-H，Panasonic Healthcare公司制)。

[0089] 〔2〕将棉棒以恒定压力压靠至猴的舌头上，以约1cm的间隔来回摩擦3次。

[0090] 1-3-5基于平板培养法的口腔内细菌数测定

[0091] 以新GMP微生物试验法2)、食品卫生检查指南3)为参考，实施琼脂平板倾注法及琼脂平板表面涂抹法。

[0092] 〔1〕对1-3-3中回收细菌而得到的样品液进行剧烈搅拌，将其作为回收菌液。

[0093] 〔2〕将0.5mL回收菌液稀释10倍，进而利用同样的操作反复进行稀释，制作10倍稀释系列(5个梯度)。

[0094] 〔3〕将回收菌液及经梯度稀释的稀释液各1mL分别注入至培养皿中。向其中添加约15mL的于约47℃保存的测定培养基(TSA+)来制作倾注平板。另外，将回收菌液及经梯度稀释的稀释液各100μL分别注入至血液琼脂培养基及MS琼脂培养基中，使用细菌涂布棒(bacteria spreader)进行表面涂抹。

[0095] 〔4〕在测定培养基(TSA+)固化后，将倾注平板倒置，进行培养直至能够进行菌落计数。另外，就表面涂抹平板而言，进行倒置，在厌氧性条件下进行培养，直至能够进行菌落计数。

[0096] 〔5〕使用菌落计数器(DC-3，AS ONE株式会社)，对在倾注平板及表面涂抹平板上增殖的菌落进行计数。就菌落数过多而无法将菌落间进行区分的倾注平板而言，作为TNTC(too numerous to count(太多而无法计数))而未进行计数。

[0097] 1-3-6基于细菌计数器的口腔内细菌数测定

[0098] 〔1〕将细菌计数器(DU-AA01，Panasonic Healthcare公司制)的盖子打开。

[0099] 〔2〕将作为测定消耗品的传感器芯片安装于细菌计数器。

[0100] 〔3〕将作为测定消耗品的一次性杯子设置于细菌计数器。

[0101] 〔4〕在一次性杯子中心设置采集了细菌的棉棒。

[0102] 〔5〕关上细菌计数器的盖子。

[0103] 1-4结果

[0104] 1-4-1基于平板培养法的口腔内细菌数测定

[0105] (1)需氧培养

[0106] 将结果示于图1。基线口腔内细菌数为1.73×105～4.20×106。涂布生理盐水后的口腔内细菌数基本恒定。就涂布试验物质10分钟后的活菌数而言，生理盐水、0.1％OPB及0.47％PVP-I的情况下分别为6.48×105CFU、4.65×103CFU及2.35×104CFU，涂布6小时后分别为1.66×106CFU、1.47×103CFU及4.93×105CFU，24小时后分别为4.67×105CFU、5.58×
104CFU及1.22×106CFU。

[0107] (2)利用链球菌选择培养基进行的培养

[0108] 将结果示于图2。基线口腔内细菌数为2.85×105～7.60×107。涂布生理盐水后的口腔内细菌数基本恒定。就涂布试验物质10分钟后的活菌数而言，生理盐水、0.1％OPB及0.47％PVP-I的情况下分别为1.26×106CFU、5.97×103CFU及7.33×104CFU，涂布6小时后分别为5.51×106CFU、2.79×104CFU及2.20×106CFU，24小时后分别为1.71×106CFU、4.30×
105CFU及7.81×106CFU。

[0109] (3)厌氧培养

[0110] 将结果示于图3。基线口腔内细菌数为2.45×105～1.65×107。涂布生理盐水后的口腔内细菌数基本恒定。就涂布试验物质10分钟后的活菌数而言，生理盐水、0.1％OPB及0.47％PVP-I的情况下分别为2.70×106CFU、1.33×104CFU及7.33×104CFU，涂布6小时后分
6 4 6 6
别为3.22×10CFU、1.38×10 CFU及1.80×10 CFU，24小时后分别为1.71×10CFU、3.04×
105CFU及1.40×106CFU。

[0111] 1-4-2基于细菌计数器的口腔内细菌数测定

[0112] 将结果示于图4。基线口腔内细菌数为1.29×106～>1.00×108。就涂布试验物质10分钟后的活菌数而言，生理盐水、0.1％OPB及0.47％PVP-I的情况下分别为2.84×106CFU、<3.49×105CFU及5.09×105CFU，涂布6小时后分别为2.04×107CFU、5.58×105CFU及8.98×
106CFU，24小时后分别为4.10×107CFU、3.14×107CFU及3.14×107CFU。

[0113] 在基于平板培养法的细菌数测定、基于细菌计数器的细菌数测定中，均获得了同样倾向的结果。即，0.1％OPB组在涂布6小时后为止将细菌数保持在低值，而0.47％PVP-I组仅在涂布10分钟后为止显示出效果。但是，两组的细菌数均在24小时后恢复。之所以0.47％PVP-I组未观察到持续性，认为是由于PVP-I容易因口腔内的有机物而受到失活的影响。就口腔内杀菌消毒效果而言，认为0.1％OPB具有持续性，是优异的。

[0114] 实施例2

[0115] 2.使用了仓鼠的口腔内杀菌试验1

[0116] 本试验中，目的在于将含嗽剂(杀菌消毒剂)对正常仓鼠口腔内粘膜的杀菌效力与其他药剂进行比较研究。为了研究杀菌活性的持续性，在含嗽试验物质后～24小时为止，选取时间点(前置、紧接着之后、8小时后、24小时后)，使用细菌计数器及培养法来计测细菌数。

[0117] 2-1试验物质

[0118] 将受试物质和对照物质一并作为试验物质。

[0119] 2-1-1受试物质1

[0120] 名称：0.1％OPB-1

[0121] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐         0.10w/v％

[0122]      Pluronic L-44              0.07w/v％

[0123]      Pluronic P-123             1.0w/v％

[0124] 2-1-2受试物质2

[0125] 名称：0.1％OPB-2

[0126]

[0127] 2-1-3对照物质1

[0128] 名称/简称：基剂/Base

[0129] 组成：Pluronic L-44          0.07w/v％

[0130]      Pluronic P-123         1.0w/v％

[0131] 2-1-4对照物质2

[0132] 名称/简称：Peridex(注册商标)/0.12％CHG

[0133] 组成：氯已定葡萄糖酸盐      0.12w/v％

[0134] 2-1-5对照物质3

[0135] 名称/简称：聚维酮碘含漱液0.47％/0.47％PVP-I

[0136] 组成：聚维酮碘含漱液7％(7％PVP-I，Meiji SeikaPharma株式会社制)的15倍稀释液

[0137] 2-2使用的动物

[0138] 使用购入时6周龄的仓鼠、Slc:Syrian、雄性，以各组4只进行试验。

[0139] 2-3试验方法

[0140] 2-3-1麻醉

[0141] 实施气体麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社制)，适当调节浓度持续麻醉]。

[0142] 2-3-2施予试验物质

[0143] 在麻醉下，将仓鼠固定在仰卧位，向单个颊囊内注入试验物质各1mL。30秒后，排出试验物质，用无菌棉棒吸取颊囊内的多余试验物质。

[0144] 2-3-3细菌采集

[0145] 在施予试验物质前、0hr、8hr、24hr共计4个时间点，在麻醉下使用无菌棉棒从两个颊囊内采集细菌。将采集后的棉棒在5mL SCDLP培养基中浸渍，然后搅拌，作为细菌计数用样品。

