[0001] 本发明涉及对免疫球蛋白G(IgG)具有结合亲和性的、源自人Fcγ受体(以下称为FcγR)IIb(CD32b)及FcγRIIa(CD32a)的、提高了生产率及热稳定性的改良型重组FcγRIIb及改良型重组FcγRIIa。

[0002] FcγR是与作为抗原与IgG的结合物的IgG免疫复合物结合而在细胞内进行信号转导的一组受体(非专利文献1)。人的FcγR可以分类为亚型，已经报道了FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)及FcγRIIIb(CD16b)(非专利文献1～3)。

[0003] IgG免疫复合物与FcγR的结合是通过FcγR结合到IgG的Fc区而引起的。各FcγR分子种具有IgG的Fc区识别结构域，能够识别单一一种IgG、或属于同一亚型的IgG。由此决定在各免疫应答中动员哪个辅助细胞(非专利文献1～3)。在FcγR中，FcγRIIb进行抑制细胞活化的信号转导，与进行细胞活化的信号转导的其它亚型的FcγR不同(非专利文献1～3)。FcγRIIa为活化型FcγR中的一种，在巨噬细胞、血小板、嗜中性细胞、单核细胞、树突细胞等中表达。FcγRIIc为活化型FcγR中的一种，在自然杀伤细胞等中表达。

[0004] 成熟的FcγR的蛋白质由与IgG的Fc区结合的细胞外区域、跨膜区域及与信号转导相关的细胞内区域构成。FcγRIIb与FcγRIIc的细胞外区域的氨基酸序列相同。另外，FcγRIIa与FcγRIIb的细胞外区域的氨基酸序列同源性非常高。

[0005] 源自人FcγRIIb的重组蛋白(以下称为重组FcγRIIb)有可能用于诊断、医疗、晶体结构解析、进而抗体的分离或浓缩中所使用的色谱材料等(专利文献1～4)。关于使用了大肠杆菌宿主的重组FcγRIIb的制备，目前已经进行了一些研究，但专利文献1～4报道了使在大肠杆菌宿主中以包涵体(不溶性)形式表达的重组FcγRIIb进行再生(重折叠)的制备方法。

[0006] 源自人FcγRIIa的重组蛋白(以下称为重组FcγRIIa)有可能用于诊断、医疗、晶体结构解析、进而抗体的分离或浓缩中所使用的色谱材料等。关于使用了大肠杆菌宿主的重组FcγRIIa的制备，目前已经进行了一些研究，非专利文献4及5报道了使在大肠杆菌宿主中以包涵体(不溶性)形式表达的重组FcγRIIa进行再生(重折叠)的制备方法。

[0007] 但是，重折叠存在通常需要复杂的操作、操作花费时间而效率低等课题(非专利文献6)。

[0008] 另外，为了重组FcγRIIb及FcγRIIa的工业化应用，从使用、保存等观点出发而优选重组FcγRIIb及FcγRIIa对于各种条件(热、酸性、碱性等)的稳定性高。但是，截至目前为止，尚未进行重组FcγRIIb及FcγRIIa的稳定性提高。

[0009] 现有技术文献

[0010] 专利文献

[0011] 专利文献1:日本特表2002-531086号公报

[0012] 专利文献2:日本特表2005-515981号公报

[0013] 专利文献3:日本特开2011-105716号公报

[0014] 专利文献4:日本特开2012-188456号公报

[0015] 非专利文献

[0016] 非专利文献1:高井俊行，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318-326，2005[0017] 非专利文献2:J.V.Ravetch等，Annu.Rev.Immunol.，9，457-492，1991[0018] 非专利文献3:P.Bruhns，BLOOD，119，5640-5649，2012

[0019] 非专利文献4:P.Sondermann等，J.Mol.Biol.，309，737-749，2001[0020] 非专利文献5:S.T.Jung等，Biotechnol.Bioeng.，107，21-30，2010[0021] 非专利文献6:H.Yamaguchi&M.Miyazaki，Biomolecules,4,235-251,2014发明内容

[0022] 发明要解决的问题

[0023] 本发明的目的在于，提供不需要重折叠、并且生产率和热稳定性高的改良型重组FcγRIIb及FcγRIIa，以及其制造方法。

[0024] 用于解决问题的方案

[0025] 本发明人们进行了深入研究，结果发现，通过将构成重组FcγRIIb及FcγRIIa的氨基酸中的特定氨基酸置换为其它特定氨基酸、并且利用大肠杆菌宿主以可溶性形式进行表达，由此可提供不需要重折叠、并且生产率和热稳定性高的改良型重组FcγRIIb及FcγRIIa，从而完成了本发明。

[0026] 即，本发明可以例示如下。

[0027] [1]一种改良型重组FcγRII，其选自以下的(i)～(iii)中的任一种，[0028] (i)改良型重组FcγRIIb，其至少含有序列号1所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中含有以下的(1)～(6)记载的氨基酸置换中的任意一个以上，

[0029] (1)序列号1的第68位的异亮氨酸置换为缬氨酸

[0030] (2)序列号1的第80位的组氨酸置换为谷氨酰胺

[0031] (3)序列号1的第84位的丝氨酸置换为苏氨酸

[0032] (4)序列号1的第90位的天冬酰胺置换为苏氨酸

[0033] (5)序列号1的第91位的天冬酰胺置换为丝氨酸

[0034] (6)序列号1的第125位的组氨酸置换为精氨酸

[0035] (ii)改良型重组FcγRIIa，其至少含有序列号88所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中含有以下的(7)～(12)记载的氨基酸置换中的任意一个以上，

[0036] (7)序列号88的第68位的异亮氨酸置换为缬氨酸

[0037] (8)序列号88的第80位的组氨酸置换为谷氨酰胺

[0038] (9)序列号88的第84位的丝氨酸置换为苏氨酸

[0039] (10)序列号88的第90位的天冬酰胺置换为苏氨酸

[0040] (11)序列号88的第91位的天冬酰胺置换为丝氨酸

[0041] (12)序列号88的第125位的组氨酸置换为精氨酸

[0042] (iii)改良型重组FcγRII，其由在上述(i)或(ii)的改良型重组FcγRII的氨基酸序列中在被上述(1)～(12)的置换进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有IgG结合性。

[0043] [2]根据[1]所述的改良型重组FcγRII，其为选自以下的(iv)～(vi)中的任一种改良型重组FcγRII，

[0044] (iv)改良型重组FcγRIIb，其至少含有序列号1所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中至少含有以下的(1)记载的氨基酸置换，

[0045] (1)序列号1的第68位的异亮氨酸置换为缬氨酸

[0046] (v)改良型重组FcγRIIa，其至少含有序列号88所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中至少含有以下的(7)记载的氨基酸置换，

[0047] (7)序列号88的第68位的异亮氨酸置换为缬氨酸

[0048] (vi)改良型重组FcγRII，其由在上述(iv)或(v)的改良型重组FcγRII的氨基酸序列中在被上述(1)或(7)的置换进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有IgG结合性。

[0049] [3]根据[1]所述的改良型重组FcγRII，其为选自以下的(vii)～(ix)中的任一种，

[0050] (vii)改良型重组FcγRIIb，其至少含有序列号2～序列号11中的任一者所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基；

[0051] (viii)改良型重组FcγRIIa，其至少含有序列号89所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基；

[0052] (ix)改良型重组FcγRII，其由在上述(vii)或(viii)的改良型重组FcγRII的氨基酸序列中在被上述(1)～(12)的置换进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有IgG结合性。

[0053] [4]一种DNA，其编码[1]～[3]中任一项所述的改良型重组FcγRII。

[0054] [5]一种重组载体，其含有[4]所述的DNA。

[0055] [6]一种转化体，其为用[5]所述的重组载体转化宿主而得的、能生产改良型重组FcγRII的转化体。

[0056] [7]根据[6]所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。

[0057] [8]一种改良型重组FcγRII的制造方法，其包括以下2个工序：通过培养[6]或[7]所述的转化体而生产改良型重组FcγRII的工序；和、从得到的培养物回收所生产的改良型重组FcγRII的工序。

[0058] [9]一种吸附剂，其为将[1]～[3]中任一项所述的改良型重组FcγRII固定化于不溶性载体而得到的。

[0059] [10]一种抗体的分离方法，其包括以下2个工序：将含有抗体的溶液添加到填充有[9]所述的吸附剂的柱子中，使该吸附剂吸附上述抗体的工序；和、使用洗脱液洗脱所吸附的上述抗体的工序。

[0060] 以下详细说明本发明。

[0061] 1.本发明的改良型重组FcγRIIb

[0062] 以下对本发明的改良型重组FcγRIIb进行说明。

[0063] 本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb为(a)或(b)，(a)：改良型重组FcγRIIb，其至少含有序列号1所示的氨基酸序列中的第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中含有上述的置换(1)～置换(6)中的任意一个以上的置换；(b)：改良型重组FcγRIIb，其由在上述的(a)的氨基酸序列中在被置换(1)～(6)进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成。

[0064] 对序列号1的氨基酸序列进行说明。序列号1的氨基酸序列为源自人FcγRIIb(序列号12、UniProt No.P31994)的细胞外区域的重组蛋白(重组FcγRIIb)的氨基酸序列。序列号1的N末端侧第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为止的氨基酸序列为向大肠杆菌周质分泌的分泌表达信号序列(MalE信号序列)，第27位的甲硫氨酸至第28位的甘氨酸为止的氨基酸序列为接头序列，第29位的苏氨酸至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸序列为源自人FcγRIIb(序列号12)的细胞外区域的氨基酸序列(序列号12所示的氨基酸序列的N末端侧第43位的苏氨酸至第215位的谷氨酰胺)的序列，第202位的甘氨酸至第203位的甘氨酸为止的氨基酸序列为接头序列，第204位的组氨酸至第209位的组氨酸为止的氨基酸序列为多聚组氨酸序列。

[0065] 上述的置换(1)至置换(6)具有在本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb的制造中提高由转化体带来的生产率(表达量)的效果。因此，本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb与由序列号1所示的氨基酸序列形成的重组FcγRIIb相比生产率高。为了进一步提高由转化体带来的的、本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb的生产率，优选具有上述的置换(1)至置换(6)的置换中的多个，更优选具有全部。

[0066] 进而，上述的置换(1)至置换(6)还具有提高本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb的热稳定性的效果。因此，本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb的热稳定性与由序列号1所示的氨基酸序列组成的重组FcγRIIb相比热稳定性高。为了进一步提高本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb的热稳定性，优选具有上述的置换(1)至置换(6)的置换中的多个，更优选具有全部。

[0067] 作为本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb的优选例子，可列举本申请第2发明的改良型FcγRIIb、即(a’)或(b’)，(a’)：改良型重组FcγRIIb，其至少含有序列号1所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位的氨基酸残基中至少含有上述(1)的置换；(b’)：改良型重组FcγRIIb，其由在上述(a’)的改良型重组FcγRIIb的氨基酸序列中、在被上述(1)的置换进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有IgG结合性。

[0068] 作为本申请第1发明的改良型重组FcγRIIb的其它优选例子，可列举本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb、即(c)或(d)，(c)：改良型重组FcγRIIb，其至少含有以下中的任一者所示的氨基酸序列中第29位至第201位的氨基酸残基：

[0069] 序列号2(置换(3))

[0070] 序列号3(含有置换(6))、

[0071] 序列号4(含有置换(1))、

[0072] 序列号5(含有置换(1)、置换(3)及置换(6))、

[0073] 序列号6(含有置换(1)、置换(3)、置换(5)及置换(6))、

[0074] 序列号7(含有置换(1)、置换(3)、置换(4)及置换(6))、

[0075] 序列号8(含有置换(1)、置换(2)、置换(3)及置换(6))、

[0076] 序列号9(含有置换(1)、置换(2)、置换(3)、置换(5)及置换(6))、[0077] 序列号10(含有置换(1)、置换(3)、置换(4)、置换(5)及置换(6))、以及[0078] 序列号11(含有置换(1)、置换(2)、置换(3)、置换(4)、置换(5)及置换(6))；

[0079] (d)：改良型重组FcγRIIb，其由在上述(c)的改良型重组FcγRIIb的氨基酸序列中、在被上述(1)～(6)的置换进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有IgG结合性。

[0080] 本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb优选在其N末端侧具有促进表达用宿主中的可溶性表达的信号序列。例如，在宿主为大肠杆菌的情况下，优选具有向大肠杆菌周质中分泌的分泌表达信号序列。向大肠杆菌周质分泌的分泌表达信号序列可以使用MalE信号序列等通过文献等(例如，S.H.Yoon等，Recent Pat.Biotechnol.,4,23-29，2010)而公知的序列。其中，在仅仅期望由上述的置换(1)至置换(6)所带来的提高热稳定性的效果的情况下，本申请第1发明～本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb则不必在其N末端侧具有促进表达用宿主中的可溶性表达的信号序列。

[0081] 本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb只要维持其IgG结合性则可以在被上述的置换(1)至置换(6)进行了置换的位置以外的区域(换言之，在保持上述的置换(1)至置换(6)的置换的同时，还)缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸。例如，既可以将序列号1的氨基酸序列中的、与作为向大肠杆菌周质分泌的分泌表达信号的MalE信号序列(某些情况下也含有邻接的接头序列)相当的部分置换为PelB、DsbA或TorT等其它信号序列(S.H.Yoon等，Recent Pat.Biotechnol.,4,23-29，2010)，也可以缺失了与该MalE信号序列相当的部分。另外，例如，也可以将序列号1的氨基酸序列中的、与多聚组氨酸序列(某些情况下也含有邻接的接头序列)相当的部分置换为其它序列(例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、多聚天门冬氨酸、由序列号86的第200位的精氨酸至第205位的甘氨酸为止的氨基酸残基构成的半胱氨酸标签等寡肽)，还可以缺失了与该多聚组氨酸序列相当的部分。进而，可以向本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb中添加谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白等具有其它功能的蛋白质的氨基酸序列而制作融合蛋白。需要说明的是，与序列号1的氨基酸序列中的第29位的苏氨酸至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基相当的部分的、可进行上述的缺失、置换或添加的氨基酸残基数优选为1～10个、进一步优选为1～5个。氨基酸的缺失、置换或添加可以使用本领域技术人员熟知的基因工程方法来进行。

[0082] 本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb等的IgG结合性可以利用酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法(例如，下述的ELISA方法1)、表面等离子共振法(P.Bruhns等，Blood，113，3716-3725，2009)等来评价。

[0083] 对ELISA方法1进行说明。ELISA方法1中，将IgG(化学及血清疗法研究所制)用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整至10μg/mL的浓度后，将其以100μL/孔添加到96孔微孔板(MaxiSorp、Nunc公司制)的各孔中，对IgG进行固定化(4℃下18小时)。固定化结束后，弃掉各孔的溶液，向各孔中添加TBS-B缓冲液(含有137mM的NaCl、2.68mM的KCl、0.5％(w/v)的牛血清白蛋白的20mM的Tris-HCl(pH8.0))进行封闭(30℃下2小时)。用洗涤缓冲液(含有0.05％(w/v)的Tween20和150mM的NaCl的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5))洗涤各孔后，向孔中添加含有改良型重组FcγRIIb的样品溶液，使其与固定化IgG反应(30℃下1.5小时)。
反应结束后，用洗涤缓冲液洗涤各孔，向各孔中添加辣根过氧化物酶标记的抗His-Tag抗体试剂(BETHYL公司制)(用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释)，在30℃下反应1.5小时。反应后，用洗涤缓冲液进行各孔的洗涤，向各孔中添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)，测定
450nm处的吸光度。

