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硅基探针材料、硅基探针及其制备方法和应用无效专利 发明

技术领域

[0001] 本发明涉及生物材料技术领域,具体而言,涉及一种硅基探针材料、硅基探针及其制备方法和应用。

相关背景技术

[0002] 微小RNA(microRNA,miRNA)是一类广泛存在于真核生物、长度为21-25nt的非蛋白质编码小RNA,它们能以序列特异性方式调节基因表达,在发育、凋亡、代谢以及人类疾病方面都起着不容忽视的作用。miRNA的生理病理调控机制是近几年来受到高度重视的一门新型学科。
[0003] 以心血管疾病为例,心血管疾病是导致人类死亡的第一杀手,主要有冠心病、高血压、风湿性心脏病、心肌炎等,在这些疾病发生发展过程中均会发生心肌损伤,心肌损伤是心室结构重塑、心律失常、心力衰竭、心源性猝死的发病基础。如何有效诊断和预防心肌损伤、心肌梗死是目前医学和生物学研究亟待解决的问题。近年来的研究表明,心血管疾病会导致体内特殊的微小RNA的表达量发生明显的变化,因此,通过检测体液中的特定微小RNA的变化即可起到诊断、预防心血管疾病的作用。目前比较常用的用来统计微小RNA变化的手段是借助于实时定量PCR的技术。虽然实时定量PCR技术拥有许多的优点,但是也存在了诸如易受样本中干扰剂的影响、RNA提取过程中会有一定量的人为损失、检测时间长等缺点。
[0004] 因此,开发一种体液原位检测的技术,达到快速、高效、准确的检测目的尤为重要。
[0005] 有鉴于此,特提出本发明。