[0146] 2-3-4活菌数的测定

[0147] 以新GMP微生物试验法1)、食品卫生检查指南2)为参考，实施琼脂平板倾注法。

[0148] 〔1〕采集500μL细菌计数用样品，使用4.5mL的稀释液，制作101倍～106倍的10倍稀释系列。

[0149] 〔2〕将细菌计数用样品原液及各稀释菌液各1mL分别注入至灭菌培养皿中。

[0150] 〔3〕将在设定为约47℃的恒温槽中保温的测定培养基(TSA+)15mL迅速地分别注入至上述的培养皿中。

[0151] 〔4〕在测定培养基固化后，将倾注平板倒置于培养箱内，于35℃进行培养，直至菌落能够计数(约2天)。

[0152] 〔5〕培养后，通过目视对在倾注平板上增殖的菌落进行计数。就菌落数过多而无法将菌落间进行区分的倾注平板而言，作为TNTC(too numerous to count)而未进行计数。

[0153] 〔6〕将稀释倍率乘以菌落数，算出活菌数。

[0154] 2-4结果

[0155] 将结果示于图5及表2。

[0156] [表2]

[0157] 仓鼠口腔中的活菌数就施予试验物质前的口腔内细菌数而言，各组间没有差别。就刚施予试验物质后的杀菌效力而言，0.1%OPB-1=0.1%OPB-2>0.12%CHG>0.47%PVP-I>基剂，施予8小时后，0.1%OPB-1=0.1%OPB-2=0.12%CHG>0.47%PVP-I=基剂，24小时后，各组间没有差别。由上述结果可知，就口腔内杀菌效力而言，0.1%OPB与0.12%CHG为同等程度，0.47%PVP-I的速效性弱，未观察到持续活性。

[0158] 作为本试验中0.47%PVP-I的杀菌活性低的原因，认为是由口腔内的蛋白质等带来的失活有大的影响。0.12%CHG被认为是与0.1%OPB同样地具有持续活性的口腔内杀菌消毒剂。

[0159] 实施例3

[0160] 3.使用了仓鼠的口腔内杀菌试验2

[0161] 本试验中，目的在于研究奥兰西丁浓度给含嗽剂（杀菌消毒剂）对正常仓鼠口腔内粘膜的杀菌效力所带来的影响。

[0162] 3-1试验物质

[0163] 将受试物质与对照物质一并作为试验物质。

[0164] 3-1-1受试物质1

[0165] 名称：0.1%OPB-1

[0166] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐...0.10w/v%

[0167] 聚氧乙烯（20）聚氧丙烯（20）二醇...0.07w/v%

[0168] 聚氧乙烯（160）聚氧丙烯（30）二醇...0.10w/v%

[0169] 3-1-2受试物质2

[0170] 名称：0.1％OPB-2

[0171] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐...0.10w/v％

[0172] 聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)二醇...0.07w/v％

[0173] 聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)...1.00w/v％

[0174] 3-1-3受试物质3

[0175] 名称：0.5％OPB-3

[0176] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐...0.50w/v％

[0177] 聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)...0.36w/v％

[0178] 聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)...5.00w/v％

[0179] 3-1-4受试物质4

[0180] 名称：1％OPB-2

[0181] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐...1.00w/v％

[0182] 聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)二醇...0.72w/v％

[0183] 聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇...10.00w/v％

[0184] 3-1-5对照物质

[0185] 名称：基剂

[0186] 组成：聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)二醇...0.07w/v％

[0187] 聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇...0.10w/v％

[0188] 3-2使用的动物

[0189] 使用购入时6周龄的仓鼠、Slc:Syrian、雄性，以各组3只进行试验。

[0190] 3-3试验方法

[0191] 3-3-1麻醉

[0192] 实施气体麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社制)，适当调节浓度持续麻醉]。

[0193] 3-3-2施予试验物质

[0194] 在麻醉下，将仓鼠固定在仰卧位，向单个颊囊内注入试验物质各1mL。1分钟后，排出试验物质，用无菌棉棒吸取颊囊内的多余试验物质。

[0195] 3-3-3细菌采集

[0196] 在施予试验物质前、0hr、1hr、3hr、6hr共计5个时间点，在麻醉下使用无菌棉棒从两个颊囊内采集细菌。将采集后的棉棒在5mL SCDLP培养基中浸渍，然后搅拌，作为细菌计数用样品。

[0197] 3-3-4活菌数的测定

[0198] 活菌数的测定利用与2-3-4同样的方法进行。

[0199] 3-4结果

[0200] 将结果示于图6。由结果可知，0.1％OPB的情况下，能够持续(6小时后)地将细菌数抑制为低值。另外，OPB浓度为0.5w/v％以上时，持续活性更优异。

[0201] 实施例4

[0202] 4.使用了仓鼠的口腔粘膜刺激性试验1

[0203] 本试验中，将改变了0.1％奥兰西丁葡萄糖酸盐的基剂组成的研究制剂向仓鼠的颊囊中反复施予14天，对刺激性的程度进行比较研究。

[0204] 4-1受试物质

[0205] 4-1-1受试物质1

[0206] 名称：0.1％OPB-1

[0207] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐   0.10w/v％

[0208]      Pluronic L-44        0.07w/v％

[0209] 4-1-2受试物质2

[0210] 名称：0.1％OPB-2

[0211] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐   0.10w/v％

[0212]      Pluronic L-44        0.07w/v％

[0213]      Pluronic L-31        1.0w/v％

[0214] 4-1-3受试物质3

[0215] 名称：0.1％OPB-3

[0216] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐    0.10w/v％

[0217]      Pluronic L-44         0.07w/v％

[0218]      Pluronic P-123        1.0w/v％

[0219] 4-1-4受试物质4

[0220] 名称：0.1％OPB-4

[0221] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐    0.10w/v％

[0222]      Pluronic L-44         0.07w/v％

[0223]      Pluronic P-85         1.0w/v％

[0224] 4-1-5受试物质5

[0225] 名称：0.1％OPB-5

[0226] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐     0.10w/v％

[0227]      Pluronic L-44          0.07w/v％

[0228]      Pluronic F-127         1.0w/v％

[0229] 4-1-6受试物质6

[0230] 名称：0.1％OPB-6

[0231] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐      0.10w/v％

[0232]      Pluronic L-44           0.14w/v％

[0233]      Pluronic F-68           1.0w/v％

[0234] 4-1-7受试物质7

[0235] 名称：0.1％OPB-7

[0236] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐       0.10w/v％

[0237]      Pluronic L-44            0.07w/v％

[0238]      Trehalose                5.0w/v％

[0239] 4-2使用的动物

[0240] 使用购入时8周龄的仓鼠、Slc:Syrian、雄性，以各组3只进行试验。

[0241] 4-3试验方法

[0242] 4-3-1受试物质应用方法

[0243] (1)应用量

[0244] 向右颊囊应用1mL受试物质。

[0245] (2)应用方法

[0246] 〔1〕通过气体麻醉来导入麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社制)]。

[0247] 〔2〕在维持麻醉下(适当调节浓度)，将动物固定在仰卧位，使用棉棒拉出动物的颊囊，用单手轻轻捏住被拉出的颊囊。

[0248] 〔3〕用生理盐水及棉棒将附着于颊囊粘膜的饲料等异物去除，进行清洁后使颊囊恢复原状。

[0249] 〔4〕使用1mL注射器及经口施予用探针，将1mL受试物质应用于右颊囊，在左颊囊中，将安装于1mL注射器上的空的经口施予用探针插入·拔去。

[0250] 〔5〕应用30秒后，以使得受试物质不倒流至呼吸道内的方式使动物翻转至腹卧位并排出受试物质。使用棉棒将口腔内的多余受试物质全部除去。

[0251] 〔6〕对应用部位的颊粘膜的色调等进行观察·记录，在动物的颈部装上仓鼠用领圈后，将动物送回至笼子中。

[0252] 〔7〕以1天2次(早·晚)的方式将上述操作重复14天。

[0253] 4-3-2检查及观察

[0254] (1)一般状态的观察

[0255] 关于各组的全部例，在应用期间，于试验物质的应用前及应用结束时进行一般状态观察(第1天～第14天)。另外，在应用期间结束日的第二天也进行观察(第15天)。