[0084] 以下对本申请第4发明至本申请第8发明进行说明。本申请第4发明的DNA可以通过以下方法得到：利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)法之类的DNA扩增法，以人FcγRIIb或其它FcγR(FcγRIIa、FcγRIIc等)的cDNA等为基础进行改造而制作的方法；由人FcγRIIb或其它FcγR(FcγRIIa、FcγRIIc等)的氨基酸序列转换碱基序列，人工制作含有该碱基序列的DNA，对其进一步利用DNA扩增法进行改造而制作的方法；以及，例如将序列号2至序列号11记载的氨基酸序列转换为碱基序列，人工制作含有该碱基序列的DNA的方法等。在这些方法中，在由氨基酸序列转换碱基序列时，优选考虑本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb的生产中所利用的微生物、细胞(宿主)中的密码子的使用频度。作为一例，在利用大肠杆菌作为宿主时，分别地，精氨酸(Arg)的情况下，AGA、AGG、CGG或CGA为使用频度低的所谓罕用密码子；异亮氨酸(Ile)的情况下，ATA为使用频度低的所谓罕用密码子；亮氨酸(Leu)的情况下，CTA为使用频度低的所谓罕用密码子；甘氨酸(Gly)的情况下，GGA为使用频度低的所谓罕用密码子；脯氨酸(Pro)的情况下，CCC为使用频度低的所谓罕用密码子；因此优选选择这些密码子以外的密码子进行转换。顺便提及的是，密码子的使用频度的解析也可以利用例如Kazusa DNA Research Institute的主页中的Codon Usage Database(http：//www.kazusa.or.jp/codon/、访问日：2016年6月21日)来进行。

[0085] 在使用DNA扩增法制作本申请第4发明的DNA时，可以利用使用易错PCR法的变异导入法。易错PCR法的反应条件只要是可在DNA中导入所期望的变异的条件则没有特别限定，例如，可以将作为底物的4种脱氧核糖核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度设为不均匀、并且以0.01至10mM、优选0.1至1mM的浓度向PCR反应液中添加MnCl 2而进行PCR。

[0086] 作为本申请第4发明的DNA，具体可以例示：

[0087] 由编码序列号2的氨基酸序列的序列号13的碱基序列构成的DNA、

[0088] 由编码序列号3的氨基酸序列的序列号14的碱基序列构成的DNA、

[0089] 由编码序列号4的氨基酸序列的序列号15的碱基序列构成的DNA、

[0090] 由编码序列号5的氨基酸序列的序列号16及17的碱基序列构成的DNA、[0091] 由编码序列号6的氨基酸序列的序列号18的碱基序列构成的DNA、

[0092] 由编码序列号7的氨基酸序列的序列号19的碱基序列构成的DNA、

[0093] 由编码序列号8的氨基酸序列的序列号20的碱基序列构成的DNA、

[0094] 由编码序列号9的氨基酸序列的序列号21的碱基序列构成的DNA、

[0095] 由编码序列号10的氨基酸序列的序列号22的碱基序列构成的DNA、及[0096] 由编码序列号11的氨基酸序列的序列号23的碱基序列构成的DNA。

[0097] 在使用本申请第4发明的DNA转化宿主时，可以使用本发明的DNA本身进行转化，例如，从可以实施稳定的转化的观点出发，优选如下方式：在以原核细胞、真核细胞的转化所通常使用的噬菌体、黏粒或质粒等为基础的载体中的合适位置处，插入本申请第4发明的DNA而制作本申请第5发明的重组载体，使用其进行转化。这里，合适位置是指：不会破坏与重组载体的复制功能、所期望的抗生素标记及传递性相关的区域的位置。另外，在向载体中插入本申请第4发明的DNA时，优选以与表达所需要的启动子之类的功能性DNA连接的状态插入到载体中。

[0098] 本申请第5发明中使用的载体只要是可在宿主内稳定地存在、复制的载体则没有特别限制，例如在以大肠杆菌为宿主的情况下，可例示pET载体、pUC载体、pTrc载体、pCDF载体及pBBR载体等。另外，作为本申请发明中使用的启动子，例如在以大肠杆菌为宿主的情况下，可列举trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子、以及λ噬菌体的λPL启动子、λPR启动子等。

[0099] 本申请第6发明或本申请第7发明的转化体可以通过用本申请第5发明的重组载体转化宿主来得到。本申请第6发明或本申请第7发明的转化体含有本申请第5发明的重组载体。

[0100] 本申请第6发明中使用的宿主没有特别限制，从基因工程相关实验容易的角度出发，优选大肠杆菌(本申请第7发明的方式)。另外，在使用本申请第5发明的重组载体转化宿主时，用本领域技术人员通常使用的方法进行即可，例如，在选择大肠杆菌(大肠杆菌JM109株、大肠杆菌BL21(DE3)株、大肠杆菌NiCo21(DE3)株、大肠杆菌W3110株等)作为宿主的情况下，可以使用公知的文献(例如，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，256，1992)中记载的方法等。需要说明的是，通过使用适当的提取方法或市售的试剂盒等从本申请第6发明或本申请第7发明的转化体可以提取本申请第5发明的重组载体。例如，在宿主为大肠杆菌的情况下，可以使用碱提取法或QIAprep Spin Miniprep kit(商品名、QIAGEN公司制)等市售的提取试剂盒。

[0101] 本申请第8发明为使用本申请第6发明或本申请第7发明的转化体制造本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb的方法，其包括以下2个工序：通过培养转化体来生产本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb的工序(以下称为第1工序)；和、从得到的培养物回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb的工序(以下称为第2工序)。需要说明的是，本说明书中，培养物除了包括培养而得的转化体细胞本身和细胞分泌物以外，还包括培养中使用的培养基等。

[0102] 本申请第8发明中的第1工序中，将转化体用适合培养其的的培养基进行培养即可。例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下(即本申请第7发明的方式)，优选使用补充了必要的营养源的Luria-Bertani(LB)培养基。在本申请第5发明的重组载体含有抗药基因的情况下，如果向培养基中添加与该基因对应的药剂来实施第1工序，则能够实现转化体的选择性增殖，例如在该重组载体含有卡那霉素抗性基因的情况下，优选向培养基中添加卡那霉素。

[0103] 培养基中，除了添加碳、氮及无机盐供给源以外还添加适当的营养源，进而，为了促进由本申请第6发明或本申请第7发明的转化体向培养液分泌蛋白质，还可以添加甘氨酸等试剂。在宿主为大肠杆菌(使用本申请第7发明的转化体)的情况下，所添加的甘氨酸浓度只要是不影响其增殖的范围即可，相对于培养基优选为10％(w/v)以下，更优选为0.1％(w/v)至2％(w/v)。培养温度只要是对于所利用的宿主而言通常已知的温度即可，例如在宿主为大肠杆菌(使用本申请第7发明的转化体)的情况下，为10℃至40℃，优选为20℃至37℃，考虑想要制造的本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb的制造量等适宜决定即可。培养基的pH只要设为对于所利用的宿主通常已知的pH范围即可，例如在宿主为大肠杆菌(使用本申请第7发明的转化体)的情况下，在pH6.8至pH7.4的范围，优选为pH7.0左右，考虑想要制造的本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb的制造量等适宜决定即可。

[0104] 在本申请第5发明的重组载体中导入有诱导性启动子的情况下，可以在本申请第1至本申请第3发明能够良好地制造的条件下向培养基中添加诱导剂诱导其表达。作为优选的诱导剂，可例示异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，其添加浓度在0.005至1.0mM的范围，优选在0.01至0.5mM的范围。利用添加IPTG而实现的表达诱导只要在对于所利用的宿主而言通常已知的的条件下进行即可。

[0105] 本申请第8发明中的第2工序中，从第1工序中得到的培养物利用通常已知的回收方法来回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb。例如在本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb被分泌、生产到培养液中的情况下，可以利用离心分离操作将细胞分离，从得到的培养上清中回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb，在细胞内(原核生物的情况下也包括周质)表达的情况下，可以利用离心分离操作而收集细胞后，添加酶处理剂、表面活性剂等操作等将细胞破碎，从细胞破碎液中回收。

[0106] 如以上所说明，根据本申请第8发明，可以从宿主的培养物回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb。在对所回收的本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIb进一步进行高纯度化的情况下，可以使用通常已知的纯化方法。例如，可列举使用液相色谱的分离纯化，此时优选使用离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等，更优选将这些色谱中的多种组合而进行纯化。

[0107] 通过使本申请第1发明至本申请第3发明的改良型FcγRIIb与不溶性载体结合，可以制造本申请第9发明的吸附剂。对于上述不溶性载体，没有特别限定，可例示：以琼脂糖、海藻酸盐(alginate)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉之类的多糖为原料的载体；以聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)、聚氨酯之类的合成高分子为原料的载体；以二氧化硅等陶瓷为原料的载体。其中，优选以多糖为原料的载体、以合成高分子为原料的载体作为不溶性载体。作为上述优选的载体的一例，可列举：TOYOPEARL(TOSOH CORPORATION制)等导入了羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶、Sepharose(GE Healthcare制)等琼脂糖凝胶、Cellufine(JNC制)等纤维素凝胶。对于不溶性载体的形状，没有特别限定，可以是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性中的任一者。

[0108] 为了将本申请第1发明至本申请第3发明的改良型FcγRIIb固定化于不溶性载体，对不溶性载体赋予N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙烷磺酰基(Tresyl)、甲酰基、卤代乙酰胺等活性基团，通过该活性基团使人Fc结合性蛋白与不溶性载体共价结合而进行固定化即可。赋予了活性基团的载体可以直接使用市售的载体；也可以在适当的反应条件下向载体表面导入活性基团而制备。作为赋予了活性基团的市售的载体，可例示：TOYOPEARL AF-Epoxy-650M、TOYOPEARL AF-Tresyl-650M(均为TOSOH东曹制)；HiTrap NHS-activated HP Columns、NHS-activated Sepharose 
4Fast Flow、Epoxy-activated Sepharose 6B(均为GE Healthcare制)；SulfoLink Coupling Resin(Thermo Scientific制)。

[0109] 另一方面，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示使存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基等与具有2个以上活性位点的化合物中的一个反应的方法。作为该化合物的一例中的对载体表面的羟基、氨基导入环氧基的化合物，可例示：环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油基醚、丁二醇二缩水甘油基醚、己二醇二缩水甘油基醚。作为在利用上述化合物对载体表面导入环氧基之后、向载体表面导入羧基的化合物，可例示：2-巯基乙酸、3-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基丁酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸。

[0110] 作为向载体表面存在的羟基、环氧基、羧基、氨基导入马来酰亚胺基的化合物，可例示：N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼、N-(ε-马来酰亚胺丙酸)酰肼、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)乙酸酰肼、2-氨基马来酰亚胺、3-氨基马来酰亚胺、4-氨基马来酰亚胺、6-氨基马来酰亚胺、1-(4-氨基苯基)马来酰亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酰亚胺、4-(马来酰亚胺)苯基异氰酸酯、
2-马来酰亚胺基乙酸、3-马来酰亚胺基丙酸、4-马来酰亚胺基丁酸、6-马来酰亚胺基己酸、(N-[α―马来酰亚胺乙酰氧基])琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基])环己烷-1-羰基-[6-氨基己酸]、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基])环己烷-1-羧酸、(马来酰亚胺对苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯。

[0111] 作为向载体表面存在的羟基、氨基导入卤代乙酰基的化合物，可例示：氯代乙酸、溴代乙酸、碘代乙酸、氯代乙酰氯、溴代乙酰氯、溴代乙酰溴、氯代乙酸酐、溴代乙酸酐、碘代乙酸酐、2-(碘代乙酰胺)乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(溴代乙酰胺)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(碘代乙酰基)氨基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。需要说明的是，还可例示使载体表面存在的羟基、氨基与ω-烯基烷基缩水甘油基醚反应之后、用卤化剂将ω-烯基位点卤化而进行活化的方法。作为ω-烯基烷基缩水甘油基醚，可例示出烯丙基缩水甘油基醚、3-丁烯基缩水甘油基醚、4-戊烯基缩水甘油基醚；作为卤化剂，可例示出N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺。

[0112] 作为向载体表面导入活性基团的方法的另一例子，有如下方法：对于载体表面存在的羧基使用缩合剂和添加剂导入活化基团的方法。作为缩合剂，可例示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑。另外，作为添加剂，可例示N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-硝基苯酚、1-羟基苯并三唑。

[0113] 作为将本申请第1发明至本申请第3发明的改良型FcγRIIb固定化于不溶性载体时使用的缓冲液，可例示乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，吗啉代乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液。对于固定化时的反应温度，在考虑到活性基团的反应性、本发明的Fc结合性蛋白的稳定性的基础上，在5℃至50℃的温度范围内适当设定即可，优选为10℃至35℃的范围。

[0114] 为了使用本申请第9发明的吸附剂分离抗体(实施本申请第10发明)，例如，可以向填充有本申请第9发明的吸附剂的柱子中使用泵等液体供应单元添加含有抗体的缓冲液，由此使抗体特异性地吸附于本申请第9发明的吸附剂，然后对柱子添加合适的洗脱液而洗脱抗体。需要说明的是，如果对柱子添加含有抗体的缓冲液之前使用合适的缓冲液对柱子进行平衡化，则可以以更高的纯度将抗体分离，因此而优选。作为缓冲液，可例示磷酸缓冲液等以无机盐为成分的缓冲液。需要说明的是，缓冲液的pH为pH3至10，优选为pH6至9。为了将吸附于本申请第9发明的吸附剂的抗体洗脱，可以弱化抗体与配体(本发明的Fc结合性蛋白)的相互作用，具体而言，可例示出由缓冲液带来的pH变化、抗衡肽(counter peptide)、温度变化、盐浓度变化。作为用于洗脱吸附于本申请第9发明的吸附剂的抗体的洗脱液的具体例子，可列举与使抗体吸附于本申请第9发明的吸附剂时使用的溶液相比位于酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可例示在酸性侧具有缓冲能力的柠檬酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。缓冲液的pH在不破坏抗体所具有的功能的范围内设定即可，优选为pH2.5至6.0，更优选为pH3.0至5.0、进一步优选为pH3.3至4.0。

[0115] 2.本发明的改良型重组FcγRIIa

[0116] 以下对本发明的改良型重组FcγRIIa进行说明。

[0117] 本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa为(a)或(b)，(a)：改良型重组FcγRIIa：其至少含有序列号88所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中含有上述的置换(7)至置换(12)中的任意一个以上的置换；(b)：改良型重组FcγRIIa，其由在上述的(a)的氨基酸序列中，在被置换(7)～(12)进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成。

[0118] 对序列号88的氨基酸序列进行说明。序列号88的氨基酸序列为源自人FcγRIIa(序列号90、UniPlot No.P12318-1)的细胞外区域的重组蛋白(重组FcγRIIa)的氨基酸序列。由序列号88的N末端侧第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为止的氨基酸序列为向大肠杆菌周质分泌的分泌表达信号序列(MalE信号序列)，第27位的甲硫氨酸至第28位的甘氨酸为止的氨基酸序列为接头序列，第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸序列为源自人FcγRIIa(序列号90)的细胞外区域的氨基酸序列(序列号90所示的氨基酸序列的N末端侧第34位的谷氨酰胺至第206位的谷氨酰胺)的序列，由第202位的甘氨酸至第203位的甘氨酸为止的氨基酸序列为接头序列，第204位的组氨酸至第209位的组氨酸为止的氨基酸序列为多聚组氨酸序列。