具体实施方式

[0073] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[0074] 本发明中,除非有其他说明,数值范围“a~b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示,其中a和b都是实数。例如数值范围“6~22”表示本文中已经全部列出了“6~22”之间的全部实数,“6~22”只是这些数值组合的缩略表示。
[0075] 除非另有说明,本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
[0076] 一种硅基探针材料的制备方法,包括以下步骤:
[0077] a)十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基氯化铵进行羟基化处理得到羟基化硅球;
[0078] b)羟基化硅球进行氨基化处理得到氨基化硅球;
[0079] c)氨基化硅球进行羰基化处理得到羰基化硅球;
[0080] d)羰基化硅球引入PEG得到硅基探针材料。
[0081] 该制备方法提供了一种全新的体液原位检测用材料,该硅基探针材料的制备方法,简单、重现性好、得到的材料稳定均一。
[0082] 在优选地实施方式中,1)中的羟基化包括:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或十六烷基氯化铵,与正硅酸乙酯(TEOS)在75-85℃温度下反应,得到羟基化硅球。反应温度典型但非限制性的为75℃、77℃、79℃、80℃、82℃、84℃或85℃。
[0083] 在优选地实施方式中,十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基氯化铵,与正硅酸乙酯的反应摩尔比为1:(7-9)。该摩尔比范围内原料反应速率高,原料转化率较高,避免原料的浪费。摩尔比限定但非限制性的为1:7、1:7.5、1:8、1:8.5或1:9。
[0084] 在优选地实施方式中,十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基氯化铵,与正硅酸乙酯的反应时间为1.5-2.5小时,反应中优选采用搅拌的方式实现十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基氯化铵,与正硅酸乙酯充分接触与反应。
[0085] 在优选地实施方式中,十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基氯化铵,与正硅酸乙酯反应后还依次包括固液分离、洗涤和冻干的步骤。利用固液分离、洗涤和冻干对羟基化硅球进行纯化,去除未反应的物质,有利于后续反应的进行,避免影响制备效率。
[0086] 在优选地实施方式中,洗涤依次包括纯水洗涤和无水乙醇洗涤。采用纯水洗涤和无水乙醇洗涤,有利于提高效率,方便后续的冻干。
[0087] 在优选地实施方式中,步骤2)中氨基化包括:羟基化硅球与3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液反应,得到氨基化硅球。
[0088] 在优选地实施方式中,3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液的浓度为4-6%(v/v),APTES的浓度为体积浓度百分比,溶剂采用低碳醇,优选为甲醇、乙醇或丙醇。
[0089] 在优选地实施方式中,反应的时间为1.5-2.5小时。为氨基化提供足够的反应时间。
[0090] 在优选地实施方式中,反应后还包括洗涤和干燥的步骤,其中,洗涤优选为乙醇洗涤,干燥优选为100-120℃条件下干燥10-14h。干燥温度典型但非限制性的为100℃、105℃、110℃、115℃或120℃;干燥时间典型但非限制性的为10h、11h、12h、13h或14h。乙醇有利于去除未反应的原料,同时有利于干燥快速去除溶剂。
[0091] 在优选地实施方式中,步骤3)中羰基化包括:氨基化硅球与戊二醛溶液在还原剂存在条件下反应,得到羰基化硅球。
[0092] 在优选地实施方式中,戊二醛溶液的浓度为3-5%(v/v),戊二醛的浓度为体积浓度百分比,溶剂采用PBS、TBS或醋酸盐缓冲液,优选为PBS,还原剂为45-55mmol/L氰基硼氢化钠。戊二醛溶液的浓度典型但非限制性的为3%、4%或5%;还原剂氰基硼氢化钠浓度典型但非限制性的为45mmol/L、47mmol/L、49mmol/L、50mmol/L、52mmol/L、54mmol/L或55mmol/L。
[0093] 在优选地实施方式中,反应的时间为1.5-2.5小时。为羰基化提供足够的反应时间。
[0094] 在优选地实施方式中,反应后还包括洗涤的步骤,优选为PBS洗涤。PBS可以更好的溶解并去除戊二醛,有利于羟基化硅球的纯化。
[0095] 在优选地实施方式中,步骤4)引入PEG(聚乙二醇)包括:羰基化硅球与氨基聚乙二醇羧基(羧基-PEG-胺)溶液在还原剂条件下反应,得到硅基探针材料。
[0096] 在优选地实施方式中,氨基聚乙二醇羧基溶液的浓度为450-550mmol/L,溶剂优选为PBS,还原剂优选为45-55mmol/L氰基硼氢化钠。氨基聚乙二醇羧基溶液的浓度典型但非限制性的为450mmol/L、470mmol/L、490mmol/L、500mmol/L、520mmol/L、540mmol/L或550mmol/L;还原剂氰基硼氢化钠浓度典型但非限制性的为45mmol/L、47mmol/L、49mmol/L、
50mmol/L、52mmol/L、54mmol/L或55mmol/L。
[0097] 在优选地实施方式中,反应的时间为10-14小时。
[0098] 在优选地实施方式中,反应后还包括洗涤和冻干的步骤,其中洗涤依次包括PBS洗涤和纯水洗涤。
[0099] 本发明提供硅基探针材料制备方法制备得到的硅基探针材料。该硅基探针材料成本低,成分均一,与适配子的结合性能好,为体液原位检测领域的新材料。
[0100] 一种硅基探针,其中,包括上述硅基探针材料和修饰于硅基探针材料表面的适配子。可以理解的是,通过采用不同的适配子,制备的硅基探针可以应用于各种目标微小RNA特异性的定量检测,并且实现体液原位检测。