[0256] (2)体重测定

[0257] 各组的全部例中，在应用期间，于试验物质的应用前测定体重(第1天～第14天)。另外，在应用期间结束日的第二天也进行测定(第15天)。其中，因体重计的故障，第13天、第
14天未测定体重。

[0258] (3)应用部位的肉眼观察方法

[0259] 关于各组的全部例的颊囊，在应用期间，于试验物质的应用前及应用结束时观察颊囊粘膜的状态，记录评分(第1天～第14天)。另外，在应用期间结束日的第二天(24±2小时)也进行观察(第15天)。观察部位为各试验物质的接触部位颊粘膜。需要说明的是，肉眼观察的评价方法中，按照以下的表3(ISO 10993-10，附录B.3“表B.2用于口腔和阴茎反应的评分系统”(Annex B.3“Table B.2 Grading system for oral and penile reactions”))中记载的观察基准及评价分数，对红斑及痂皮形成的程度给出评价分数(口腔炎等级)。另外，也对看到的其他观察结果进行记录。基于得到的观察结果，各组中针对各试验物质，将各动物的粘膜的评价分数进行加和，除以观察数及动物数，求出平均值(小数点后第一位四舍五入)，作为综合评价的参考资料。

[0260] [表3]

[0261] 表B.2用于口腔和阴茎反应的评分系统

[0262]

[0263] (4)病理学检查

[0264] 针对各动物，在应用期间结束日的第二天的肉眼观察结束后，在异氟醚麻醉下使其放血致死，采集左右颊囊，用10％中性缓冲福尔马林液进行固定。按照常规方法来制作HE染色的标本，实施病理学检查。需要说明的是，肉眼观察的评价方法中，按照ISO 10993-10、附录B.3“表B.3用于口腔、阴茎、直肠和阴道组织反应的显微镜检查的评分系统(Annex B.3“Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral,penile,rectal and vaginal tissue reaction)”中记载的基准，针对上皮、白细胞浸润、血管充血及水肿的各项目，记录观察结果或等级。另外，对观察到的其他观察结果也进行记录。

[0265] (5)综合评价

[0266] 以观察期间的一般状态及体重变化为参考，基于从颊粘膜的肉眼观察结果及病理学观察结果得到的各试验物质的反应程度，综合地评价各试验物质对口腔粘膜的影响。

[0267] 4-4结果

[0268] 4-4-1一般状态

[0269] 所有动物中均未观察到异常。

[0270] 4-4-2体重

[0271] 将结果示于图7。0.1％OPB-5组的体重基本没有变化。就其他组而言，平均值逐渐增加。

[0272] 4-4-3应用部位的肉眼观察

[0273] 将结果示于图8，将最后一天的各组的颊囊示于图9的照片1～8。在全部制剂中，基本未观察到红斑等刺激性。但是，在0.1％OPB-1、-2、-6、-7及-8中，观察到白斑症状(角化过度、增厚)。另一方面，在0.1％OPB-3、-4及-5中，完全未观察到异常。

[0274] 4-4-4病理组织学检查

[0275] 将结果示于图10。按照ISO 10993-10、附录B.3“表B.3用于口腔、阴茎、直肠和阴道组织反应的显微镜检查的评分系统”中记载的评价基准，通过上皮(细胞病变、化生及糜烂)、白细胞浸润、血管充血及水肿的评级，算出每个个体的炎症指数及每组的炎症指数的平均值。另外，也记录评价基准以外的观察结果。结果，就平均值而言，在0.1％OPB-3组中未观察到变化。在包括0.1％OPB-1组在内的其他组中，观察到上皮细胞病变及极小～中等的白细胞浸润，炎症指数被评价为1～3(极小)。这些组中，作为评价基准以外的观察结果，观察到了轻微的细胞间水肿及轻微至轻度的过角化。

[0276] 由以上的结果表明，0.1％OPB-3中使用的基剂Pluronic P-123作为奥兰西丁葡萄糖酸盐的口腔粘膜应用制剂的基剂特别有用。另外，表明通过肉眼观察完全未看到异常的0.1％OPB-4及-5中使用的Pluronic P-85及Pluronic F-127也可用作奥兰西丁葡萄糖酸盐的口腔粘膜应用制剂的基剂。

[0277] 实施例5

[0278] 5.使用了仓鼠的口腔粘膜刺激性试验2

[0279] 在实施例4的刺激性试验中，表明基剂Pluronic P-123作为奥兰西丁葡萄糖酸盐的口腔粘膜应用制剂的基剂有用。因此，本试验中，采用Pluronic P-123作为用于制作无刺激的制剂的基剂，继续进行OPB浓度及基剂浓度的研究。试验体系为向仓鼠颊囊的反复施予，将时间从2周延长至4周来进行实施。

[0280] 5-1受试物质

[0281] 5-1-1受试物质1

[0282] 名称：0.1％OPB-1

[0283] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐    0.10w/v％

[0284]      Pluronic L-44         0.07w/v％

[0285]      Pluronic P-123        0.50w/v％

[0286] 5-1-2受试物质2

[0287] 名称：0.1％OPB-2

[0288] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐    0.10w/v％

[0289]      Pluronic L-44         0.07w/v％

[0290]      Pluronic P-123        1.0w/v％

[0291] 5-1-3受试物质3

[0292] 名称：0.1％OPB-3

[0293]

[0294] 5-1-4受试物质4

[0295] 名称：0.1％OPB-4

[0296]

[0297] 5-1-5受试物质5

[0298] 名称：0.3％OPB-1

[0299] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐        0.30w/v％

[0300]      Pluronic L-44             0.22w/v％

[0301]      Pluronic P-123            1.50w/v％

[0302] 5-1-6受试物质6

[0303] 名称：0.3％OPB-2

[0304] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐         0.30w/v％

[0305]      Pluronic L-44              0.22w/v％

[0306]      Pluronic P-123             3.0w/v％

[0307] 5-1-7受试物质7

[0308] 名称：0.3％OPB-3

[0309] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐         0.30w/v％

[0310]      Pluronic L-44              0.22w/v％

[0311]      Pluronic P-85              1.50w/v％

[0312] 5-1-8受试物质8

[0313] 名称：0.3％OPB-4

[0314] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐          0.30w/v％

[0315]      Pluronic L-44               0.22w/v％

[0316]      Pluronic P-85               3.0w/v％

[0317] 5-1-9受试物质9

[0318] 名称：0.5％OPB-1

[0319] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐          0.50w/v％

[0320]      Pluronic L-44               0.36w/v％

[0321]      Pluronic P-123              2.50w/v％

[0322] 5-1-10受试物质10

[0323] 名称：0.5％OPB-2

[0324] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐       0.50w/v％

[0325]      Pluronic L-44            0.36w/v％

[0326]      Pluronic P-123           5.0w/v％

[0327] 5-1-11受试物质11

[0328] 名称：0.5％OPB-3

[0329]

[0330] 5-1-12受试物质12

[0331] 名称：0.5％OPB-4

[0332]