[0119] 需要说明的是，序列号88的氨基酸序列的第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺的氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列的第29位的苏氨酸至第201位的谷氨酰胺的氨基酸序列的同源性高，仅12个氨基酸残基不同。将具体的彼此不同的位置示于图4。人FcγRIIa与人FcγRIIb的氨基酸序列的保守性高。

[0120] 上述的置换(7)至置换(12)具有在本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa的制造中提高转化体的生产率(表达量)的效果。因此，本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa与由序列号88所示的氨基酸序列构成的重组FcγRIIa相比生产高率。为了进一步提高转化体的、本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa的生产率，优选具有上述的置换(7)至置换(12)的置换中的多种，更优选具有全部。

[0121] 进而，上述的置换(7)至置换(12)还具有提高本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa的热稳定性的效果。因此，本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa的热稳定性与由序列号88所示的氨基酸序列构成的重组FcγRIIa相比热稳定性高。为了进一步提高本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa的热稳定性，优选具有上述的置换(7)至置换(12)的置换中的多种，更优选具有全部。

[0122] 作为本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa的优选例子，可列举本申请第2发明的改良型FcγRIIa、即(v)或(vi)，(v)：改良型重组FcγRIIa，其至少含有序列号88所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中至少含有上述(7)记载的氨基酸置换；(vi)：改良型重组FcγRIIa，其由在上述(v)的改良型重组FcγRIIa的氨基酸序列中在被上述(7)的置换进行了置换的位置以外的区域缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成，并且具有IgG结合性。

[0123] 作为本申请第1发明的改良型重组FcγRIIa的其它优选例子，可列举本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa，即含有置换(7)、置换(8)、置换(9)、置换(10)、置换(11)及置换(12)且至少含有序列号89所示的氨基酸序列中第29位至第201位为止的氨基酸残基的改良型重组FcγRIIa。

[0124] 本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa优选在其N末端侧具有促进表达用宿主中的可溶性表达的信号序列。例如，在宿主为大肠杆菌的情况下，优选具有向大肠杆菌周质中分泌的分泌表达信号序列。向大肠杆菌周质分泌的分泌表达信号序列可以使用MalE信号序列等通过文献等(例如，S.H.Yoon等，Recent Pat.Biotechnol.,4,23-29，2010)而公知的序列。其中，在仅仅期望由上述的置换(7)至置换(12)所带来的提高热稳定性的效果的情况下，本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa则不必在其N末端侧具有促进表达用宿主中的可溶性表达的信号序列。

[0125] 本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa只要维持其IgG结合性则可以在被上述的置换(7)至置换(12)进行了置换的位置以外的区域(换言之，在保持上述的置换(7)至置换(12)的置换的同时，还)缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸。例如，既可以将序列号88的氨基酸序列中的、与作为向大肠杆菌周质分泌的分泌表达信号的MalE信号序列(某些情况下也含有邻接的接头序列)相当的部分置换为PelB、DsbA或TorT等其它信号序列(S.H.Yoon等，Recent Pat.Biotechnol.,4,23-29，2010)，也可以缺失了与该MalE信号序列相当的部分。另外，例如，也可以将序列号88的氨基酸序列中的、与多聚组氨酸序列(某些情况下也含有邻接的接头序列)相当的部分置换为其它序列(例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、多聚天门冬氨酸、由序列号175的第200位的精氨酸至第205位的甘氨酸为止的氨基酸残基构成的半胱氨酸标签等寡肽等)，还可以缺失了与该聚组氨酸序列相当的部分。进而，可以向本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa中添加谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白等具有其它功能的蛋白质的氨基酸序列而制作融合蛋白。需要说明的是，与序列号88的氨基酸序列中的第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基相当的部分的可进行上述的缺失、置换或添加的氨基酸残基数优选为1～10个、进一步优选为1～5个。氨基酸的缺失、置换或添加可以使用本领域技术人员熟知的基因工程方法来进行。

[0126] 本发明的改良型重组FcγRIIa等的IgG结合性可以利用酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法(例如，下述的ELISA方法1)、表面等离子共振法(P.Bruhns等，Blood，113，3716-3725，2009)等来评价。

[0127] 对ELISA方法1进行说明。ELISA方法1中，将IgG(化学及血清疗法研究所制)用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整至10μg/mL的浓度后，将其以100μL/孔添加到96孔微孔板(MaxiSorp、Nunc公司制)的各孔中，将IgG固定化(4℃下18小时)。固定化结束后，弃掉各孔的溶液，向各孔中添加TBS-B缓冲液(含有137mM的NaCl、2.68mM的KCl和0.5％(w/v)的牛血清白蛋白的20mM的Tris-HCl(pH8.0))，进行封闭(30℃下2小时)。用洗涤缓冲液(含有0.05％(w/v)的Tween20和150mM的NaCl的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5))洗涤各孔后，向孔中添加含有改良型重组FcγRIIa的样品溶液，使其与固定化IgG反应(30℃下1.5小时)。
反应结束后，用洗涤缓冲液洗涤各孔，向各孔中添加辣根过氧化物酶标记的抗His-Tag抗体试剂(BETHYL公司制)(用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释)，在30℃下反应1.5小时。反应后，用洗涤缓冲液进行各孔的洗涤，向各孔中添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)，测定
450nm处的吸光度。

[0128] 以下对本申请第4发明至本申请第8发明进行说明。本申请第4发明的DNA可以通过以下方法得到：利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)法之类的DNA扩增法，以FcγRIIa或其它FcγR(人FcγRIIb、FcγRIIc等)的cDNA等为基础进行改造而制作的方法；由人FcγRIIa或其它FcγR(FcγRIIb、FcγRIIc等)的氨基酸序列转换碱基序列，人工制作含有该碱基序列的DNA，对其进一步利用DNA扩增法进行改造而制作的方法；以及，例如将序列号89记载的氨基酸序列转换为碱基序列，人工制作含有该碱基序列的DNA的方法等。在这些方法中，在由氨基酸序列转换碱基序列时，优选考虑本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa的生产中所利用的微生物、细胞(宿主)中的密码子的使用频度。作为一例，在利用大肠杆菌作为宿主时，精氨酸(Arg)的情况下，AGA、AGG、CGG或CGA为使用频度低的所谓罕用密码子；异亮氨酸(Ile)的情况下，ATA为使用频度低的所谓罕用密码子；亮氨酸(Leu)的情况下，CTA为使用频度低的所谓罕用密码子；甘氨酸(Gly)的情况下，GGA为使用频度低的所谓罕用密码子；脯氨酸(Pro)的情况下，CCC为使用频度低的所谓罕用密码子；因此优选选择这些密码子以外的密码子进行转换。顺便提及的是，密码子的使用频度的解析也可以利用例如Kazusa DNA Research Institute的主页中的Codon Usage Database(http：//www.kazusa.or.jp/codon/、访问日：2016年6月21日)来进行。

[0129] 在使用DNA扩增法制作本申请第4发明的DNA时，可以利用使用易错PCR法的变异导入法。易错PCR法的反应条件只要是可在DNA中导入所期望的变异的条件则没有特别限定，例如，可以将作为底物的4种脱氧核糖核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度设为不均匀、并且以0.01至10mM、优选0.1至1mM的浓度向PCR反应液中添加MnCl2而进行PCR。

[0130] 作为本申请第4发明的DNA，具体可例示由编码序列号89的氨基酸序列的序列号91的碱基序列构成的DNA。

[0131] 在使用本申请第4发明的DNA转化宿主时，可以使用本发明的DNA本身进行转化，例如，从可以实施稳定的转化的观点出发，优选如下方式：在以原核细胞、真核细胞的转化所通常使用的噬菌体、黏粒或质粒等为基础的载体中的合适位置处，插入本申请第4发明的DNA而制作本申请第5发明的重组载体，使用其进行转化。这里，合适位置是指：不会破坏与重组载体的复制功能、所期望的抗生素标记及传递性相关的区域的位置。另外，在向载体中插入本申请第4发明的DNA时，优选以与表达所需要的启动子之类的功能性DNA连接的状态插入到载体中。

[0132] 本申请第5发明中使用的载体只要是可在宿主内稳定地存在、复制的载体则没有特别限制，例如在以大肠杆菌为宿主的情况下，可例示pET载体、pUC载体、pTrc载体、pCDF载体及pBBR载体等。另外，作为本申请发明中使用的启动子，例如在以大肠杆菌为宿主的情况下，可列举trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子、以及λ噬菌体的λPL启动子、λPR启动子等。

[0133] 本申请第6发明或本申请第7发明的转化体可以通过用本申请第5发明的重组载体转化宿主来得到。本申请第6发明或本申请第7发明的转化体含有本申请第5发明的重组载体。

[0134] 本申请第6发明中使用的宿主没有特别限制，从基因工程相关实验容易的角度出发，优选大肠杆菌(本申请第7发明的方式)。另外，在使用本申请第4发明的重组载体转化宿主时，用本领域技术人员通常使用的方法进行即可，例如，在选择大肠杆菌(大肠杆菌JM109株、大肠杆菌BL21(DE3)株、大肠杆菌NiCo21(DE3)株、大肠杆菌W3110株等)作为宿主的情况下，可以使用公知的文献(例如，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，256，1992)中记载的方法等。需要说明的是，通过使用适当的提取方法或市售的试剂盒等从本申请第6发明或本申请第7发明的转化体可以提取本申请第5发明的重组载体。例如，在宿主为大肠杆菌的情况下，可以使用碱提取法或QIAprep Spin Miniprep kit(商品名、QIAGEN公司制)等市售的提取试剂盒。

[0135] 本申请第8发明为使用本申请第6发明或本申请第7发明的转化体制造本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa的方法，其包括以下2个工序：通过培养转化体来生产本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa的工序(以下称为第1工序)；和、从得到的培养物回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa的工序(以下称为第2工序)。需要说明的是，本说明书中，培养物除了包括培养而得的转化体细胞本身和细胞分泌物以外，还包括培养中使用的培养基等。

[0136] 本申请第8发明中的第1工序中，将转化体用适合培养其的的培养基进行培养即可。例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下(即本申请第7发明的方式)，优选使用补充了必要的营养源的Luria-Bertani(LB)培养基。在本申请第5发明的重组载体含有抗药基因的情况下，如果向培养基中添加与该基因对应的药剂来实施第1工序，则能够实现转化体的选择性增殖，例如在该重组载体含有卡那霉素抗性基因的情况下，优选向培养基中添加卡那霉素。

[0137] 培养基中，除了添加碳、氮及无机盐供给源以外还添加适当的营养源，进而，为了促进由本申请第6发明或本申请第7发明的转化体向培养液分泌蛋白质，还可以添加甘氨酸等试剂。在宿主为大肠杆菌(使用本申请第7发明的转化体)的情况下，所添加的甘氨酸浓度只要是不影响其增殖的范围即可，相对于培养基优选为10％(w/v)以下，更优选为0.1％(w/v)至2％(w/v)。培养温度只要是对于所利用的宿主而言通常已知的温度即可，例如在宿主为大肠杆菌的情况下，为10℃至40℃，优选为20℃至37℃，考虑想要制造的本申请第1发明至本申请第3发明的制造量等适宜决定即可。培养基的pH只要设为对于所利用的宿主通常已知的pH范围即可，例如在宿主为大肠杆菌(使用本申请第7发明的转化体)的情况下，在pH6.8至pH7.4的范围，优选为pH7.0左右，考虑想要制造的本申请第1发明至本申请第3发明的制造量等适宜决定即可。

[0138] 在本申请第5发明的重组载体中导入有诱导性启动子的情况下，可以在本申请第1发明至本申请第3发明能够良好地制造的条件下向培养基中添加诱导剂诱导其表达。作为优选的诱导剂，可例示异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，其添加浓度在0.005至1.0mM的范围，优选在0.01至0.5mM的范围。利用添加IPTG而实现的表达诱导只要在对于所利用的宿主而言通常已知的的条件下进行即可。

[0139] 本申请第8发明中的第2工序中，从第1工序中得到的培养物利用通常已知的回收方法来回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa。例如在本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa被分泌、生产到培养液中的情况下，可以利用离心分离操作将细胞分离，从得到的培养上清中回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa，在细胞内(原核生物的情况下也包括周质)表达的情况下，可以利用离心分离操作而收集细胞后，添加酶处理剂、表面活性剂等操作等将细胞破碎，从细胞破碎液中回收。

[0140] 如以上所说明，根据本申请第8发明，可以从宿主的培养物回收本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa。在对所回收的本申请第1发明至本申请第3发明的改良型重组FcγRIIa进一步进行高纯度化的情况下，可以使用通常已知的纯化方法。例如，可列举使用液相色谱的分离纯化，此时优选使用离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等，更优选将这些色谱中的多种组合而进行纯化。

[0141] 通过使本申请第1发明至本申请第3发明的改良型FcγRIIa与不溶性载体结合，可以制造本申请第9发明的吸附剂。对于上述不溶性载体，没有特别限定，可例示：以琼脂糖、海藻酸盐(alginate)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉之类的多糖为原料的载体；以聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)、聚氨酯之类的合成高分子为原料的载体；以二氧化硅等陶瓷为原料的载体。其中，优选以多糖为原料的载体、以合成高分子为原料的载体作为不溶性载体。作为上述优选的载体的一例，可列举：TOYOPEARL(TOSOH CORPORATION制)等导入了羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶、Sepharose(GE Healthcare制)等琼脂糖凝胶、Cellufine(JNC制)等纤维素凝胶。对于不溶性载体的形状，没有特别限定，可以是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性中的任一者。

[0142] 为了将本申请第1发明至本申请第3发明的改良型FcγRIIa固定化于不溶性载体，对不溶性载体赋予N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙烷磺酰基(Tresyl)、甲酰基、卤代乙酰胺等活性基团，通过该活性基团使人Fc结合性蛋白与不溶性载体共价结合而进行固定化即可。赋予了活性基团的载体可以直接使用市售的载体；也可以在适当的反应条件下向载体表面导入活性基团而制备。作为赋予了活性基团的市售的载体，可例示：TOYOPEARL AF-Epoxy-650M、TOYOPEARL AF-Tresyl-650M(均为TOSOH东曹制)；HiTrap NHS-activated HP Columns、NHS-activated Sepharose 
4Fast Flow、Epoxy-activated Sepharose 6B(均为GE Healthcare制)；SulfoLink Coupling Resin(ThermoScientific制)。

[0143] 另一方面，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示使存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基等与具有2个以上活性位点的化合物中的一个反应的方法。作为该化合物的一例中的对载体表面的羟基、氨基导入环氧基的化合物，可例示：环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油基醚、丁二醇二缩水甘油基醚、己二醇二缩水甘油基醚。作为在利用上述化合物对载体表面导入环氧基之后、向载体表面导入羧基的化合物，可例示：2-巯基乙酸、3-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基丁酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸。