[0101] 硅基探针为生物分子,发光稳定、毒性小、与目标微小RNA接触后会发生显著的光学性质变化。采用生物分子作为原料,避免了反应会造成的污染或产物的毒性,并且具有生物相容性好、毒性小、检测简便快捷的优点。硅基探针对待检测样本的要求更低,简化了操作流程,直接将硅基探针与待检测的体液样品混合,采用全功能微孔板检测仪,一次可以实现多达96个样品的高通量检测,同时将检测结果数据化,实现快速、高效、准确检测的目的。同时,硅基探针用于检测微小RNA还具有成本低、操作方便、对RNA的损伤小和受外界条件约束少等优点。
[0102] 适配子为与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。这种寡核苷酸序列形成的高级结构具有能识别与之相对应的任何类型的蛋白和低分子的靶物质的功能,并与靶物质有高亲和力而形成靶物质-适配子的复合物。
[0103] 在优选地实施方式中,适配子序列包括如下a)-c)中的任意一种:
[0104] (a)HPN CP-19-3:
[0105] 5’-TTTTTCCGCGCTCAGTTTTGCATAGATTTGCACATTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.1);
[0106] (b)HPN CP-134-5:
[0107] 5’-TTTTTCCGCGCCCCCTCTGGTCAACCAGTCACATTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.2);
[0108] (c)HPN CP-186-5:
[0109] 5’-TTTTTCCGCGCAGCCCAAAAGGAGAATTCTTTGTTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.3)。
[0110] 上述适配子的目标微小RNA与心脏疾病相关,所以该硅基探针可以有效特异性结合检测目标RNA,实现体液原位检测。
[0111] 本发明提供一种硅基探针的制备方法,将氨基化的硅基探针材料与适配子混合反应,得到硅基探针。该方法简单易操作,得到的硅基探针性能好。
[0112] 在优选地实施方式中,氨基化的硅基探针材料与适配子的混合反应时间为10-14h。
[0113] 在优选地实施方式中,硅基探针材料的氨基化包括:将硅基探针材料与交联溶液反应,得到氨基化的硅基探针材料,交联溶液中交联剂包括EDC和Sulfo-NHS。对硅基探针材料进行氨基化的特殊修饰处理,有利于适配子的修饰连接,同时提高硅基探针的特异性和专一性。
[0114] 在优选地实施方式中,交联溶液的溶剂为MES溶液,EDC(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)浓度优选为4-6mmol/L,Sulfo-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐)浓度优选为4-6mmol/L。
[0115] 本发明最后提供硅基探针在制备诊断和/或预后评估心脏疾病的产品中的应用,其中,适配子序列为如下a)-c)中的任意一种:
[0116] (a)HPN CP-19-3:
[0117] 5’-TTTTTCCGCGCTCAGTTTTGCATAGATTTGCACATTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.1);
[0118] (b)HPN CP-134-5:
[0119] 5’-TTTTTCCGCGCCCCCTCTGGTCAACCAGTCACATTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.2);
[0120] (c)HPN CP-186-5:
[0121] 5’-TTTTTCCGCGCAGCCCAAAAGGAGAATTCTTTGTTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.3)。
[0122] 在优选地实施方式中,产品为试剂或试剂盒,检测样本包括血清、血浆或尿液。心脏疾病包括心肌梗死。
[0123] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0124] 实施例1硅基探针材料的制备
[0125] (1)羟基化硅球:用十六烷基三甲基溴化铵为模板,在75℃的温度下搅拌加入正硅酸乙酯(十六烷基溴化铵与正硅酸乙酯的反应摩尔比为1:9),反应1.5小时后离心并用超纯水和无水乙醇洗涤冻干,得到羟基化硅球;
[0126] (2)氨基化硅球:将羟基化硅球浸入6%(v/v)APTES溶液(溶剂为乙醇)在室温下缓慢摇动1.5小时,随后用乙醇洗涤,并在120℃烘干10小时;
[0127] (3)羰基化硅球:氨基化硅球浸入5%的戊二醛溶液中(溶剂为1x PBS溶液,同时含有45mmol/L的氰基硼氢化钠)室温摇动反应2.5小时,离心并用PBS洗涤;
[0128] (4)引入PEG:羰基化硅球浸入450mmol/L羧基-PEG-胺溶液(溶剂为1xPBS溶液,同时含有55mmol/L氰基硼氢化钠)室温10h,温和晃动,离心并用PBS洗涤,超纯水洗涤并冻干。
[0129] 实施例2硅基探针材料的制备
[0130] (1)羟基化硅球:用十六烷基三甲基溴化铵为模板,在85℃的温度下搅拌加入正硅酸乙酯(十六烷基溴化铵与正硅酸乙酯的反应摩尔比为1:7),反应2.5小时后离心并用超纯水和无水乙醇洗涤冻干,得到羟基化硅球;
[0131] (2)氨基化硅球:将羟基化硅球浸入4%(v/v)APTES溶液(溶剂为乙醇)在室温下缓慢摇动2.5小时,随后用乙醇洗涤,并在100℃烘干14小时;
[0132] (3)羰基化硅球:氨基化硅球浸入3%的戊二醛溶液中(溶剂为1x PBS溶液,同时含有55mmol/L的氰基硼氢化钠)室温摇动反应1.5小时,离心并用PBS洗涤;
[0133] (4)引入PEG:羰基化硅球浸入550mmol/L羧基-PEG-胺溶液(溶剂为1xPBS溶液,同时含有45mmol/L氰基硼氢化钠)室温14h,温和晃动,离心并用PBS洗涤,超纯水洗涤并冻干。
[0134] 实施例3硅基探针材料的制备
[0135] (1)羟基化硅球:用十六烷基三甲基溴化铵为模板,在80℃的温度下搅拌加入正硅酸乙酯(十六烷基溴化铵与正硅酸乙酯的反应摩尔比为1:8),反应2小时后离心并用超纯水和无水乙醇洗涤冻干,得到羟基化硅球;羟基化硅球的形貌表征结果如图1所示;