[0333] 5-2使用动物

[0334] 使用购入时8周龄的仓鼠、Slc:Syrian、雄性，以各组3只进行试验。

[0335] 5-3试验方法

[0336] 5-3-1受试物质应用方法

[0337] (1)应用量

[0338] 向左颊囊应用1mL受试物质。

[0339] (2)应用方法

[0340] 〔1〕通过气体麻醉来导入麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社制)]。

[0341] 〔2〕在维持麻醉下(适当调节浓度)，将动物固定在仰卧位，使用棉棒拉出动物的颊囊，用单手轻轻捏住被拉出的颊囊。

[0342] 〔3〕用生理盐水及棉棒将附着于颊囊粘膜的饲料等异物去除，进行清洁后使颊囊恢复原状。

[0343] 〔4〕使用1mL注射器及经口施予用探针，将1mL受试物质应用于左颊囊，在右颊囊中，将安装于1mL注射器上的空的经口施予用探针插入·拔去。

[0344] 〔5〕应用30秒后，以使得受试物质不会倒流至呼吸道内的方式使动物翻转至腹卧位并排出受试物质。使用棉棒将口腔内的多余受试物质全部除去。

[0345] 〔6〕对应用部位的颊粘膜的色调等进行观察·记录，将动物送回笼子中。

[0346] 〔7〕以1天2次(早·晚)的方式将上述操作重复28天。

[0347] 5-3-2检查及观察

[0348] (1)一般状态的观察

[0349] 关于各组的全部例，在应用期间，于试验物质的应用前及应用结束时进行一般状态观察(第1天～第28天)。另外，在应用期间结束日的第二天也进行观察(第29天)。

[0350] (2)体重测定

[0351] 各组的全部例中，在应用期间，于试验物质的应用前测定体重(第1天～第28天)。另外，在应用期间结束日的第二天也进行测定(第29天)。

[0352] (3)应用部位的肉眼观察方法

[0353] 关于各组的全部例的颊囊，在应用期间，于试验物质的应用前观察颊囊粘膜的状态，记录评分(第1天～第28天)。另外，在应用期间结束日的第二天(24±2小时)也进行观察(第29天)。观察部位为各试验物质的接触部位颊粘膜。需要说明的是，肉眼观察的评价方法中，按照上述表3(ISO 10993-10,附录B.3“表B.2用于口腔和阴茎反应的评分系统”)中记载的观察基准及评价分数，对红斑及痂皮形成的程度给出评价分数(口腔炎等级)。另外，也对看到的其他观察结果进行记录。基于得到的观察结果，各组中针对各试验物质，将各动物的粘膜的评价分数进行加和，除以观察数及动物数，求出平均值(小数点后第一位四舍五入)，作为综合评价的参考资料。

[0354] (4)病理学检查

[0355] 针对各动物，在应用期间结束日的第二天的肉眼观察结束后，在异氟醚麻醉下使其放血致死，采集左右颊囊，用10％中性缓冲福尔马林液进行固定。按照常规方法制作HE染色的标本，实施病理学检查。需要说明的是，肉眼观察的评价方法中，按照ISO 10993-10、附录B.3“表B.3用于口腔、阴茎、直肠和阴道组织反应的显微镜检查的评分系统”中记载的基准，针对上皮、白细胞浸润、血管充血及水肿的各项目，记录观察结果或等级。另外，对观察到的其他观察结果也进行记录。

[0356] (5)综合评价

[0357] 以观察期间的一般状态及体重变化为参考，基于从颊粘膜的肉眼观察结果及病理学观察结果得到的各试验物质的反应程度，综合地评价各试验物质对口腔粘膜的影响。

[0358] 5-4结果

[0359] 5-4-1一般状态

[0360] 所有动物中均未观察到异常。

[0361] 5-4-2体重

[0362] 全部组中体重经时地增加，各组间基本没有差别。

[0363] 5-4-3应用部位的肉眼观察

[0364] 将结果示于图11。全部制剂中均未观察到红斑等刺激性(评价分数0)。但是，0.3％浓度以上的OPB中，观察到白斑症状(角化过度、增厚)。另一方面，0.1％浓度的OPB中，完全未观察到异常。

[0365] 5-4-4病理组织学检查

[0366] 将结果示于图12。按照ISO 10993-10、附录B.3“表B.3用于口腔、阴茎、直肠和阴道组织反应的显微镜检查的评分系统”中记载的评价基准，通过上皮(细胞病变、化生及糜烂)、白细胞浸润、血管充血及水肿的评级，算出每个个体的炎症指数及每组的炎症指数的平均值。另外，也记录评价基准以外的观察结果。结果，0.1％OPB的各组中，未观察到炎症性反应。0.3％浓度以上的OPB各组中，观察到上皮的病变及白细胞浸润，炎症指数为1～3，均为极小的反应。作为评价基准以外的观察结果，0.1％OPB组中，一部分个体中观察到轻微～轻度的过角化，0.3％浓度以上的OPB各组中，观察到轻微～中等程度的过角化及轻微的棘细胞增生。其他对照组(右颊囊：Sham-ope侧)中观察到的表皮内微小脓肿被认为是自发性病变。

[0367] 实施例6

[0368] 6.5-FU诱发仓鼠口腔炎模型中的效力试验1

[0369] 本试验中，对5-FU诱发口腔炎模型中的OPB制剂的效力进行试验。具体而言，在5-FU诱发口腔炎模型中，对以0.1％OPB含嗽口腔内时的口腔内细菌数进行经时测定并进行口腔炎评价。

[0370] 6-1试验物质

[0371] 将受试物质与对照物质一并作为试验物质。

[0372] 6-1-1受试物质

[0373] 名称：0.1％OPB

[0374] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐             0.10w/v％

[0375]      聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)二醇   0.14w/v％

[0376]      聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇  0.10w/v％

[0377] 6-1-2对照物质

[0378] 名称：基剂

[0379] 组成：聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)二醇    0.07w/v％

[0380]      聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇   0.10w/v％

[0381] 6-2使用动物

[0382] 使用购入时6周龄的仓鼠、Slc:Syrian、雄性，以各组5只进行试验。

[0383] 6-3试验方法

[0384] 6-3-1麻醉

[0385] 实施气体麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社制)，适当调节浓度持续麻醉]。

[0386] 6-3-2制作口腔炎模型

[0387] 在麻醉下，以成为60mg/kg的方式向仓鼠的腹腔内施予5-FU。于第0天、第2天实施共计2次施予。

[0388] 于第4天，在麻醉下摘出仓鼠的颊囊。将颊囊中积存的饵料·实验动物用垫料去除，用含有生理盐水的切棉轻轻擦拭。用精密钢丝刷( Sumflex株式会社制)刷洗颊囊的表层(角质层)。刷洗后，将颊囊放回口腔内。

[0389] 6-3-3施予试验物质

[0390] 在麻醉下，将仓鼠固定于仰卧位，向单个颊囊中注入试验物质各1mL。30秒后，排出试验物质，用无菌棉棒吸取颊囊内的多余试验物质。基于该含嗽操作的施予1天进行2次。在口腔炎的障碍达到峰值后不实施施予。

[0391] 6-3-4细菌采集

[0392] 在第0天、第4天、第7天、第10天、第17天，于第一次施予试验物质前、0hr、6hr后的共计4个时间点，在麻醉下，用无菌棉棒从两颊囊内采集细菌。但是，在第10天、第17天未应用试验物质的情况下，仅采集1次。采集后的棉棒浸渍于5mL SCDLP培养基中，然后进行搅拌，作为细菌计数用样品。

[0393] 6-3-5活菌数的测定

[0394] 以新GMP微生物试验法1)、食品卫生检查指南2)为参考，实施琼脂平板倾注法。

[0395] 〔1〕采集500μL细菌计数用样品，使用4.5mL的稀释液，制作101倍～104倍的10倍稀释系列。

[0396] 〔2〕将细菌计数用样品原液及各稀释菌液各1mL注入至灭菌培养皿中。

[0397] 〔3〕将在设定为约47℃的恒温槽中保温的测定培养基(TSA+)15mL迅速地分别注入至上述的培养皿中。

[0398] 〔4〕在测定培养基固化后，将倾注平板倒置于培养箱内，于35℃进行培养，直至菌落能够计数(约2天)。

[0399] 〔5〕培养后，通过目视对在倾注平板上增殖的菌落进行计数。就菌落数过多而无法将菌落间进行区分的倾注平板而言，作为TNTC(too numerous to count)而未进行计数。