[0144] 作为向载体表面存在的羟基、环氧基、羧基、氨基导入马来酰亚胺基的化合物，可例示：N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼、N-(ε-马来酰亚胺丙酸)酰肼、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)乙酸酰肼、2-氨基马来酰亚胺、3-氨基马来酰亚胺、4-氨基马来酰亚胺、6-氨基马来酰亚胺、1-(4-氨基苯基)马来酰亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酰亚胺、4-(马来酰亚胺)苯基异氰酸酯、
2-马来酰亚胺基乙酸、3-马来酰亚胺基丙酸、4-马来酰亚胺基丁酸、6-马来酰亚胺基己酸、(N-[α―马来酰亚胺乙酰氧基])琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基])环己烷-1-羰基-[6-氨基己酸]、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基])环己烷-1-羧酸、(马来酰亚胺对苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯。

[0145] 作为向载体表面存在的羟基、氨基导入卤代乙酰基的化合物，可例示：氯代乙酸、溴代乙酸、碘代乙酸、氯代乙酰氯、溴代乙酰氯、溴代乙酰溴、氯代乙酸酐、溴代乙酸酐、碘代乙酸酐、2-(碘代乙酰胺)乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(溴代乙酰胺)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(碘代乙酰基)氨基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。需要说明的是，还可例示使载体表面存在的羟基、氨基与ω-烯基烷基缩水甘油基醚反应之后、用卤化剂将ω-烯基位点卤化而进行活化的方法。作为ω-烯基烷基缩水甘油基醚，可例示出烯丙基缩水甘油基醚、3-丁烯基缩水甘油基醚、4-戊烯基缩水甘油基醚；作为卤化剂，可例示出N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺。

[0146] 作为向载体表面导入活性基团的方法的另一例子，有如下方法：对于载体表面存在的羧基使用缩合剂和添加剂导入活化基团的方法。作为缩合剂，可例示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑。另外，作为添加剂，可例示N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-硝基苯酚、1-羟基苯并三唑。

[0147] 作为将本申请第1发明至本申请第3发明的改良型FcγRIIa固定化于不溶性载体时使用的缓冲液，可例示乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，吗啉代乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液。对于固定化时的反应温度，在考虑到活性基团的反应性、本发明的Fc结合性蛋白的稳定性的基础上，在5℃至50℃的温度范围内适当设定即可，优选为10℃至35℃的范围。

[0148] 为了使用本申请第9发明的吸附剂分离抗体(实施本申请第10发明)，例如，可以向填充有本申请第9发明的吸附剂的柱子中使用泵等液体供应单元添加含有抗体的缓冲液，由此使抗体特异性吸附于本申请第9发明的吸附剂，然后对柱子添加合适的洗脱液而洗脱抗体。需要说明的是，如果对柱子添加含有抗体的缓冲液之前使用合适的缓冲液对柱子进行平衡化，则可以以更高的纯度将抗体分离，因此而优选。作为缓冲液，可例示磷酸缓冲液等以无机盐为成分的缓冲液。需要说明的是，缓冲液的pH为pH3至10，优选为pH6至9。为了将吸附于本申请第9发明的吸附剂的抗体洗脱，可以弱化抗体与配体(本发明的Fc结合性蛋白)的相互作用，具体而言，可例示出由缓冲液带来的pH变化、抗衡肽(counter peptide)、温度变化、盐浓度变化。作为用于洗脱吸附于本申请第9发明的吸附剂的抗体的洗脱液的具体例子，可列举与使抗体吸附于本申请第9发明的吸附剂时使用的溶液相比位于酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可例示在酸性侧具有缓冲能力的柠檬酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。缓冲液的pH在不破坏抗体所具有的功能的范围内设定即可，优选为pH2.5至6.0，更优选为pH3.0至5.0、进一步优选为pH3.3至4.0。

[0149] 发明的效果

[0150] 本发明的改良型重组FcγRIIb及改良型FcγRIIa发挥以下效果中的至少一种：利用大肠杆菌宿主以可溶性形式表达，从而不需要重折叠；生产率高；并且热稳定性高。本发明的另一方式提供改良型重组FcγRIIb及改良型FcγRIIa的制造方法。

[0155] 实施例

[0156] 以下使用实施例及比较例等详细说明本发明的实施方式，但这些例子是用于说明本发明的一方式的，并非对本发明进行限定。

[0157] 实施例1改良型重组FcγRIIb-a4F3的制作

[0158] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-a4F3的碱基序列的DNA的制作

[0159] 如下述((1-1)至(1-3))所示那样，首先由人FcγRIIb的氨基酸序列转换为碱基序列，然后制作含有该碱基序列的DNA，进一步利用DNA扩增法(PCR法及易错PCR法的两阶段)对其进行改造，从而制作含有如下碱基序列(序列号13)的DNA，所述碱基序列(序列号13)编码含有上述的置换(3)的改良型重组FcγRIIb-a4F3(序列号2的氨基酸序列)。

[0160] (1-1)由人FcγRIIb的氨基酸序列向碱基序列的转换及制作含有该碱基序列的DNA

[0161] 以人FcγRIIb的氨基酸序列(序列号12)为基础，使用DNAworks法(Nucleic Acid Res.，30，e43页，2002年)将密码子转换为大肠杆菌型，设计序列号24所示的、编码人FcγRIIb的氨基酸序列的碱基序列。

[0162] 使用了序列号25至序列号66所示的42种寡核苷酸利用两阶段的PCR制作序列号24所示的、编码人FcγRIIb的氨基酸序列的碱基序列的DNA。

[0163] 第一阶段的PCR如下实施：制备组成如表1所示的反应液，然后对该反应液进行94℃下5分钟的热处理，然后将以94℃下30秒的第1步骤、62℃下30秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复25个循环，然后在72℃下处理7分钟，然后冷却到4℃。需要说明的是，表1的DNA mix是指：将序列号25至序列号66所示的42种寡核苷酸分别以一定量取样并混合而成的溶液。

[0164] [表1]

[0165] 表1

[0166]组成 体积
10×Pyrobest缓冲液II(宝生物公司制) 5μL
dNTPs(宝生物公司制) 5μL
DNA mix 1μL
Pyrobest DNA聚合酶(宝生物公司制) 0.5μL
H2O 定容至50μL

[0167] 第二阶段的PCR如下实施：制备组成如表2所示的反应液，然后对该反应液进行94℃下5分钟的热处理，然后将以94℃下30秒的第1步骤、65℃下30秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复25个循环，然后在72℃下处理7分钟，然后冷却到4℃。

[0168] [表2]

[0169] 表2

[0170]组成 体积
10×Pyrobest缓冲液II(宝生物公司制) 5μL
dNTPs(宝生物公司制) 5μL
10pmol/μL的序列号25的寡核苷酸 2μL
10pmol/μL的序列号66的寡核苷酸 2μL
第一阶段的PCR产物 1μL
Pyrobest DNA聚合酶(宝生物公司制) 0.5μL
H2O 定容至50μL

[0171] 将第二阶段的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后，切出含有目标PCR产物的凝胶部分，用QIAquick Gel extraction kit(QIAGEN公司制)进行提取，由此进行纯化(以下将同样方法的纯化简记为DNA片段纯化)。将纯化后的PCR产物的5’末端磷酸化(TaKaRa BKL Kit：宝生物公司)，通过连接反应连接于经限制性内切酶SmaI消化的pUC19质粒载体，使用该载体转化大肠杆菌JM109株(宝生物公司)。将得到的转化体用添加有50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl)培养，用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司制)提取，由此制备载体pUC-FcγRIIb。

[0172] (1-2)利用DNA扩增法(PCR法)的改造

[0173] 分别地，使用上述的载体pUC-FcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号67及序列号68记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR如下实施：制备组成如表3所示的反应液后，对该反应液进行98℃下5分钟的热处理，然后将以98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复30个循环重复，然后在72℃下处理5分钟，然后冷却到4℃。将得到的PCR产物命名为rhFcγRIIb-p1。

[0174] [表3]

[0175] 表3

[0176]组成 体积
模板DNA 1μL
10pmol/μL PCR引物 各2μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(宝生物公司制) 0.25μL
5×PrimeSTAR缓冲液(宝生物公司制) 10μL
dNTPs(宝生物公司制) 4μL
H2O 定容至50μL

[0177] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物rhFcγRIIb-p1用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，再次进行DNA片段纯化。将该用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的PCR产物rhFcγRIIb-p1通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体(pETMalE21载体通过Hatayama&Ide报道的方法(Protein Expr.Purif.，111，1-8，2015)制作)，由此制作重组载体pET-rhFcγRIIb，使用其通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株(New England Biolabs公司制)。将得到的转化体命名为转化体rhFcγRIIb。

[0178] 将转化体rhFcγRIIb用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养，用QIAprep Spin Miniprep Kit提取，由此制备重组载体pET-rhFcγRIIb。

[0179] 将重组载体pET-rhFcγRIIb中、限制性内切酶XbaI识别序列至HindIII识别序列为止的DNA的碱基序列示于序列号69。序列号69的5’末端侧起第50位的腺嘌呤至第676位的胸腺嘧啶编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的重组FcγRIIb。

[0180] (1-3)利用DNA扩增法(易错PCR法)的改造

[0181] 用易错PCR法向编码序列号1所示的氨基酸序列的DNA中随机地导入变异。使用重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、分别使用由序列号70及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物。易错PCR如下实施：制备组成如表4所示的反应液，然后对该反应液进行95℃下2分钟的热处理，将以95℃下30秒的第1步骤、60℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤为1个循环的反应重复30个循环，最后进行72℃下7分钟的热处理。将得到的PCR产物(包含含有编码改良型重组FcγRIIb-a4F3的碱基序列的DNA)命名为EP。

[0182] [表4]

[0183] 表4

[0184]组成 浓度/体积
模板DNA 0.05ng/μL
各PCR引物 0.4μM
MnCl2 0.4mM
dATP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dCTP 1mM
dTTP 1mM
缓冲液(将MgCl2调节为5mM) 5μL
GoTaq聚合酶(Promega corporation制) 0.05U/μL
H2O 定容至μL

[0185] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物EP用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，再次进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，使用其通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体用含有50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基进行菌落形成。

[0186] (2)具有含有编码改良型重组FcγRIIb-a4F3的DNA的重组载体的转化体的获得[0187] 从上述的进行菌落形成后的转化体中，筛选、获得被含有编码改良型重组FcγRIIb-a4F3的DNA(序列号13)的重组载体(以下记作重组载体pET-a4F3)转化的转化体(以下记作转化体a4F3)。即，将上述转化体的各菌落(约1800)接种于含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基400μL，用96孔深孔板在37℃下好氧振荡培养一晚。

[0188] 培养后，将20μL的培养液继续接种于600μL的LB培养基(含有0.05mM的IPTG、0.3％(w/v)的甘氨酸及50μg/mL的卡那霉素)，用96孔深孔板进一步在20℃下好氧振荡培养24小时。培养后，将通过离心操作得到的培养上清作为样品溶液。

[0189] 然后，对于用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释了5倍的各样品溶液，通过上述的ELISA方法1的测定值评价其中所含的可溶性的改良型重组FcγRIIb的量。由利用该ELISA方法1得到的评价结果筛选、获得转化体a4F3。

[0190] 分别使用以下记载的重组载体提取方法及序列解析方法由转化体a4F3中提取重组载体pET-a4F3、和确认编码改良型重组FcγRIIb-a4F3的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0191] 重组载体提取方法：培养转化体(含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基，37℃下一晚，好氧)，用QIAprep Spin Miniprep Kit提取重组载体。

[0192] 序列解析方法：对于重组载体中的、编码改良型重组FcγRIIb-a4F3的DNA及其周边区域，使用基于链终止子法的Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS read Reaction kit(PE Applied Biosystem公司制)供于循环测序反应，利用全自动DNA测序仪ABI Prism 3700DNA analyzer(PE Applied Biosystem公司制)对碱基序列进行解析。需要说明的是，在该解析时，使用由序列号70或序列号71记载的序列构成的寡核苷酸中的任一者作为测序用引物。

[0193] (3)改良型重组FcγRIIb-a4F3的制造

[0194] 将转化体a4F3接种于含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基5mL，在37℃下进行一晚好氧振荡培养，由此进行预培养。在预培养之后，将预培养液以1％(v/v)接种于含有0.01mM的IPTG和50μg/mL的卡那霉素的LB培养基20mL，在20℃下好氧振荡培养24小时而生产改良型重组FcγRIIb-a4F3。

[0195] 使用BugBuster Protein extraction kit(Novagen公司制)，从自培养液中通过离心分离而收集的菌体中回收含有改良型重组FcγRIIb-a4F3的可溶性蛋白提取液。可溶性蛋白提取液中的改良型重组FcγRIIb-a4F3的浓度测定通过以下记载的ELISA方法2进行。以可溶性蛋白提取液中的改良型重组FcγRIIb-a4F3的浓度为基础进行计算，结果每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-a4F3的生产率为1.0±0.1mg(n＝2、以2个重复来实施可溶性蛋白提取液的回收及测定)。

[0196] ELISA方法2：将抗FcγRIIB/C抗体(Anti-FcγRIIB/C，Mouse-Mono(190710))(R&D Systems公司制、商品目录编号BAM18751)用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整至1μg/mL的浓度后，将其以100μL/孔添加到96孔微孔板(MaxiSorp、Nunc公司制)的各孔中，对抗FcγRIIB/C抗体进行固定化(4℃下18小时)。固定化结束后，弃掉各孔的溶液，向各孔中添加TBS-B缓冲液(含有137mM的NaCl、2.68mM的KCl和0.5％(w/v)的牛血清白蛋白)进行封闭(30℃下2小时)。用洗涤缓冲液(含有0.05％(w/v)的Tween 20和150mM的NaCl的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5))洗涤各孔后，将所制备的可溶性蛋白提取液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行梯度稀释，将它们添加到孔中而与固定化抗FcγRIIB/C抗体反应(30℃下1.5小时)。反应结束后，用洗涤缓冲液洗涤各孔，向各孔中添加辣根过氧化物酶标记的抗His-Tag抗体试剂(BETHYL公司制)(用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释)，在30℃下反应1.5小时。反应后，用上述洗涤缓冲液进行各孔的洗涤，向各孔中添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)，测定450nm处的吸光度。以已知浓度的带糖链的重组FcγRIIb(CD32b/c，Human，Recombinant，Carrier-free＜FcγRIIB/C＞)(R&D Systems公司制、商品目录编号1875-CD-050)的测定结果为基准，由测定吸光度确定可溶性蛋白提取液中的改良型重组FcγRIIb的浓度。

[0197] 实施例2改良型重组FcγRIIb-a2E2的制作

[0198] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-a2E2的碱基序列的DNA的制作

[0199] 通过与实施例1的(1)记载的方法同样的方法制作含有如下碱基序列(序列号14)的DNA(PCR产物EP中包含含有编码改良型重组FcγRIIb-a2E2的碱基序列的DNA)，所述碱基序列(序列号14)编码含有上述的置换(6)的改良型重组FcγRIIb-a2E2(序列号3的氨基酸序列)。

[0200] (2)具有含有编码改良型重组FcγRIIb-a2E2的DNA的重组载体的转化体的获得[0201] 从实施例1的(1-3)记载的进行菌落形成后的转化体中，筛选、获得被含有编码改良型重组FcγRIIb-a2E2的DNA(序列号14)的重组载体(以下记作重组载体pET-a2E2)转化的转化体(以下记作转化体a2E2)。该筛选的方法通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法进行。通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体a2E2提取重组载体pET-a2E2、和确认编码改良型重组FcγRIIb-a2E2的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0202] (3)改良型重组FcγRIIb-a2E2的制造