[0136] (2)氨基化硅球:将羟基化硅球浸入5%(v/v)APTES溶液(溶剂为乙醇)在室温下缓慢摇动2小时,随后用乙醇洗涤,并在110℃烘干12小时;
[0137] (3)羰基化硅球:氨基化硅球浸入4%的戊二醛溶液中(溶剂为1x PBS溶液,同时含有50mmol/L的氰基硼氢化钠)室温摇动反应2小时,离心并用PBS洗涤;
[0138] (4)引入PEG:羰基化硅球浸入500mmol/L羧基-PEG-胺溶液(溶剂为1xPBS溶液,同时含有50mmol/L氰基硼氢化钠)室温12h,温和晃动,离心并用PBS洗涤,超纯水洗涤并冻干。
[0139] 实施例4硅基探针的制备
[0140] 硅基探针材料,先氨基化处理,再与适配子连接:
[0141] (1)PEG的氨基化:将硅基探针材料浸入到含有5mmol/L EDC和10mmol/LSulfo-NHS的MES溶液中(pH5)室温摇动反应6小时;
[0142] (2)修饰发卡适配子CPs:将步骤(1)中的硅基探针材料侵入到CPs溶液中,室温反应过夜。
[0143] 实施例5硅基探针
[0144] 本实施例提供的硅基探针为实施例3中的硅基探针材料参照实施例4中的制备方法制备得到的,其中,适配子的序列为:
[0145] (a)HPN CP-19-3:
[0146] 5’-TTTTTCCGCGCTCAGTTTTGCATAGATTTGCACATTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.1);
[0147] (b)HPN CP-134-5:
[0148] 5’-TTTTTCCGCGCCCCCTCTGGTCAACCAGTCACATTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.2);
[0149] (c)HPN CP-186-5:
[0150] 5’-TTTTTCCGCGCAGCCCAAAAGGAGAATTCTTTGTTAATATATGCGCGGGCG-3’(SEQ ID NO.3)。
[0151] 目标检测微小RNA的序列为:
[0152] miR-134-5p:5’-UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG-3’(SEQ ID NO.4);
[0153] 硅基探针材料氨基化后的形貌表征结果如图2所示,制备得到的硅基探针形貌表征结果如图3所示。
[0154] 同时采用红外表征手段对硅基探针材料和硅基探针进行表征,结果如图4所示。
[0155] 实施例6硅基探针对微小RNA检测
[0156] 1、对不同的微小RNA的检测
[0157] 该实施例中以定量PCR检测手段为对照,分析实施例5中的硅基探针对微小RNA检测的准确性和特异性。定量PCR和硅基探针的标准检测曲线如图5所示,其中,a为定量PCR的检测曲线,b为硅基探针的检测曲线。
[0158] 其中,微小RNA(血浆中常见的序列)包括如下:
[0159]名称 序列(5’-3’) 序列号
miR-134-5p UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG SEQ ID NO.5
miR-197 CGGGUAGAGAGGGCAGUGGGAGG SEQ ID NO.6
miR-30a-5p GGACCUGUAAACAUCCUCGACUG SEQ ID NO.7
miR-21 GGACCUUAGCUUAUCAGACUGAUG SEQ ID NO.8
miR-19a UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA SEQ ID NO.9
miR-186 CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU SEQ ID NO.10
miR-145 GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU SEQ ID NO.11
miR-30a-3p GGACCCUUUCAGUCGGAUGUUUG SEQ ID NO.12
[0160] 将本发明实施例5提供的硅基探针材料与不同种类的微小RNA混合孵育10分钟后利用全功能微孔板检测仪进行检测,确定不同的微小RNA对硅基探针材料的响应情况,确定硅基探针材料对待检测微小RNA的检测效果,其中,100nmol/L浓度的不同微小RNA与硅基探针反应后,检测结果如图6所示。
[0161] 2、对特定的微小RNA不同浓度的检测
[0162] 将待测微小RNA(miR-134)配置成1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、20pM、50pM、100pM、200pM、500pM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM和50nM的浓度。采用实施例5中的硅基探针进行检测,根据响应情况拟合出检测的线性曲线,结果为图5中的b图。该硅基探针的灵敏度可达
1fM。
[0163] 3、对实际的样品检测
[0164] 选用实际待检测的样本,从医院获取相应的心血管疾病的病人样本、其他心血管疾病的样本以及经体检检测未患心血管疾病的病人的样本,分离血清。
[0165] 将本发明实施例5提供的硅基探针与实际样本混合孵育10分钟后利用全功能微孔板检测仪进行检测,根据响应情况,结合检测曲线确定样本中待检测的微小RNA(miR-134)的含量。
[0166] 利用实时荧光定量PCR的方法对实际样本中提取的RNA进行检测,同时计算出不同的样本中待检测的微小RNA的含量。
[0167] 将本发明检测的实际结果与利用实时荧光定量PCR方法检测的结果进行比较,确定本方法的可行性。结果如下表所示:
[0168]
[0169] 可以看出,本发明提供的硅基探针检测的实验结果与通过定量PCR方法得当的实验结果基本吻合,这也说明了本发明硅基探针的有效性。
[0170] 综上所述,本发明提供的硅基探针材料及其制备的硅基探针可以有效地对体液进行原位检测,该方案简便、成本低,为体液检测技术提供了一个全新的方向。
[0171] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

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