[0400] 6-3-6活菌数的计算

[0401] 将稀释倍数乘以基于6-3-5项而采用的菌落数，求出活菌数(CFU/mL)。采用的菌落数通过将小数点后第2位进行四舍五入来表示。利用下式计算活菌数(CFU/swab)。

[0402] A：采用的菌落数

[0403] 活菌数(CFU/swab)＝A×稀释倍数×样品液量(5mL)

[0404] 进而，利用下式，由活菌数的对数值求出对数下降值(Log Reduction)。对数下降值通过将小数点后第3位进行四舍五入来表示。活菌数1以下的对数值为0。

[0405] B：基线的活菌数对数值

[0406] C：涂布试验物质后的活菌数对数值

[0407] 对数下降值＝B-C

[0408] 6-3-7统计学分析

[0409] 求出各组的活菌数(CFU/swab)和其对数值的平均值及标准偏差。活菌数通过将小数点后第1位进行四舍五入而以整数表示。活菌数的对数值通过将小数点后第3位进行四舍五入而表示。需要说明的是，活菌数为0时，活菌数的对数值为0。另外，由于是探索试验，因此未进行检验。

[0410] 6-3-8口腔炎评价

[0411] 基于以下的表4，评价口腔炎等级。

[0412] [表4]

[0413]等级 状态
0 没有红斑、血管扩张
1 红斑及血管扩张
2 伴随浅表性粘膜糜烂的严重红斑
3 形成粘膜溃疡(25％)
4 形成粘膜溃疡(50％)
5 形成粘膜溃疡(100％)

[0414] 6-4结果

[0415] 6-4-1细菌数

[0416] 将结果示于表5及图13。在第0天、第4天、第10天，0.1％OPB组中，施予后的细菌数减少是显著的，但在口腔炎重症化显著的第7天，细菌数减少值为微量。

[0417] [表5]

[0418] 仓鼠口腔中的活菌数

[0419]

[0420] 6-4-2口腔炎等级

[0421] 将结果示于图14。0.1％OPB组中，口腔炎等级显著低。

[0422] 本试验中，作为0.1％OPB组的第7天的细菌数减少值低的原因，被认为是细菌采集方法或渗出液过多所导致的杀菌活性降低。本试验中，表明施予0.1％OPB并将口腔内保持清洁时，可减轻口腔炎重症化。

[0423] 实施例7

[0424] 7.5-FU诱发仓鼠口腔炎模型中的效力试验2

[0425] 本试验中，在5-FU诱发仓鼠口腔炎模型中对0.1％奥兰西丁葡萄糖酸盐与0.1％CHG的口腔炎减轻效果进行比较研究。

[0426] 7-1试验物质

[0427] 将受试物质与对照物质一并作为试验物质。

[0428] 7-1-1受试物质1

[0429] 名称：0.1％OPB

[0430] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐    0.10w/v％

[0431]      Pluronic L-44         0.07w/v％

[0432] 7-1-2受试物质2

[0433] 名称：Peridex(注册商标)/0.1％CHG

[0434] 制造商：3M ESPE Dental  Products

[0435] 组成：氯已定葡萄糖酸盐  0.12w/v％

[0436] 7-1-3对照物质

[0437] 名称：基剂

[0438] 组成：聚氧乙烯(20)聚氧丙烯(20)二醇     0.07w/v％

[0439] 7-2使用的细菌

[0440] 本试验中，使用作为口腔内的常驻菌的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC编号：6538，Microbiologics,Inc.公司制)。

[0441] 7-3使用的动物

[0442] 使用购入时6周龄的仓鼠、Slc:Syrian、雄性，以各组5只进行试验。

[0443] 7-4试验方法

[0444] 7-4-1试验菌液的制备

[0445] 〔1〕将放入有保存的细菌球团(bacteria pellet)的小瓶取出，恢复至室温。

[0446] 〔2〕从小瓶中取出1个细菌球团，转移至无菌管。

[0447] 〔3〕加入0.5mL的生理盐水。

[0448] 〔4〕用无菌棉棒将细菌球团捣碎，并制成细菌混悬液。

[0449] 〔5〕在TSA平板上，用无菌棉棒将细菌混悬液接种至直径约2cm的圆形区域，使用白金环从接种区域进行划线接种。

[0450] 〔6〕将经划线接种的TSA平板倒置，进行培养，直至形成菌落。

[0451] 〔7〕从形成的菌落中选择单一的菌落，用白金丝进行采集，刺入酪蛋白胨(casitone)培养基中。

[0452] 〔8〕对经刺入的酪蛋白胨培养基进行培养，直至可确认到细菌的增殖。

[0453] 〔9〕确认细菌的增殖后，进行冷藏保存(设定值2～8℃)。

[0454] 〔10〕用白金丝采集利用酪蛋白胨培养基进行了冷藏保存的试验菌的一部分，并转移至放入有5mL MHB培养基的14mL无菌管中，进行静置培养，直至细菌增殖。

[0455] 〔11〕培养后，用无菌片采集10μL培养液，再次转移至放入有5mL MHB培养基的14mL无菌管中，进行静置培养，直至细菌增殖。

[0456] 〔12〕培养后，将约5mL的利用MHB培养基进行了继代培养的试验菌培养液回收至15mL圆锥瓶中，添加8mL生理盐水，然后缓缓地进行搅拌。

[0457] 〔13〕以3000rpm，于23℃离心(冷却离心机5800，转子RS-720，株式会社久保田制作所制)10分钟，弃去上清液。

[0458] 〔14〕向沉淀的试验菌中添加1mL蒸馏水(大塚蒸馏水，株式会社大塚制药工场制)，使其悬浮。

[0459] 〔15〕将细菌混悬液转移至14mL无菌管中，使用McFarland Standard(产品编号70900，Sysmex biomerieux株式会社制)来判定浊度。添加生理盐水，调节菌液浓度，以成为McFarland 5。

[0460] 〔16〕将成为McFarland 5的细菌混悬液作为试验菌液。

[0461] 7-4-2麻醉

[0462] 实施气体麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社)，适当调节浓度持续麻醉]。

[0463] 7-4-3制作口腔炎模型

[0464] 在麻醉下，以成为60mg/kg的方式向仓鼠的腹腔内施予5-FU。于第0天、第2天进行共计2次施予。于第4天，在麻醉下，摘出仓鼠的颊囊。将颊囊中积存的饵料·实验动物用垫料去除，用含有生理盐水的切棉轻轻擦拭。用精密钢丝刷( Sumflex株式会社制)刷洗颊囊的表层(角质层)。刷洗后，将颊囊放回口腔内。

[0465] 7-4-4施予试验物质

[0466] 在麻醉下，用棉棒向仓鼠颊囊1天涂布2次(从分组日起4天)。其中，第4天时仅在上午施予1次。

[0467] 7-4-5涂布试验菌液

[0468] 在麻醉下，在上午施予试验物质之前，用白金环将7-4-1中制备的试验菌液向仓鼠颊囊1天涂布1次(从分组日起5天)。

[0469] 7-4-6口腔炎评价

[0470] 基于上述表4，评价口腔炎等级。

[0471] 7-4-7统计学分析

[0472] 求出各组的等级的平均值及标准偏差，仅以平均值制作图表。由于是探索性分析，因此未进行检验。

[0473] 7-5结果

[0474] 将结果示于图15。0.1％OPB组与基剂及0.1％CHG组相比，有减轻口腔炎重症化的倾向。基剂组与0.1％CHG组为基本相同的等级，没有差别。由口腔炎的重症化减轻效果来看，认为与0.1％CHG相比，0.1％OPB对涂布的细菌或颊囊粘膜的常驻菌的杀菌效力更优异。