[0203] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体a2E2进行改良型重组FcγRIIb-a2E2的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-a2E2的生产率为1.3±0.0mg(n＝2)。

[0204] 实施例3改良型重组FcγRIIb-a15A6的制作

[0205] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-a15A6的碱基序列的DNA的制作

[0206] 通过与实施例1的(1)记载的方法同样的方法制作含有如下碱基序列(序列号15)的DNA(PCR产物EP中包含含有编码改良型重组FcγRIIb-a15A6的碱基序列的DNA)，所述碱基序列(序列号15)编码含有上述的置换(1)的改良型重组FcγRIIb-a15A6(序列号4的氨基酸序列)。

[0207] (2)具有含有编码改良型重组FcγRIIb-a15A6的DNA的重组载体的转化体的获得[0208] 从实施例1的(1-3)记载的进行菌落形成后的转化体中，筛选、获得被含有编码改良型重组FcγRIIb-a15A6的DNA(序列号15)的重组载体(以下记作重组载体pET-a15A6)转化的转化体(以下记作转化体a15A6)。该筛选的方法通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法进行。通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体a15A6提取重组载体pET-a15A6、和确认编码改良型重组FcγRIIb-a15A6的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0209] (3)改良型重组FcγRIIb-a15A6的制造

[0210] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体a15A6进行改良型重组FcγRIIb-a15A6的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-a15A6的生产率为1.7±0.0mg(n＝2)。

[0211] 实施例4改良型重组FcγRIIb-m3的制作

[0212] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-m3的碱基序列的DNA的制作

[0213] 如下所述地制作含有如下碱基序列(序列号16)的DNA，所述碱基序列(序列号16)编码含有上述的置换(1)、置换(3)及置换(6)的改良型重组FcγRIIb-m3(序列号5的氨基酸序列)。

[0214] 分别地，使用实施例1的(1-2)记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号70及序列号72记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m3p1。

[0215] [表5]

[0216] 表5

[0217]

[0218] 分别地，使用实施例1的(2)记载的重组载体pET-a4F3作为模板DNA、使用由序列号73及序列号74记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m3p2。

[0219] 分别地，使用实施例1的(1-2)记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号75及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m3p3。

[0220] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m3p1、m3p2及m3p3混合，然后制备组成如表6所示的反应液，使该反应液按照表7所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m3p4。

[0221] [表6]

[0222] 表6

[0223]组成 体积
PCR产物 各1μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(宝生物公司制) 0.25μL
5×PrimeSTAR缓冲液(宝生物公司制) 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
H2O 定容至50μL

[0224] [表7]

[0225] 表7

[0226]

[0227] 以PCR产物m3p4为模板DNA、以由序列号70及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码改良型重组FcγRIIb-m3的碱基序列(序列号16)的DNA。

[0228] (2)含有编码改良型重组FcγRIIb-m3的DNA的重组载体和具有该重组载体的转化体的制作

[0229] 将上述的含有编码改良型重组FcγRIIb-m3的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m3)。使用重组载体pET-m3通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m3。

[0230] 通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体m3提取重组载体pET-m3、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m3的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0231] (3)改良型重组FcγRIIb-m3的制造

[0232] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体m3进行改良型重组FcγRIIb-m3的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-m3的生产率为2.3±0.2mg(n＝2)。

[0233] 实施例5改良型重组FcγRIIb-d10D5的制作

[0234] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-d10D5的碱基序列的DNA的制作

[0235] 如下述((1-1)和(1-2))所示那样，以编码改良型重组FcγRIIb-m3的DNA为基础利用DNA扩增法(PCR法及易错PCR法的两阶段)改进、制作含有如下碱基序列(序列号18)的DNA，所述碱基序列(序列号18)编码含有上述的置换(1)、置换(3)、置换(5)及置换(6)的改良型重组FcγRIIb-d10D5(序列号6的氨基酸序列)。

[0236] (1-1)利用DNA扩增法(PCR法)的改造

[0237] 进行了如下改造：在编码改良型重组FcγRIIb-m3的氨基酸序列的一部分(序列号5的氨基酸序列的N末端侧第107位丝氨酸至第109位脯氨酸为止)的DNA区域中，设置限制性内切酶BamHI识别序列。

[0238] 分别地，使用实施例4记载的重组载体pET-m3作为模板DNA、使用由序列号70及序列号76记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m3(B)p1。

[0239] 分别地，使用实施例4记载的重组载体pET-m3作为模板DNA、使用由序列号77及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m3(B)p2。

[0240] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m3(B)p1及m3(B)p2混合，然后制备组成如表6所示的反应液，使该反应液按照表7所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m3(B)p3。

[0241] 以PCR产物m3(B)p3为模板DNA、以由序列号70及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。

[0242] 对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有如下碱基序列(序列号17)的DNA，所述碱基序列具有限制性内切酶BamHI识别序列、且编码与实施例4记载的改良型重组FcγRIIb-m3相同的氨基酸序列。将该DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m3(B))。使用重组载体pET-m3(B)通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m3(B)。

[0243] 通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体m3(B)提取重组载体pET-m3(B)、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m3的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0244] (1-2)利用DNA扩增法(易错PCR法)的改造

[0245] 用易错PCR法向编码改良型重组FcγRIIb-m3的氨基酸序列的DNA(序列号17)中随机地导入变异。使用重组载体pET-m3(B)作为模板DNA，使用由序列号70及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物。易错PCR如下实施：制备组成如表4所示的反应液后，对该反应液进行95℃下2分钟的热处理，将以95℃下30秒的第1步骤、50℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤为1个循环的反应重复30个循环，最后进行72℃下7分钟的热处理。将得到的PCR产物(也包含含有编码改良型重组FcγRIIb-d10D5的碱基序列的DNA)命名为EPm3(B)。

[0246] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物EPm3(B)用限制性内切酶NcoI和BamHI消化后，再次进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和BamHI消化后的pETMalE21载体，使用其通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体用含有50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基进行菌落形成。

[0247] (2)具有含有编码改良型重组FcγRIIb-d10D5的DNA的重组载体的转化体的获得[0248] 从上述的进行菌落形成后的转化体中，筛选、获得被含有编码改良型重组FcγRIIb-d10D5的DNA(序列号18)的重组载体(以下记作重组载体pET-d10D5)转化的转化体(以下记作转化体d10D5)。即，将上述转化体的各菌落(约1600)接种于含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基400μL，用96孔深孔板在37℃下好氧振荡培养一晚。培养后，将20μL的培养液继续接种于600μL的LB培养基(含有0.05mM的IPTG、0.3％(w/v)的甘氨酸及50μg/mL的卡那霉素)，用96孔深孔板进一步在20℃下好氧振荡培养24小时。培养后，将通过离心操作得到的培养上清作为样品溶液。然后，对于用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释了5倍的各样品溶液，通过上述的ELISA方法1的测定值评价其中所含的可溶性的改良型重组FcγRIIb的量。由利用该ELISA方法1得到的评价结果筛选、获得转化体d10D5。通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体d10D5提取重组载体pET-d10D5、和确认编码改良型重组FcγRIIb-d10D5的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0249] (3)改良型重组FcγRIIb-d10D5的制造

[0250] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体d10D5进行改良型重组FcγRIIb-d10D5的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-d10D5的生产率为2.5±0.1mg(n＝2)。

[0251] 实施例6改良型重组FcγRIIb-d11D7的制作

[0252] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-d11D7的碱基序列的DNA的制作

[0253] 通过与实施例5的(1)记载的方法同样的方法制作含有如下碱基序列(序列号19)的DNA(PCR产物EPm3(B)中包含含有编码改良型重组FcγRIIb-d11D7的碱基序列的DNA)，所述碱基序列(序列号19)编码含有上述的置换(1)、置换(3)、置换(4)及置换(6)的改良型重组FcγRIIb-d11D7(序列号7的氨基酸序列)。

[0254] (2)具有含有编码改良型重组FcγRIIb-d11D7的DNA的重组载体的转化体的获得[0255] 从实施例5的(1-2)记载的进行菌落形成后的转化体中，筛选、获得被含有编码改良型重组FcγRIIb-d11D7的DNA(序列号19)的重组载体(以下记作重组载体pET-d11D7)转化的转化体(以下记作转化体d11D7)。该筛选的方法通过与实施例5的(2)记载的方法同样的方法进行。通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体d11D7提取重组载体pET-d11D7、和确认编码改良型重组FcγRIIb-d11D7的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0256] (3)改良型重组FcγRIIb-d11D7的制造

[0257] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体d11D7进行改良型重组FcγRIIb-d11D7的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-d11D7的生产率为3.0±0.3mg(n＝2)。

[0258] 实施例7改良型重组FcγRIIb-d6E2的制作

[0259] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-d6E2的碱基序列的DNA的制作

[0260] 通过与实施例5的(1)记载的方法同样的方法制作含有如下碱基序列(序列号20)的DNA(PCR产物EPm3(B)中包含含有编码改良型重组FcγRIIb-d6E2的碱基序列的DNA)，所述碱基序列(序列号20)编码含有上述的置换(1)、置换(2)、置换(3)及置换(6)的改良型重组FcγRIIb-d6E2(序列号8的氨基酸序列)。

[0261] (2)具有含有编码改良型重组FcγRIIb-d6E2的DNA的重组载体的转化体的获得[0262] 从实施例5的(1-2)记载的进行菌落形成后的转化体中，筛选、获得被含有编码改良型重组FcγRIIb-d6E2的DNA(序列号20)的重组载体(以下记作重组载体pET-d6E2)转化的转化体(以下记作转化体d6E2)。该筛选的方法通过与实施例5的(2)记载的方法同样的方法进行。通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体d6E2提取重组载体pET-d6E2、和确认编码改良型重组FcγRIIb-d6E2的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0263] (3)改良型重组FcγRIIb-d6E2的制造

[0264] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体d6E2进行改良型重组FcγRIIb-d6E2的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-d6E2的生产率为3.4±0.0mg(n＝2)。

[0265] 实施例8改良型重组FcγRIIb-m5b的制作

[0266] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-m5b的碱基序列的DNA的制作

[0267] 如下所述地制作含有如下碱基序列(序列号21)的DNA，所述碱基序列(序列号21)编码含有上述的置换(1)、置换(2)、置换(3)、置换(5)及置换(6)的改良型重组FcγRIIb-m5b(序列号9的氨基酸序列)。

[0268] 分别地，使用实施例5记载的重组载体pET-d10D5作为模板DNA、使用由序列号70及序列号78记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m5bp1。

[0269] 分别地，使用实施例5记载的重组载体pET-d10D5作为模板DNA、使用由序列号79及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m5bp2。

[0270] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m5bp1和m5bp2混合，然后制备组成如表6所示的反应液，使该反应液按照表7所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m5bp3。

[0271] 以PCR产物m5bp3为模板DNA、以由序列号70及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码改良型重组FcγRIIb-m5b的碱基序列的DNA。

[0272] (2)含有编码改良型重组FcγRIIb-m5b的DNA的重组载体和具有该重组载体的转化体的制作

[0273] 将上述的含有编码改良型重组FcγRIIb-m5b的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m5b)。使用重组载体pET-m5b通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m5b。

[0274] 通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体m5b提取重组载体pET-m5b、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m5b的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0275] (3)改良型重组FcγRIIb-m5b的制造

[0276] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体m5b进行改良型重组FcγRIIb-m5b的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-m5b的生产率为3.0±0.9mg(n＝2)。

[0277] 实施例9改良型重组FcγRIIb-m5c的制作

[0278] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-m5c的碱基序列的DNA的制作

[0279] 如下所述地制作含有如下碱基序列(序列号22)的DNA，所述碱基序列(序列号22)编码含有上述的置换(1)、置换(3)、置换(4)、置换(5)及置换(6)的改良型重组FcγRIIb-m5c(序列号10的氨基酸序列)。

[0280] 分别地，使用实施例5的(1-1)记载的重组载体pET-m3(B)作为模板DNA、使用由序列号70及序列号80记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m5cp1。

[0281] 分别地，使用实施例5的(1-1)记载的重组载体pET-m3(B)作为模板DNA、使用由序列号81及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m5cp2。

[0282] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m5cp1和m5cp2混合，然后制备组成如表6所示的反应液，使该反应液按照表7所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m5cp3。

[0283] 以PCR产物m5cp3为模板DNA、以由序列号70及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码改良型重组FcγRIIb-m5c的碱基序列的DNA。

[0284] (2)含有编码改良型重组FcγRIIb-m5c的DNA的重组载体和具有该重组载体的转化体的制作

[0285] 将上述的含有编码改良型重组FcγRIIb-m5c的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m5c)。使用重组载体pET-m5c通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m5c。

[0286] 通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体m5c提取重组载体pET-m5c、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m5c的DNA及其周边区域的序列。

[0287] (3)改良型重组FcγRIIb-m5c的制造

[0288] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体m5c进行改良型重组FcγRIIb-m5c的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-m5c的生产率为3.5±0.6mg(n＝2)。

[0289] 实施例10改良型重组FcγRIIb-m6b的制作

[0290] (1)含有编码改良型重组FcγRIIb-m6b的碱基序列的DNA的制作按照下述方法制作含有以下碱基序列(序列号23)的DNA，所述碱基序列序列号23)编码含有上述的置换(1)、置换(2)、置换(3)、置换(4)、置换(5)及置换(6)的改良型重组FcγRIIb-m6b(序列号11的氨基酸序列)。

[0291] 分别地，使用实施例9的(1)记载的含有编码改良型重组FcγRIIb-m5c的碱基序列的DNA作为模板DNA、使用由序列号70及序列号78记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m6bp1。

[0292] 分别地，使用实施例9的(1)记载的含有编码改良型重组FcγRIIb-m5c的碱基序列的DNA作为模板DNA、使用由序列号79及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。将得到的PCR产物命名为m6bp2。

[0293] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m6bp1和m6bp2混合，然后制备组成如表6所示的反应液，使该反应液按照表7所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m6bp3。

[0294] 以PCR产物m6bp3为模板DNA、以由序列号70及序列号71记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表3所示的反应液、然后使该反应液按照表5所示的条件反应而实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码改良型重组FcγRIIb-m6b的碱基序列的DNA。

[0295] (2)含有编码改良型重组FcγRIIb-m6b的DNA的重组载体和具有该重组载体的转化体的制作

[0296] 将上述的含有编码改良型重组FcγRIIb-m6b的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m6b)。使用重组载体pET-m6b通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m6b。

[0297] 通过与实施例1的(2)记载的方法同样的方法从转化体m6b提取重组载体pET-m6b、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m6b的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0298] (3)改良型重组FcγRIIb-m6b的制造

[0299] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体m6b进行改良型重组FcγRIIb-m6b的制造。每1L培养液中的改良型重组FcγRIIb-m6b的生产率为4.1±0.4mg(n＝2)。

[0300] 实施例11改良型重组FcγRIIb的IgG结合性

[0301] (1)改良型重组FcγRIIb-a4F3、改良型重组FcγRIIb-a2E2及改良型重组FcγRIIb-a15A6的IgG结合性

[0302] 对实施例1记载的改良型重组FcγRIIb-a4F3、实施例2记载的改良型重组FcγRIIb-a2E2及实施例3记载的改良型重组FcγRIIb-a15A6进行IgG结合性的评价。

[0303] IgG结合性的评价利用上述的ELISA方法1来进行。具体而言，通过在如上述的ELISA方法1中有IgG固定化的条件和变更为上述的ELISA方法1中不进行IgG固定化操作、即无IgG固定化的条件这2种条件进行实验(各以2个重复来进行实验)。实验中，将含有实施例1至实施例3记载的各改良型重组FcγRIIb的可溶性蛋白提取液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍后作为样品使用。

[0304] 作为对照，使用：用pETMalE21载体转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株而得的转化体并利用实施例1的(3)记载的培养方法和可溶性蛋白提取液的制备方法制备的可溶性蛋白提取液(以下记作样品MalE21)、以及50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)(以下记作样品缓冲液)，进行同样的实验。

[0305] 各改良型重组FcγRIIb的IgG结合性的评价结果示于表8。如表8所示，仅在使用各改良型重组FcγRIIb的样品进行上述的ELISA方法1(有IgG固定化的条件)的实验时得到高的检测值。由该结果可确认，改良型重组FcγRIIb-a4F3、改良型重组FcγRIIb-a2E2及改良型重组FcγRIIb-a15A6具有IgG结合性。

[0306] [表8]

[0307] 表8

[0308]

[0309] (2)改良型重组FcγRIIb-m3的IgG结合性

[0310] 对实施例4记载的改良型重组FcγRIIb-m3进行IgG结合性的评价。IgG结合性的评价与上述的方法同样地进行。在IgG结合性的评价中，将含有实施例4记载的改良型重组FcγRIIb-m3的可溶性蛋白提取液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍后作为样品使用。作为对照，使用上述的样品缓冲液进行了同样的实验。

[0311] 将IgG结合性的评价结果示于表9。如表9所示，仅在使用改良型重组FcγRIIb-m3的样品进行上述的ELISA方法1(有IgG固定化的条件)时得到高的检测值。由该结果可确认，改良型重组FcγRIIb-m3具有IgG结合性。

[0312] [表9]

[0313] 表9

[0314]

[0315] (3)改良型重组FcγRIIb-d10D5、改良型重组FcγRIIb-d11D7及改良型重组FcγRIIb-d6E2的IgG结合性

[0316] 对实施例5记载的改良型重组FcγRIIb-d10D5、实施例6记载的改良型重组FcγRIIb-d11D7及实施例7记载的改良型重组FcγRIIb-d6E2进行IgG结合性的评价。IgG结合性的评价与上述的方法同样地进行。在IgG结合性的评价中，将含有实施例5至实施例7记载的各改良型重组FcγRIIb的可溶性蛋白提取液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍后作为样品。作为对照，使用上述的样品缓冲液进行了同样的实验。

[0317] 将IgG结合性的评价结果示于表10。如表10所示，使用各改良型重组FcγRIIb的样品仅在进行上述的ELISA方法1(有IgG固定化的条件)的情况下得到高的检测值。由该结果可确认，改良型重组FcγRIIb-d10D5、改良型重组FcγRIIb-d11D7及改良型重组FcγRIIb-d6E2具有IgG结合性。

[0318] [表10]

[0319] 表10

[0320]

[0321] (4)改良型重组FcγRIIb-m5b、改良型重组FcγRIIb-m5c及改良型重组FcγRIIb-m6b的IgG结合性

[0322] 对实施例8记载的改良型重组FcγRIIb-m5b、实施例9记载的改良型重组FcγRIIb-m5c及实施例10记载的改良型重组FcγRIIb-m6b进行IgG结合性的评价。IgG结合性的评价与上述的方法同样地进行。在IgG结合性的评价中，将含有实施例8至实施例10记载的各改良型重组FcγRIIb的可溶性蛋白提取液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍后作为样品使用。作为对照，使用上述的样品缓冲液进行了同样的实验。将IgG结合性的评价结果示于表11。如表11所示，仅在使用各改良型重组FcγRIIb的样品进行上述的ELISA方法1(有IgG固定化的条件)时得到高的检测值。由该结果可确认，改良型重组FcγRIIb-m5b、改良型重组FcγRIIb-m5c及改良型重组FcγRIIb-m6b具有IgG结合性。

[0323] [表11]

[0324] 表11

[0325]

[0326] 实施例12改良型重组FcγRIIb的热稳定性

[0327] 对于实施例1记载的改良型重组FcγRIIb-a4F3、实施例2记载的改良型重组FcγRIIb-a2E2、实施例3记载的改良型重组FcγRIIb-a15A6、实施例4记载的改良型重组FcγRIIb-m3、实施例5记载的改良型重组FcγRIIb-d10D5、实施例6记载的改良型重组FcγRIIb-d11D7、实施例7记载的改良型重组FcγRIIb-d6E2、实施例8记载的改良型重组FcγRIIb-m5b、实施例9记载的改良型重组FcγRIIb-m5c及实施例10记载的改良型重组FcγRIIb-m6b，进行热稳定性的评价。

[0328] 在热稳定性的评价中，使用含有实施例1至实施例10记载的各改良型重组FcγRIIb的可溶性蛋白提取液作为样品。将各样品用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释200倍，进行4℃下30分钟的处理、55℃下30分钟的热处理或60℃下30分钟的热处理。通过实施例1的(3)记载的ELISA方法2测定各处理后的样品的改良型重组FcγRIIb浓度。对于各样品，将4℃下30分钟的处理的改良型重组FcγRIIb浓度设为100％，分别算出55℃下30分钟的热处理和60℃下30分钟的热处理的改良型重组FcγRIIb浓度的比例，作为热处理后的检测率(％)。实验以2个重复来进行。

[0329] 将各改良型重组FcγRIIb的热稳定性的评价结果示于图1。如图1所示，就热稳定性(热处理后的检测率)而言，改良型重组FcγRIIb-m6b最高，可知有如下倾向：改良型重组FcγRIIb中存在的上述的置换(1)至置换(6)的数量越多，则其热稳定性越提高。

[0330] 比较例1重组FcγRIIb的制作

[0331] 制作由序列号1所示的氨基酸序列构成的重组FcγRIIb。

[0332] (1)含有编码重组FcγRIIb的碱基序列的DNA、重组载体pET-rhFcγRIIb及转化体rhFcγRIIb的制作

[0333] 通过实施例1的(1-1)和(1-2)记载的方法制作含有编码重组FcγRIIb(序列号1)的碱基序列的DNA、重组载体pET-rhFcγRIIb及转化体rhFcγRIIb。

[0334] (2)重组FcγRIIb的制造

[0335] 通过与实施例1的(3)记载的方法同样的方法使用转化体rhFcγRIIb进行重组FcγRII的制造。每1L培养液的重组FcγRIIb的生产率为0.8±0.0mg(n＝2)。

[0336] 将比较例1记载的重组FcγRIIb的生产率及实施例1至实施例10记载的各改良型重组FcγRIIb的生产率汇总示于表12。如表12所示，可知实施例1至实施例10的各改良型重组FcγRIIb的生产率均高于重组FcγRIIb(比较例1)。另外，如表12所示，可知有如下倾向：改良型重组FcγRIIb中存在的上述的置换(1)至置换(6)的数量越多，则其生产率越提高。
进而，含有置换(1)的改良型重组FcγRIIb(实施例4至实施例10记载的改良型重组FcγRIIb)与比较例1的重组FcγRIIb相比生产率均提高了2倍以上，可知置换(1)对于提高生产率特别有用。

[0337] [表12]

[0338] 表12

[0339]

[0340] 比较例2重组FcγRIIb的热稳定性

[0341] 对比较例1记载的重组FcγRIIb进行热稳定性的评价。在热稳定性的评价中，使用含有比较例1记载的重组FcγRIIb的可溶性蛋白提取液作为样品。实验通过与实施例12记载的方法同样的方法进行。

[0342] 将重组FcγRIIb的热稳定性的评价结果示于图1。如图1所示，可知实施例1至实施例10的各改良型重组FcγRIIb与重组FcγRIIb(比较例1)相比热稳定性(热处理后的检测率)均高。

[0343] 实施例13改良型重组FcγRIIb的酸稳定性

[0344] 对实施例10记载的改良型重组FcγRIIb-m6b进行酸稳定性的评价。将含有实施例10记载的改良型重组FcγRIIb-m6b的可溶性蛋白提取液的样品溶液用纯水稀释至30μg/mL后，将上述稀释后的样品溶液100μL与0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)200μL混合，在30℃下分别静置24小时、48小时、72小时。

[0345] 通过实施例1的(3)记载的ELISA方法2测定利用甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行酸处理后的蛋白质的抗体结合活性、和未进行上述酸处理时的蛋白质的抗体结合活性。然后，将进行酸处理时的抗体结合活性除以未进行酸处理时的抗体结合活性，由此算出残存活性。

[0346] 比较例3重组FcγRIIb的酸稳定性

[0347] 对比较例1记载的重组FcγRIIb进行酸稳定性的评价。酸稳定性的评价除了使用含有比较例1记载的重组FcγRIIb的可溶性蛋白提取液作为样品以外，通过与实施例13记载的方法同样的方法进行。

[0348] 将改良型重组FcγRIIb-m6b(实施例10)及重组FcγRIIb(比较例1)的酸稳定性的评价结果汇总示于表13。如表13所示，可知实施例10记载的改良型重组FcγRIIb-m6b与比较例1记载的重组FcγRIIb相比酸稳定性(酸处理后的残存活性)高。由以上结果可知，上述改良型重组FcγRIIb与上述重组FcγRIIb相比热稳定性提高(实施例12及比较例2)，并且酸稳定性也提高。

[0349] [表13]

[0350] 表13

[0351]

[0352] 实施例14添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIb-m6b＿Cys的制作(1)以含有序列号23记载的多聚核苷酸的表达载体pET-m6b为模板实施PCR，所述序列号23记载的多聚核苷酸编码实施例10中制作的由序列号11记载的氨基酸序列构成的蛋白质。该PCR中的引物使用由序列号82(5’-TAGCCATGGGCATGCGTACCGAAGATCTGCCGAAAGC-3’)及序列号83(5’-CCCAAGCTTATCCGCAGGTATCGTTGCGGCAGCCCTGCACGGTGATAGTAACCGGCTTGCTGCTATA-3’)记载的序列构成的寡核苷酸。PCR如下实施：制备组成如表3所示的反应液后，对该反应液进行98℃下5分钟的热处理，将以98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复30个循环。

[0353] (2)将(1)中得到的多聚核苷酸纯化，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的通过WO2015/199154号记载的方法制作的表达载体pTrc-PelBV3，使用该连接产物转化大肠杆菌W3110株。

[0354] (3)将得到的转化体用含有100μg/mL的羧苄青霉素的LB培养基培养后，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)得到表达载体pTrc-m6b＿Cys。

[0355] (4)使用由序列号84(5’-TGTGGTATGGCTGTGCAGG-3’)或序列号85(5’-TCGGCATGGGGTCAGGTG-3’)记载的序列构成的寡核苷酸作为测序用引物，除此以外通过与实施例1的(2)同样的方法进行pTrc-m6b＿Cys的核苷酸序列的解析。

[0356] 分别地，将表达载体pTrc-m6b＿Cys所表达的多肽FcγRIIb-m6b＿Cys的氨基酸序列示于序列号86，将编码该多肽的多聚核苷酸的序列示于序列号87。需要说明的是，序列号86记载的氨基酸序列中的、第1位的甲硫氨酸至第22位的丙氨酸为止的氨基酸残基为PelB信号肽，第23位的甲硫氨酸及第24位的甘氨酸为接头，第25位的苏氨酸至第197位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基为改良型FcγRIIb细胞外区域(与序列号1记载的氨基酸序列中的、第
29位的苏氨酸至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基相当)，第198位的甘氨酸及第199位的半胱氨酸为接头，第200位的精氨酸至第205位的甘氨酸为止的氨基酸残基为半胱氨酸标签。另外，上述改良型FcγRIIb细胞外区域所具有的氨基酸置换中，分别地，序列号11的第
68位的缬氨酸(置换(1))与序列号86中第64位相当，序列号11的第80位的谷氨酰胺(置换(2))与序列号86中第76位相当，序列号11的第84位的苏氨酸(置换(3))与序列号86中第80位相当，序列号11的第90位的苏氨酸(置换(4))与序列号86中第86位相当，序列号11的第91位的丝氨酸(置换(5))与序列号86中第87位相当，序列号11的第125位的精氨酸(置换(6))与序列号86中第121位相当。

[0357] 实施例15添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIb-m6b＿Cys的制备[0358] (1)将实施例14中制作的、表达添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIb-m6b＿Cys的转化体接种于添加到2L的挡板烧瓶中的含有100μg/mL的羧苄青霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)，在37℃下好氧振荡培养一晚，由此进行预培养。

[0359] (2)在含有葡萄糖10g/L、酵母提取物20g/L、磷酸三钠十二水合物3g/L、磷酸氢二钠十二水合物9g/L、氯化铵1g/L及羧苄青霉素100mg/L的液体培养基1.8L中接种(1)的培养液180mL，使用3L发酵槽(Biott Corporation制)进行正式培养。设定为温度30℃、pH6.9至7.1、通气量1VVM、溶解氧浓度30％饱和浓度的条件，开始正式培养。在pH的控制中，使用
50％磷酸作为酸、使用14％(w/v)氨水作为碱，就溶解氧的控制而言，通过改变搅拌速度来进行控制，搅拌转速的下限设为500rpm、上限设为1000rpm。培养开始后，在葡萄糖浓度无法测出的时刻，边通过溶解氧(DO)进行控制边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物
83.3g/L、硫酸镁七水合物7.2g/L)。

[0360] (3)作为菌体量的目标，在600nm的吸光度(OD600nm)达到约150时，将培养温度降低至25℃，确认达到设定温度后，以终浓度为0.5mM的方式添加IPTG，接着在25℃下继续培养。

[0361] (4)从培养开始起约48小时后停止培养，将培养液在4℃下通过8000rpm、20分钟的离心分离回收菌体。

[0362] (5)将回收的菌体以达到5mL/1g(菌体)的方式悬浮于20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，使用超声波发生装置(インソネーター201M(商品名)、久保田商事制)，在4℃下以约150W的输出功率将菌体破碎约10分钟。对于菌体破碎液，在4℃下进行2次20分钟、8000rpm的离心分离，回收上清。

[0363] (6)将(5)中得到的上清以流速5mL/分进样至预先用20mM的磷酸缓冲液(8mM磷酸二氢钠、12mM磷酸氢二钠)(pH7.0)平衡化的填充有140mL的TOYOPEARL CM-650M(东曹制)的VL32×250柱(Merckmillipore制)。利用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤后，用含有0.5M的氯化钠的20mM的磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。

[0364] (7)将(6)中得到的洗脱液进样至预先用含有150mM的氯化钠的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡化的填充有IgG琼脂糖凝胶(GE Healthcare制)90mL的XK26/20柱(GEHealthcare制)。利用平衡化中使用的缓冲液进行洗涤后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱。需要说明的是，对于洗脱液，通过加入洗脱液量的1/4量的1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)使pH恢复至中性附近。

[0365] 通过上述纯化，得到约20mg高纯度的添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIb-m6b＿Cys。