[0475] 实施例8

[0476] 8.因并用5-FU·放射线照射而诱发的仓鼠口腔炎模型中的效力试验

[0477] 本试验中，在因并用5-FU·放射线照射而诱发的仓鼠口腔炎模型中，利用含嗽法应用将Pluronic P-123作为基剂的0.1％OPB制剂，对口腔炎减轻效果进行比较研究。

[0478] 8-1试验物质

[0479] 将受试物质和对照物质一并作为试验物质。

[0480] 8-1-1受试物质

[0481] 名称：OPB

[0482] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐        0.10w/v％

[0483]      Pluronic L-44             0.07w/v％

[0484]      Pluronic P-123            1.0w/v％

[0485] 8-1-2对照物质

[0486] 名称/简称：基剂/Base

[0487] 组成：Pluronic L-44           0.07w/v％

[0488]      Pluronic P-123          1.0w/v％

[0489] 8-2使用动物

[0490] 使用购入时6周龄的仓鼠、Slc:Syrian、雄性，以各组8只进行试验。

[0491] 8-3试验方法

[0492] 8-3-1麻醉

[0493] (1)照射放射线时

[0494] 将Somnopentyl(注册商标)(共立制药株式会社制)以成为40mg/kg的方式向腹腔内施予。

[0495] (2)口腔炎评价及试验物质施予时

[0496] 实施气体麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社制)，适当调节浓度持续麻醉]。

[0497] 8-3-2制作口腔炎模型

[0498] (1)照射放射线

[0499] 于第0天，在麻醉下，用棉棒摘出仓鼠的颊囊。将颊囊中积存的饵料·实验动物用垫料去除，用含有生理盐水的切棉轻轻擦拭。将身体、颊囊一同固定于成型的亚克力板上，将作为照射部位的颊囊以外的部分用铅覆盖，在[搁板距离：12.5cm，管电压：160kV，管电流：6.2mA]的条件下照射(40Gy)放射线。其中，照射以下述方式进行分配：1个个体为一个颊囊，各组左颊囊和右颊囊各成为4只。

[0500] (2)施予5-FU

[0501] 于第0天、第5天、第10天共计3次，将5-FU以成为60mg/kg的方式向仓鼠的腹腔内施予。

[0502] 8-4-3施予试验物质

[0503] 在麻醉下，将仓鼠固定在仰卧位，向单个颊囊注入试验物质各1mL。30秒后，排出试验物质，用无菌棉棒吸取颊囊内的多余试验物质。基于该含嗽操作的施予1天进行2次。在口腔炎的障碍达到峰值后不实施施予。

[0504] 8-4-4口腔炎评价

[0505] 基于上述表4，评价口腔炎等级。

[0506] 8-4-5统计学分析

[0507] 求出各组的口腔炎等级的平均值及标准偏差，制作图表。由于是探索性分析，因此未进行检验。

[0508] 8-5结果

[0509] 将结果示于图16。就口腔炎等级的最大值而言，基剂组为4.9，OPB组为4.3，此外，就上升速度而言，也是基剂组更快。也有模型的强度强的影响，有即使于第40天溃疡也未治好的个体，因此并未完全地治愈全部例，但OPB组明显治愈更快。

[0510] 实施例9

[0511] 9.大鼠牙龈炎模型中的效力试验

[0512] 本试验中，在大鼠牙龈炎模型中，研究0.1％奥兰西丁葡萄糖酸盐对牙龈炎的治疗效果。

[0513] 9-1试验物质

[0514] 将受试物质与对照物质一并作为试验物质。

[0515] 9-1-1受试物质

[0516] 名称：OPB

[0517] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐     0.10w/v％

[0518]      Pluronic L-44          0.07w/v％

[0519]      Pluronic P-123         1.0w/v％

[0520] 9-1-2对照物质

[0521] 名称/简称：基剂/Base

[0522] 组成：Pluronic L-44            0.07w/v％

[0523]      Pluronic P-123           1.0w/v％

[0524] 9-2使用的细菌

[0525] 本试验中，使用作为引起牙龈炎的细菌的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，ATCC编号：33277，Microbiologics,Inc.公司制)。

[0526] 9-3使用的动物

[0527] 使用购入时5周龄的大鼠、Jcl:Wistar、雄性，以各组5只进行试验。

[0528] 9-4试验方法

[0529] 9-4-1试验菌的制备(除保存以外的所有操作均在厌氧室内进行)

[0530] 〔1〕将放入有保存的细菌球团的小瓶取出，放入厌氧室中。

[0531] 〔2〕从小瓶中取出1个细菌球团，转移至无菌管。

[0532] 〔3〕加入0.5mL的制备TSB培养基。

[0533] 〔4〕用无菌棉棒将细菌球团捣碎，并制成细菌混悬液。

[0534] 〔5〕将细菌混悬液接种至CDC厌氧性菌用羊血液琼脂培养基。

[0535] 〔6〕在厌氧条件下(37℃)培养3～4天。

[0536] 〔7〕从形成的菌落中选择单一的菌落，再次同样地接种至CDC厌氧性菌用羊血液琼脂培养基。

[0537] 〔8〕确认细菌的增殖后，添加3mL的制备TSB培养基，用散布机使其悬浮，制作甘油保存菌。

[0538] 〔9〕对上述保存菌进行冷冻保存。

[0539] 〔10〕从保存菌接种至CDC厌氧性菌用羊血液琼脂培养基，在厌氧条件下进行培养。

[0540] 〔11〕确认菌的增殖后，在适量的制备TSB培养基中悬浮，取出一部分，用McFarland Standard使浊度为McFarland5。计算稀释倍率，从残留的混悬液，以成为1×1010CFU/mL的方式调节菌液浓度。

[0541] 〔12〕将上述菌液作为试验菌液。

[0542] 9-4-2麻醉

[0543] (1)插入棉丝、剖检时

[0544] 将戊巴比妥钠水溶液以40mg/kg的量施予至腹腔内。

[0545] (2)接种细菌、施予试验物质

[0546] 实施气体麻醉[导入麻醉：以1.0L/min的空气导入5％异氟醚(迈兰制药株式会社)，适当调节浓度持续麻醉]。

[0547] 9-4-3插入棉丝

[0548] 麻醉后，以背位固定于专用台，抬起下额，在上颚右第一臼齿与第二臼齿之间插入棉丝。

[0549] 9-4-4细菌接种

[0550] 麻醉后，将0.2mL试验菌液接种至棉丝插入部位。该操作每2小时实施一次。

[0551] 9-4-5施予试验物质

[0552] 麻醉后，将1mL试验物质以清洗方式施予至口腔内。该操作1天进行2次。

[0553] 9-4-6观察及检查

[0554] (1)一般状态

[0555] 从棉丝插入日起直至剖检日为止，每天实施1次。

[0556] (2)体重测定

[0557] 从棉丝插入日至剖检时为止，实施共计2次。

[0558] (3)剖检

[0559] 在麻醉下，切断腹大动脉，使其放血死亡，进行剖检。

[0560] (4)病理组织学检查

[0561] 将摘出的上颚用10v/v％中性缓冲福尔马林液固定，进行脱脂、脱灰后，制作HE染色标本。针对各标本，就炎症性变化进行病理检查。

[0562] 9-4-7统计学分析

[0563] 算出各组的体重的平均值及标准偏差。未进行检验。

[0564] 9-5结果

[0565] 一般状态方面未观察到异常，体重方面各组间没有差别。

[0566] 将病理学检查结果示于图17。另外，将HE染色标本的显微镜照片示于图18。

[0567] OPB施予组中，牙龈的复层扁平上皮中的嗜中性粒细胞的浸润为8/10例、细胞间水肿为1/10例及溃疡为1/10例，均是轻微地被观察到。牙龈的固有层中的嗜中性粒细胞的浸润为8/10例及出血为1/10例，均是轻微地被观察到。另一方面，基剂施予组中，关于牙龈的复层扁平上皮中的嗜中性粒细胞的浸润，确认到轻微为8/10例及轻度为2/10例。细胞间水肿为2/10例，过角化为2/10例，表皮增厚为2/10例及溃疡为1/10例，均是轻微地被观察到。关于牙龈的固有层中的嗜中性粒细胞的浸润，确认到轻微为6/10例及轻度为3/10例。出血及水肿均为1/10例，轻微地被观察到。