[0366] 实施例16改良型重组FcγRIIb-m6b＿Cys固定化凝胶的制作和分离性能评价[0367] (1)将2mL的分离剂用亲水性乙烯基聚合物(东曹制)的表面的羟基用碘代乙酰基活化后，使4mg实施例15中制备的添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIb-m6b＿Cys反应，由此得到FcγRIIb-m6b固定化凝胶。

[0368] (2)将(1)中制作的FcγRIIb-m6b固定化凝胶1.2mL填充于 的不锈钢柱，由此制作FcγRIIb-m6b柱。

[0369] (3)将(2)中制作的FcγRIIb-m6b柱与高效液相色谱装置(东曹制)连接，用50mM的Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.5)的平衡化缓冲液进行平衡化。

[0370] (4)将用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)(pH7.4)稀释为1.0mg/mL的单克隆抗体(利妥昔单抗(全药工业制)；贝伐单抗；英夫利昔单抗)及多克隆抗体(人免疫球蛋白)以流速0.6mL/分钟进样5μL。

[0371] (5)在保持流速0.6mL/分钟的状态下用平衡化缓冲液洗涤10分钟后，通过利用50mM的Tris-甘氨酸缓冲液(pH3.0)的pH梯度(用30分钟使50mM的Tris-甘氨酸缓冲液(pH3.0)达到100％的梯度)洗脱所吸附的单克隆抗体。

[0372] 将结果(洗脱图谱)示于图2。图2中，a)为将利妥昔单抗进样到FcγRIIb-m6b柱时的结果，b)为将贝伐单抗进样到FcγRIIb-m6b柱时的结果，c)将英夫利昔单抗进样到FcγRIIb-m6b柱时的结果，d)为将人免疫球蛋白进样到FcγRIIb-m6b柱时的结果。可知：当单克隆抗体、多克隆抗体的种类不同时，各抗体的结构(氨基酸序列、所带的糖链结构)不同，因此这些结构差异有助于与Fc结合性蛋白的相互作用，按照每种抗体而分离为不同的峰。

[0373] 实施例17改良型重组FcγRIIa-m6的制作

[0374] (1)含有编码改良型重组FcγRIIa-m6的碱基序列的DNA的制作

[0375] 如下所述地制作含有以下碱基序列(序列号91)的DNA，所述碱基序列(序列号91)编码含有上述的置换(7)、置换(8)、置换(9)、置换(10)、置换(11)及置换(12)的改良型重组FcγRIIa-m6的氨基酸序列(序列号89)。

[0376] 分别地，使用下述的参考例2记载的重组载体pET-m6b作为模板DNA、使用由序列号92及序列号93记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p1。

[0377] [表14]

[0378] 表14

[0379]组成 体积
模板DNA 1μL
10pmol/μL PCR引物 各2μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(宝生物公司制) 0.25μL
5×PrimeSTAR缓冲液(宝生物公司制) 10μL
dNTPs(宝生物公司制) 4μL
H2O 定容至50μL

[0380] [表15]

[0381] 表15

[0382]

[0383] 分别地，使用下述的参考例2记载的重组载体pET-m6b作为模板DNA、使用由序列号94及序列号95记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p2。

[0384] 分别地，使用下述的参考例2记载的重组载体pET-m6b作为模板DNA、使用由序列号96及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p3。

[0385] 将PCR产物Am6p1、Am6p2和Am6p3分别用琼脂糖凝胶进行电泳后，切出含有目标PCR产物的凝胶部分，用QIAquick Gel extraction kit(QIAGEN公司制)进行提取，由此进行纯化(以下将同样方法的纯化简记为DNA片段纯化)。将进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p1、Am6p2和Am6p3混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为Am6p4。

[0386] [表16]

[0387] 表16

[0388]组成 体积
PCR产物 各1μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(宝生物公司制) 0.25μL
5×PrimeSTAR缓冲液(宝生物公司制) 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
H2O 定容至50μL

[0389] [表17]

[0390] 表17

[0391]

[0392] 分别地，以PCR产物Am6p4为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p5。

[0393] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p5作为模板DNA、使用由序列号92及序列号98记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p6。

[0394] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p5作为模板DNA、使用由序列号99及序列号100记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p7。

[0395] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p5作为模板DNA、使用由序列号101及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p8。

[0396] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p6、Am6p7和Am6p8混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为Am6p9。

[0397] 以PCR产物Am6p9为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p10。

[0398] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p10作为模板DNA、使用由序列号102及序列号103记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表
14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p11。

[0399] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p10作为模板DNA、使用由序列号104及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Am6p12。

[0400] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物Am6p11和Am6p12混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为Am6p13。

[0401] 以PCR产物Am6p13为模板DNA、以由序列号102及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码改良型重组FcγRIIa-m6的碱基序列的DNA。

[0402] (2)含有编码改良型重组FcγRIIa-m6的DNA的重组载体和具有该重组载体的转化体的制作

[0403] 将上述的含有编码改良型重组FcγRIIa-m6的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体(pETMalE21载体用Hatayama&Ide报道的方法(Protein Expr.Purif.，111，1-8，2015)制作)，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-Am6)。使用重组载体pET-Am6通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株(New England Biolabs公司制)。将得到的转化体命名为转化体Am6。

[0404] 分别使用以下记载的重组载体提取方法及序列解析方法从转化体Am6提取重组载体pET-Am6、和确认编码改良型重组FcγRIIa-m6的DNA及其周边区域的碱基序列。

[0405] 重组载体提取方法：培养转化体(含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl)，37℃下一晚，好氧)，用QIAprep Spin Miniprep Kit提取重组载体。

[0406] 序列解析方法：对于重组载体中编码改良型重组FcγRIIa-m6的DNA及其周边区域，使用基于链终止子法的Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS read Reaction kit(PE Applied Biosystem公司制)供于循环测序反应，利用全自动DNA测序仪ABI Prism 3700DNA analyzer(PE Applied Biosystem公司制)对碱基序列进行解析。需要说明的是，在该解析时，使用由序列号92或序列号97记载的序列构成的寡核苷酸中的任一者作为测序用引物。

[0407] (3)改良型重组FcγRIIa-m6的制造

[0408] 将转化体Am6接种于含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基5mL，在37℃下进行一晚好氧振荡培养，由此进行预培养。在预培养之后，将预培养液以1％(v/v)接种于含有0.01mM的IPTG和50μg/mL的卡那霉素的LB培养基20mL，在20℃下好氧振荡培养24小时而生产改良型重组FcγRIIa-m6。

[0409] 使用BugBuster Protein extraction kit(Novagen公司制)，从自培养液中通过离心分离而收集的菌体中回收含有改良型重组FcγRIIa-m6的可溶性蛋白提取液。可溶性蛋白提取液中的改良型重组FcγRIIa-m6的浓度测定通过以下记载的ELISA方法2进行。以可溶性蛋白提取液中的改良型重组FcγRIIa-m6的浓度为基础进行计算，结果每1L培养液中的改良型重组FcγRIIa-m6的生产率为4.7±0.1mg(n＝2、以2个重复来实施可溶性蛋白提取液的回收及测定)。

[0410] ELISA方法2：将抗FcγRIIa抗体(Human FcγRIIA/CD32a Antibody)(R&D Systems公司制、商品目录编号AF1875)用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整至1μg/mL的浓度后，将其以100μL/孔添加到96孔微孔板(MaxiSorp、Nunc公司制)的各孔中，对抗FcγRIIa抗体进行固定化(4℃下18小时)。固定化结束后，弃掉各孔的溶液，向各孔中添加TBS-B缓冲液(含有137mM的NaCl、2.68mM的KCl和0.5％(w/v)的牛血清白蛋白的20mM的Tris-HCl(pH8.0))进行封闭(30℃下2小时)。用洗涤缓冲液(含有0.05％(w/v)的Tween 20和150mM的NaCl的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5))洗涤各孔后，将所制备的可溶性蛋白提取液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行梯度稀释，将它们添加到孔中而与固定化抗FcγRIIa抗体反应(30℃下1.5小时)。反应结束后，用洗涤缓冲液洗涤各孔，向各孔中添加辣根过氧化物酶标记的抗His-Tag抗体试剂(BETHYL公司制)(用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释)，在30℃下反应1.5小时。反应后，用上述洗涤缓冲液进行各孔的洗涤，向各孔中添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)，测定450nm处的吸光度。以已知浓度的带糖链的重组FcγRIIa(Recombinant Human Fc gamma RIIA/CD32a(R167)Protein，CF)(R&D Systems公司制、商品目录编号1330-CD-050/CF)的测定结果为基准，由测定吸光度确定可溶性蛋白提取液中的改良型重组FcγRIIa-m6的浓度。

[0411] 实施例18改良型重组FcγRIIa-m6的IgG结合性

[0412] 对实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6进行IgG结合性的评价。

[0413] IgG结合性的评价利用上述的ELISA方法1来进行。具体而言，通过在如上述的ELISA方法1中有IgG固定化的条件和变更为上述的ELISA方法中不进行IgG固定化操作、即无IgG固定化的条件这2种条件进行实验(各以2个重复来进行实验)。实验中，将含有实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6的可溶性蛋白提取液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍后作为样品使用。

[0414] 作为对照，使用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)(以下记作样品缓冲液)进行了同样的实验。

[0415] 将改良型重组FcγRIIa-m6的IgG结合性的评价结果示于表18。如表18所示，仅在使用改良型重组FcγRIIa-m6的样品进行上述的ELISA方法1(有IgG固定化的条件)的实验时得到高的检测值。由该结果可确认，改良型重组FcγRIIa-m6具有IgG结合性。

[0416] [表18]

[0417] 表18

[0418]

[0419] 实施例19改良型重组FcγRIIa-m6的热稳定性

[0420] 对实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6进行热稳定性的评价。

[0421] 在热稳定性的评价，使用含有实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6的可溶性蛋白提取液作为样品。将样品用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释200倍，进行4℃下30分钟的处理或50℃下30分钟的热处理。对于各处理后的样品，通过实施例17的(3)记载的ELISA方法2测定改良型重组FcγRIIa-m6的浓度。将4℃下30分钟的处理的改良型重组FcγRIIa-m6的浓度设为100％，算出50℃下30分钟的热处理的改良型重组FcγRIIa-m6的浓度的比例，作为热处理后的检测率(％)。实验以2个重复来进行。其结果是，改良型重组FcγRIIa-m6的50℃下30分钟的热处理后的检测率(％)为86±9％(n＝2)。

[0422] 比较例4重组FcγRIIa的制作

[0423] 制作由序列号88所示的氨基酸序列构成的重组FcγRIIa。

[0424] (1)含有编码重组FcγRIIa的碱基序列(序列号105)的DNA的制作

[0425] 分别地，使用下述的参考例1记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号92及序列号93记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap1。

[0426] 分别地，使用下述的参考例1记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号94及序列号95记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap2。

[0427] 分别地，使用下述的参考例1记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号96及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap3。

[0428] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap1、Ap2和Ap3混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为Ap4。

[0429] 以PCR产物Ap4为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap5。

[0430] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap5作为模板DNA、使用由序列号92及序列号98记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap6。

[0431] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap5作为模板DNA、使用由序列号99及序列号100记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap7。

[0432] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap5作为模板DNA、使用由序列号101及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap8。

[0433] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap6、Ap7和Ap8混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为Ap9。

[0434] 以PCR产物Ap9为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap10。

[0435] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap10作为模板DNA、使用由序列号102及序列号103记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表
14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap11。

[0436] 分别地，使用进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap10作为模板DNA、使用由序列号104及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为Ap12。

[0437] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物Ap11和Ap12混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为Ap13。

[0438] 以PCR产物Ap13为模板DNA、以由序列号102及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码重组FcγRIIa的碱基序列的DNA。

[0439] (2)含有编码重组FcγRIIa的DNA的重组载体和具有该重组载体的转化体的制作[0440] 将上述的含有编码重组FcγRIIa的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-rhFcγRIIa)。使用重组载体pET-rhFcγRIIa通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体rhFcγRIIa。

[0441] 通过与实施例17的(2)记载的方法同样的方法从转化体rhFcγRIIa提取重组载体pET-rhFcγRIIa、和确认编码重组FcγRIIa的DNA及其周边区域的序列。

[0442] (3)重组FcγRIIa的制造

[0443] 通过与实施例17的(3)记载的方法同样的方法使用转化体rhFcγRIIa进行重组FcγRIIa的制造。每1L培养液的重组FcγRIIa的生产率为1.5±0.4mg(n＝2)。将该结果和实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6的生产率的结果汇总示于表19。如表19所示，可知实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6与重组FcγRIIa相比生产率高。即，可知改良型重组FcγRIIa-m6通过具有上述的置换(7)至置换(12)而生产率(表达量)提高。

[0444] [表19]

[0445] 表19

[0446]

[0447] 比较例5

[0448] 对比较例4记载的重组FcγRIIa进行热稳定性的评价。在热稳定性的评价中，使用含有比较例4记载的重组FcγRIIa的可溶性蛋白提取液作为样品。实验通过与实施例19记载的方法同样的方法进行。其结果是，重组FcγRIIa的50℃下30分钟的热处理后的检测率(％)为66±4％(n＝2)。

[0449] 如实施例19所述，改良型重组FcγRIIa-m6的50℃下30分钟的热处理后的检测率为86±9％(n＝2)，可知热稳定性比重组FcγRIIa高。即，可知改良型重组FcγRIIa-m6通过具有上述的置换(7)至置换(12)而热稳定性提高。

[0450] 参考例1重组载体pET-rhFcγRIIb的制作

[0451] 以下记载比较例4记载的重组载体pET-rhFcγRIIb的制作。需要说明的是，重组载体pET-rhFcγRIIb是在由序列号106所示的氨基酸序列构成的重组FcγRIIb的表达中使用的重组载体。

[0452] 以人FcγRIIb的氨基酸序列(序列号107)为基础，使用DNAworks法(Nucleic Acid Res.，30，e43，2002)将密码子转换为大肠杆菌型，设计序列号108所示的、编码人FcγRIIb的氨基酸序列的碱基序列。

[0453] 使用序列号109至序列号150所示的42种寡核苷酸利用两阶段的PCR制作序列号108所示的、编码人FcγRIIb的氨基酸序列的碱基序列的DNA。

[0454] 第一阶段的PCR如下实施：制备组成如表20所示的反应液，然后对该反应液进行94℃下5分钟的热处理，然后将以94℃下30秒的第1步骤、62℃下30秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复25个循环，然后在72℃下处理7分钟，然后冷却到4℃。需要说明的是，表20的DNA mix是指：将序列号109至序列号150所示的42种寡核苷酸分别以一定量取样并混合而成的溶液。

[0455] [表20]

[0456] 表20

[0457]组成 体积
10×Pyrobest缓冲液II(宝生物公司制) 5μL
dNTPs(宝生物公司制) 5μL
DNA mix 1μL
Pyrobest DNA聚合酶(宝生物公司制) 0.5μL
H2O 定容下50μL

[0458] 第二阶段的PCR如下实施：制备组成如表21所示的反应液，然后对该反应液进行94℃下5分钟的热处理，然后将以94℃下30秒的第1步骤、65℃下30秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复25个循环，然后在72℃下处理7分钟，然后冷却到4℃。

[0459] [表21]