[0568] 9-6考察

[0569] 牙龈的复层扁平上皮中的嗜中性粒细胞的浸润、细胞间水肿、过角化、表皮增厚及固有层中的嗜中性粒细胞的浸润及水肿均为与炎症相关联的变化，被认为因处置而产生。就这些变化而言，有与基剂施予组相比OPB施予组中的频率及程度均低的倾向，因此观察到由施予OPB带来的炎症减轻效果。

[0570] 实施例10

[0571] 10.大鼠肺炎模型中的效力试验

[0572] 本试验中，在大鼠的吸入性肺炎模型中，研究了0.1％奥兰西丁葡萄糖酸盐对肺炎的治疗效果。

[0573] 10-1试验物质

[0574] 将受试物质与对照物质一并作为试验物质。

[0575] 10-1-1受试物质

[0576] 名称：OPB

[0577] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐       0.10w/v％

[0578]      Pluronic L-44            0.07w/v％

[0579]      Pluronic P-123           1.0w/v％

[0580] 10-1-2对照物质

[0581] 名称/简称：基剂/Base

[0582] 组成：Pluronic L-44            0.07w/v％

[0583]      Pluronic P-123           1.0w/v％

[0584] 10-2使用动物

[0585] 使用购入时7周龄的大鼠、Crl:CD(SD)、雄性，进行试验。

[0586] 10-3组构成

[0587] 在气管内施予日的早上测定体重，利用分层随机分配法，分配至以下的表6所示的4组(1～4组)。利用分层随机分配法将未分配的6只分配至以下的表6所示的2组(5、6组)中，作为唾液采集用个体。

[0588] [表6]

[0589]

[0590] BALF回收用个体

[0591]

[0592] 唾液采集用个体

[0593] 10-4试验方法

[0594] 10-4-1麻醉

[0595] (1)口腔内清洗、唾液采集

[0596] 将Somnopentyl以成为40mg/kg的方式施予至腹腔内。

[0597] (2)气管内施予时、支气管肺泡清洗液(BALF)采集时

[0598] 实施气体麻醉[导入麻醉：3.0L/min的空气中导入3％异氟醚(迈兰制药株式会社)，适当调节浓度持续麻醉]。

[0599] 10-4-2口腔内清洗

[0600] 在麻醉下，使试验物质含浸于无菌棉棒中，以充分量涂布于口腔内。

[0601] 10-4-3唾液采集

[0602] 在麻醉下，腹腔内施予0.1％盐酸毛果芸香碱(5mg/kg)。将过量分泌的唾液回收。回收的唾液添加至加有中和剂的营养培养基中，进行静置。然后，进行离心(r.t.，3000rpm，
10min)，用相同量的生理盐水使沉渣悬浮，作为气管内施予液。

[0603] 10-4-4气管内施予

[0604] 采集唾液后，在麻醉下，用喉镜将施予用管留置在气管内，施予0.1mL唾液或生理盐水。

[0605] 10-4-5BALF采集

[0606] 气管内施予6、24小时后，在麻醉下进行正中切开，通过切开腹大动脉来进行放血，使其安乐死。然后，使肺露出，向支气管起始部插入导管。从该管线，用含有0.1％BSA、0.05mM EDTA-2Na的PBS溶液(以下，记为PBS)8mL清洗3次(各次重复注入回收2次)，采集清洗液(BALF)。对BALF进行离心(200g，4℃，10min)，上清液分取于另一保存管中，用于LDH浓度测定、细胞因子类测定(ELISA)。用1mL PBS使沉渣悬浮，用于血液学检查。

[0607] 10-4-6唾液采集用动物的处理

[0608] 在气管内施予结束后，唾液采集用的动物在过度麻醉下放血，使其安乐死。

[0609] 10-4-7细胞因子(TNF-α、IL-6)浓度测定

[0610] 按照试剂盒附带的附件进行测定。

[0611] 10-4-8血液学检查

[0612] 针对悬浮的沉渣，使用多项目自动血球计数装置实施血液学分析。

[0613] 10-4-9生化检查

[0614] 针对采集的BALF上清液，使用自动分析装置7180(株式会社日立高科技)测定LDH浓度。

[0615] 10-4-10统计学分析

[0616] 由于是探索性分析，因此未进行检验。

[0617] 10-5结果

[0618] 将血液学检查及生化检查的结果示于图19。

[0619] 从血液学检查来看，两组间没有差别。关于IL-6，在24小时值方面，OPB组中成为低约2.5倍的值。关于TNF-α，在两个时间点，OPB组均成为低的值。

[0620] 因此，表明就利用OPB处理口腔内的情况而言，由误咽唾液带来的肺中的炎症性反应更弱。

[0621] 实施例11

[0622] 11.奥兰西丁的使用了TLR报告细胞系(TLR Reporter Cell Line)的抗炎作用的研究

[0623] 由实施例6～10显示，奥兰西丁对口腔炎、牙龈炎、肺炎具有抗炎作用。已知炎症与介由Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR-4)、Toll样受体2(Toll-like receptor2，TLR-2)(为识别LPS、LTA的受体)的免疫应答有关(ChemMedChem.2016Jan 19；11(2):154-65、Biotechnol Adv.2012Jan-Feb；30(1):251-60、J Dent Res.2016Jul；95(7):725-33)。

[0624] 奥兰西丁有可能通过对TLR-4及TLR-2的拮抗(样)作用来抑制炎症。因此，本试验中，为了弄清楚这一点，通过使用了稳定表达TLR-4、TLR-2、报告基因(SEAP)的来自人的细胞的报告分析，确认奥兰西丁对TLR-4及TLR-2的拮抗(样)作用。

[0625] 11-1受试物质

[0626] 名称：1.5％OPB

[0627] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐        1.5w/v％

[0628] 11-2细胞

[0629] 使用以下的表7中记载的细胞。

[0630] [表7]

[0631]

[0632] *根据需要添加。

[0633] 选择试剂

[0634] 11-3试验方法

[0635] 11-3-1奥兰西丁对TLR-4的拮抗(样)作用的研究

[0636] -使用的细胞：HEK293-TLR4表达细胞

[0637] -使用的培养基

[0638] 预培养：DMEM+FBS(最终浓度10％)+青霉素(最终浓度100unit/mL)+链霉素(最终浓度100μg/mL)

[0639] 施予样品，施予后培养：DMEM+FBS(最终浓度5％)

[0640] -活性测定：SEAP检测试剂盒(Novus Biologicals公司制)

[0641] -蛋白量定量：BCA蛋白质检测(Funakoshi株式会社制)

[0642] 〔1〕以成为1.0×105个细胞/孔/100μL的方式用10％FBS DMEM对细胞进行调节，散布于96孔板(胶原处理)，培养40h(37℃、5％CO2)，。

[0643] 〔2〕使用5％FBS来稀释1.5％OPB，使其成为以下的表8所示的浓度。

[0644] [表8]

[0645]  OPB浓度(μg/mL)
制备浓度 20，10，5，2
最终浓度 10，5，2.5，1

[0646] 〔3〕使用5％FBS制备20ng/mL(最终浓度10ng/mL)的LPS。

[0647] 〔4〕除去培养基后，以OPB培养基50μL、LPS培养基50μL的顺序加入培养基，培养8h(37℃，5％CO2)。

[0648] 〔5〕培养后，将上清液50μL转移至另一96孔板，进行SEAP检测。

[0649] 〔6〕向除去了剩余上清液的96孔板中加入0.1％SDS-0.1N NaOH50μL，彻夜冷冻(-20℃)。解冻后，进行BCA蛋白质检测。

[0650] 〔7〕以蛋白质浓度修正作为报告基因的SEAP的表达量，算出OPB单位浓度的抑制率。

[0651] 11-3-2奥兰西丁对TLR-2的拮抗(样)作用的研究

[0652] -使用的细胞：HEK293-TLR2表达细胞

[0653] -使用的培养基

[0654] 预培养：DMEM+FBS(最终浓度10％)+青霉素(最终浓度100unit/mL)+链霉素(最终浓度100μg/mL)

[0655] 施予样品，施予后培养：DMEM+FBS(最终浓度1％)

[0656] -活性测定：SEAP检测试剂盒(Novus Biologicals公司制)

[0657] -蛋白量定量：BCA蛋白质检测(Funakoshi株式会社制)

[0658] 〔1〕以成为1.0×105个细胞/孔/100μL的方式用10％FBS DMEM对细胞进行调节，散布于96孔板(胶原处理)，培养36h(37℃，5％CO2)，。

[0659] 〔2〕使用1％FBS来稀释1.5％OPB，使其成为上述表8所示的浓度。

[0660] 〔3〕使用1％FBS制备2μg/mL(最终浓度1μg/mL)的LTA。

[0661] 〔4〕除去培养基后，以OPB培养基50μL、LTA培养基50μL的顺序加入培养基，培养12h(37℃，5％CO2)。

[0662] 〔5〕培养后，将上清液50μL转移至另一96孔板，进行SEAP检测。

[0663] 〔6〕向除去了剩余上清液的96孔板中加入0.1％SDS-0.1N NaOH50μL，彻夜冷冻(-20℃)。解冻后，进行BCA蛋白质检测。

[0664] 〔7〕以蛋白质浓度修正作为报告基因的SEAP的表达量，算出OPB单位浓度的抑制率。

[0665] 11-4结果

[0666] 将结果示于图20。

[0667] 明确了随着OPB浓度上升，SEAP的抑制率升高(IC50：约10μg/mL)，OPB显示出对TLR4、TLR2的拮抗(样)作用。由该结果表明，OPB通过阻碍介由TLR4、TLR2的免疫应答，从而具有抗炎作用。

[0668] 实施例12

[0669] 12.使用了小鼠巨噬细胞样细胞株RAW264.7的奥兰西丁的抗炎作用的研究

[0670] 用LPS、LTA刺激小鼠巨噬细胞样细胞株RAW264.7时，介由识别它们的受体而启动免疫应答，进行作为炎症性介质(Mediator)的NO的产生。因此，将来自RAW264.7细胞的NO的产生作为指标来确认奥兰西丁是否具有对因LPS刺激而导致的炎症的抗炎作用。

[0671] 12-1受试物质

[0672] 名称：1.5％OPB

[0673] 组成：奥兰西丁葡萄糖酸盐     1.5w/v％

[0674] 12-2细胞

[0675] 使用以下的表9中记载的细胞。

[0676] [表9]

[0677]

[0678] *根据需要添加。

[0679] 12-3试验方法

[0680] 12-3-1奥兰西丁对LPS刺激的抗炎作用的研究

[0681] -使用的细胞：RAW264.7

[0682] -使用的培养基

[0683] 预培养：DMEM+FBS(最终浓度10％)+青霉素(最终浓度100unit/mL)+链霉素(最终浓度100μg/mL)

[0684] 施予样品，施予后培养：DMEM+FBS(最终浓度5％)-活性测定：硝酸盐/亚硝酸盐比色检测试剂盒(Griess Reagents公司制)

[0685] -蛋白量定量：难以对细胞进行染色，值变得不稳定，因此未测定。

[0686] 〔1〕以成为1.0×105个细胞/孔/100μL的方式用10％FBS DMEM对细胞进行调节，散布于96孔板(未处理)，培养24h(37℃，5％CO2)。

[0687] 〔2〕使用5％FBS来稀释1.5％OPB，使其成为上述表8所示的浓度。

[0688] 〔3〕使用5％FBS制备200ng/mL(最终浓度100ng/mL)的LPS。

[0689] 〔4〕除去培养基后，以OPB培养基50μL、LPS培养基50μL的顺序加入培养基，培养8h(37℃，5％CO 2)。

[0690] 〔5〕培养后，将上清液50μL转移至另一96孔板，进行硝酸盐/亚硝酸盐比色检测。

[0691] 12-3-2奥兰西丁对大肠杆菌(LPS产生菌)刺激的抗炎作用的研究

[0692] -使用的细胞：RAW264.7

[0693] -使用的培养基

[0694] 预培养：DMEM+FBS(最终浓度10％)+青霉素(最终浓度100unit/mL)+链霉素(最终浓度100μg/mL)

[0695] 施予样品，施予后培养：DMEM+FBS(最终浓度1％)

[0696] -活性测定：硝酸盐/亚硝酸盐比色检测试剂盒(Griess Reagents公司制)

[0697] -蛋白量定量：难以将细胞染色，值不稳定，因此未测定。

[0698] 〔1〕以成为1.0×105个细胞/孔/100μL的方式用10％FBS DMEM对细胞进行调节，散布于96孔板(未处理)，培养24h(37℃，5％CO2)。

[0699] 〔2〕使用1％FBS，以成为上述表8所示的浓度的方式制备1.5％OPB。

[0700] 〔3〕除去培养基后，加入OPB培养基50μL，于37℃，在5％CO2中静置。

[0701] 〔4〕将用MHB培养了一晚的大肠杆菌制备为McF 1，用5％DMEM稀释300倍。进而，以最终浓度成为50μg/mL的方式添加安西比林(Ampicillin)。

[0702] 〔5〕进而，将制备的细菌培养基50μL加入至添加有OPB培养基的平板，密闭培养24h(37℃，5％CO2)。

[0703] 〔6〕培养后，将上清液50μL转移至另一96孔板，进行硝酸盐/亚硝酸盐比色检测。

[0704] 12-4结果

[0705] 将结果示于图21。

[0706] 明确了随着OPB浓度上升，NO的产生减少，OPB对NO的产生显示出阻碍作用(IC50：约10μg/mL)。由该结果表明OPB具有抗炎作用。

[0707] 产业上的可利用性

[0708] 根据本发明，可提供能够应用于广泛的炎症性疾病的、用于改善及/或预防炎症的组合物。另外，通过将本发明的组合物用作用于改善及/或预防因癌症的治疗而导致的口腔粘膜炎的组合物，从而能够防止接受了化学疗法、放射线治疗的患者的沟通功能障碍、睡眠障碍、疼痛、吞咽障碍(食物摄取量的减少)等QOL的降低、并能够防止对化学疗法、放射线治疗的剂量遵守的妨碍，因此产业上的有用性高。