[0460] 表21

[0461]组成 体积
10×Pyrobest缓冲液II(宝生物公司制) 5μL
dNTPs(宝生物公司制) 5μL
10pmol/μL的序列号109的寡核苷酸 2μL
10pmol/μL的序列号150的寡核苷酸 2μL
第一阶段的PCR产物 1μL
PyrobestDNA聚合酶(宝生物公司制) 0.5μL
H2O 定容至50μL

[0462] 将进行了DNA片段纯化后的第二阶段的PCR产物的5’末端磷酸化(TaKaRa BKL Kit：宝生物公司)，通过连接反应连接于经限制性内切酶SmaI消化的pUC19质粒载体，转化大肠杆菌JM109株(宝生物公司)。将得到的转化体用添加有50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基培养，使用QIAprep SpinMiniprep Kit(QIAGEN公司制)进行提取，由此制备载体pUC-FcγRIIb。

[0463] 分别地，使用上述的载体pUC-FcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号151及序列号152记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR如下实施：制备组成如表14所示的反应液，然后对该反应液进行98℃下5分钟的热处理，然后将以98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复30个循环，然后进行72℃下5分钟的处理，然后冷却到4℃。将得到的PCR产物命名为rhFcγRIIb-p1。将进行了DNA片段纯化后的PCR产物rhFcγRIIb-p1用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，再次进行DNA片段纯化。将该用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的PCR产物rhFcγRIIb-p1通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体(pETMalE21载体用Hatayama&Ide报道的方法(Protein Expr.Purif.，111，1-8，2015)制作)，由此制作重组载体pET-rhFcγRIIb，使用其通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株(New England Biolabs公司制)。将得到的转化体命名为转化体rhFcγRIIb。将转化体rhFcγRIIb用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养，用QIAprep Spin Miniprep Kit提取，由此制备重组载体pET-rhFcγRIIb。

[0464] 将重组载体pET-rhFcγRIIb中、限制性内切酶XbaI识别序列至HindIII识别序列的DNA的碱基序列示于序列号153。序列号153的5’末端侧起第50位的腺嘌呤至第676位的胸腺嘧啶编码由序列号106所示的氨基酸序列构成的重组FcγRIIb。

[0465] 参考例2重组载体pET-m6b的制作

[0466] 以下记载实施例17记载的重组载体pET-m6b的制作。重组载体pET-m6b是以参考例1记载的重组载体pET-rhFcγRIIb为基础并利用DNA扩增法(PCR法及易错PCR法)按照重组载体pET-a4F3、重组载体pET-m3、重组载体pET-m3(B)、重组载体pET-m6b的顺序改进而制作的。

[0467] (1)重组载体pET-a4F3的制作

[0468] 按照下述的方法制作重组载体pET-a4F3。需要说明的是，重组载体pET-a4F3是在由序列号154所示的氨基酸序列构成的改良型重组FcγRIIb-a4F3的表达中使用的重组载体。

[0469] 分别地，使用参考例1记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物进行易错PCR。易错PCR如下实施：制备组成如表22所示的反应液，然后对该反应液进行95℃下2分钟的热处理，将以95℃下30秒的第1步骤、60℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤为1个循环的反应重复30个循环，最后进行72℃下7分钟的热处理。将得到的PCR产物命名为EP。

[0470] [表22]

[0471] 表22

[0472]组成 浓度/体积
模板DNA 0.05ng/μL
各PCR引物 0.4μM
MnCl2 0.4mM
dATP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dCTP 1mM
dTTP 1mM
缓冲液(将MgCl2调节为5mM) 5μL
GoTaq聚合酶(PromegaCorporation制) 0.05U/μL
H2O 定容至50μL

[0473] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物EP用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，再次进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，使用其通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体用含有50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基进行菌落形成。将上述转化体的各菌落(约1800)接种于含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基400μL，用96孔深孔板在37℃下好氧振荡培养一晚。培养后，将20μL的培养液继续接种于600μL的LB培养基(含有0.05mM的IPTG、0.3％(w/v)的甘氨酸及50μg/mL的卡那霉素)，用96孔深孔板进一步在20℃下好氧振荡培养24小时。培养后，将通过离心操作得到的培养上清作为样品溶液。然后，对于用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍的各样品溶液，通过上述的ELISA方法1(使用上述的通过离心操作得到的培养上清的样品溶液代替含有改良型重组FcγRIIa的样品溶液)的测定值评价其中所含的可溶性的改良型重组FcγRIIb的量。由利用该ELISA方法1得到的评价结果筛选、获得转化体(以下记作转化体a4F3)。

[0474] 通过与实施例17的(2)记载的方法同样的方法从转化体a4F3提取重组载体pET-a4F3、和确认编码改良型重组FcγRIIb-a4F3(序列号154)的DNA(序列号155)及其周边区域的序列。

[0475] (2)重组载体pET-m3的制作

[0476] 通过下述的方法制作重组载体pET-m3。需要说明的是，重组载体pET-m3是在由序列号156所示的氨基酸序列构成的改良型重组FcγRIIb-m3的表达中使用的重组载体。

[0477] 分别地，使用参考例1记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号92及序列号157记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m3p1。

[0478] 分别地，使用上述的重组载体pET-a4F3作为模板DNA、使用由序列号158及序列号159记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m3p2。

[0479] 分别地，使用参考例1记载的重组载体pET-rhFcγRIIb作为模板DNA、使用由序列号160及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m3p3。

[0480] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m3p1、m3p2及m3p3混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此而实施。将得到的PCR产物命名为m3p4。

[0481] 以PCR产物m3p4为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码改良型重组FcγRIIb-m3的碱基序列的DNA。

[0482] 将上述的含有编码改良型重组FcγRIIb-m3的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m3)。使用重组载体pET-m3通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m3。

[0483] 通过与实施例17的(2)记载的方法同样的方法从转化体m3提取重组载体pET-m3、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m3(序列号156)的DNA(序列号161)及其周边区域的碱基序列。

[0484] (3)重组载体pET-m3(B)的制作

[0485] 通过下述的方法制作重组载体pET-m3(B)。需要说明的是，重组载体pET-m3(B)是在由序列号156所示的氨基酸序列构成的改良型重组FcγRIIb-m3的表达中使用的重组载体。重组载体pET-m3(B)以重组载体pET-m3为基础并进行了如下改造：在编码改良型重组FcγRIIb-m3的氨基酸序列的一部分(序列号156的氨基酸序列的N末端侧第107位丝氨酸至第109位脯氨酸)的DNA区域中，设置限制性内切酶BamHI识别序列。

[0486] 分别地，使用上述的重组载体pET-m3作为模板DNA、使用由序列号92及序列号162记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m3(B)p1。

[0487] 分别地，使用上述的重组载体pET-m3作为模板DNA、使用由序列号163及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m3(B)p2。

[0488] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m3(B)p1及m3(B)p2混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m3(B)p3。

[0489] 以PCR产物m3(B)p3为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有如下碱基序列的DNA，所述碱基序列具有限制性内切酶BamHI识别序列、且编码与上述的改良型重组FcγRIIb-m3相同的氨基酸序列。将该DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m3(B))。使用重组载体pET-m3(B)通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m3(B)。

[0490] 通过与实施例17的(2)记载的方法同样的方法从转化体m3(B)提取重组载体pET-m3(B)、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m3(序列号156)的DNA(序列号164)及其周边区域的碱基序列。

[0491] (4)重组载体pET-m6b的制作

[0492] 通过下述方法制作重组载体pET-m6b。需要说明的是，重组载体pET-m6b是在由序列号165所示的氨基酸序列构成的改良型重组FcγRIIb-m6b的表达中使用的重组载体。

[0493] 分别地，使用上述的重组载体pET-m3(B)作为作为模板DNA、使用由序列号92及序列号166记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m5cp1。

[0494] 分别地，使用上述的重组载体pET-m3(B)作为模板DNA、使用由序列号167及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m5cp2。

[0495] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m5cp1和m5cp2混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m5cp3。

[0496] 以PCR产物m5cp3为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，并命名为m5cp4。

[0497] 分别地，使用上述的PCR产物m5cp4作为模板DNA、使用由序列号92及序列号168记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m6bp1。

[0498] 分别地，使用上述的PCR产物m5cp4作为模板DNA、使用由序列号169及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。将得到的PCR产物命名为m6bp2。

[0499] 将进行了DNA片段纯化后的PCR产物m6bp1和m6bp2混合，然后制备组成如表16所示的反应液，使该反应液按照表17所示的条件反应，由此实施PCR。将得到的PCR产物命名为m6bp3。

[0500] 以PCR产物m6bp3为模板DNA、以由序列号92及序列号97记载的序列构成的寡核苷酸为PCR引物实施PCR。PCR通过制备组成如表14所示的反应液、然后使该反应液按照表15所示的条件反应来实施。对得到的PCR产物进行DNA片段纯化，由此得到含有编码改良型重组FcγRIIb-m6b的碱基序列的DNA。

[0501] 将上述的含有编码改良型重组FcγRIIb-m6b的碱基序列的DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后，进行DNA片段纯化，通过连接反应连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的pETMalE21载体，由此制作重组载体(以下记作重组载体pET-m6b)。使用重组载体pET-m6b通过氯化钙法转化大肠杆菌NiCo21(DE3)株。将得到的转化体命名为转化体m6b。

[0502] 通过与实施例17的(2)记载的方法同样的方法从转化体m6b提取重组载体pET-m6b、和确认编码改良型重组FcγRIIb-m6b的DNA(序列号170)及其周边区域的碱基序列。

[0503] 实施例20改良型重组FcγRIIa-m6的酸稳定性

[0504] 对实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6进行酸稳定性的评价。

[0505] 将含有实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6的可溶性蛋白提取液的样品溶液用纯水稀释至30μg/mL后，将上述稀释后的样品溶液100μL与0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)200μL混合，在30℃下分别静置24小时、48小时、72小时。

[0506] 通过实施例17的(3)记载的ELISA方法2测定利用测定用甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行酸处理后的蛋白质的抗体结合活性、和未进行上述酸处理时的蛋白质的抗体结合活性。然后，将进行酸处理时的抗体结合活性除以未进行酸处理时的抗体结合活性，由此算出残存活性。

[0507] 比较例6重组FcγRIIa的酸稳定性

[0508] 对比较例4记载的重组FcγRIIa进行酸稳定性的评价。酸稳定性的评价除了使用含有比较例4记载的重组FcγRIIa的可溶性蛋白提取液作为样品以外，通过与实施例20记载的方法同样的方法进行。

[0509] 将改良型重组FcγRIIa-m6(实施例20)及重组FcγRIIa(比较例6)的酸稳定性的评价结果一并示于表23。如表23所示，可知实施例17记载的改良型重组FcγRIIa-m6与比较例4记载的重组FcγRIIa相比酸稳定性(酸处理后的残存活性)高。由以上结果可知，上述改良型重组FcγRIIa-m6与上述重组FcγRIIa相比，热稳定性提高(实施例19及比较例5)，并且酸稳定性也提高。

[0510] [表23]

[0511] 表23

[0512]

[0513] 实施例21添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIa-Am6＿Cys的制作[0514] (1)以含有序列号91记载的多聚核苷酸的表达载体pET-Am6为模板实施PCR，所述序列号91记载的多核苷酸编码实施例17中制作的由序列号89记载的氨基酸序列构成的蛋白质。该PCR中的引物使用由序列号171(5’-TAGCCATGGGCATGCGTACCGAAGATCTGCCGAAAGC-3’)及序列号172(5’-CCCAAGCTTATCCGCAGGTATCGTTGCGGCAGCCCTGCACGGTGATAGTAACCGGCTTGCTGCTATA-3’)记载的序列构成的寡核苷酸。PCR如下实施：制备组成如表14所示的反应液，然后对该反应液进行98℃下5分钟的热处理，将以98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤为1个循环的反应重复30个循环。

[0515] (2)将(1)中得到的多聚核苷酸纯化，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化后的通过WO2015/199154号记载的方法制作的表达载体pTrc-PelBV3，使用该连接产物转化大肠杆菌W3110株。

[0516] (3)将得到的转化体用含有100μg/mL的羧苄青霉素的LB培养基培养后，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制)得到表达载体pTrc-Am6＿Cys。

[0517] (4)使用由序列号173(5’-TGTGGTATGGCTGTGCAGG-3’)或序列号174(5’-TCGGCATGGGGTCAGGTG-3’)记载的序列构成的寡核苷酸作为测序用引物，除此以外通过与实施例17的(2)同样的方法进行pTrc-Am6＿Cys的核苷酸序列的解析。

[0518] 分别地，将表达载体pTrc-Am6＿Cys所表达的多肽FcγRIIa-Am6＿Cys的氨基酸序列示于序列号175，将编码该多肽的多聚核苷酸的序列示于序列号176。需要说明的是，序列号175记载的氨基酸序列中第1位的甲硫氨酸至第22位的丙氨酸为止的氨基酸残基为PelB信号肽，第23位的甲硫氨酸及第24位的甘氨酸为接头，第25位的谷氨酰胺至第197位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基为改良型FcγRIIa细胞外区域(与序列号89记载的氨基酸序列中第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基相当)，第198位的甘氨酸及第199位的半胱氨酸为接头，第200位的精氨酸至第205位的甘氨酸为止的氨基酸残基为半胱氨酸标签。另外，上述改良型FcγRIIa细胞外区域所具有的氨基酸置换中，分别地，序列号89的第68位的缬氨酸(置换(7))与序列号175中第64位相当，序列号89的第80位的谷氨酰胺(置换(8))与序列号175中第76位相当，序列号89的第84位的苏氨酸(置换(9))与序列号175中第80位相当，序列号89的第90位的苏氨酸(置换(10))与序列号175中第86位相当，序列号89的第91位的丝氨酸(置换(11))与序列号175中第87位相当，序列号89的第125位的精氨酸(置换(12))与序列号175中第121位相当。

[0519] 实施例22添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIa-Am6＿Cys的制备[0520] (1)将实施例21中制作的、表达添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIa-Am6＿Cys的转化体接种于添加到2L的挡板烧瓶中的含有100μg/mL的羧苄青霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)，在37℃下好氧振荡培养一晚，由此进行预培养。

[0521] (2)在含有葡萄糖10g/L、酵母提取物20g/L、磷酸三钠十二水合物3g/L、磷酸氢二钠十二水合物9g/L、氯化铵1g/L及羧苄青霉素100mg/L的液体培养基1.8L中接种(7)的培养液180mL，使用3L发酵槽(Biott Corporation制)进行正式培养。设定为温度30℃、pH6.9至7.1、通气量1VVM、溶解氧浓度30％饱和浓度的条件，开始正式培养。在pH的控制中，分别使用50％磷酸作为酸、使用14％(w/v)氨水作为碱，就溶解氧的控制而言，通过改变搅拌速度来进行控制，搅拌转速的下限设为500rpm、上限设为1000rpm。培养开始后，在葡萄糖浓度无法测出的时刻，边通过溶解氧(DO)进行控制边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸镁七水合物7.2g/L)。

[0522] (3)作为菌体量的目标，在600nm的吸光度(OD600nm)达到约150时，将培养温度降低至25℃，确认达到设定温度后，以终浓度为0.5mM的方式添加IPTG，接着在25℃下继续培养。

[0523] (4)从培养开始起约约48小时后停止培养，将培养液在4℃下通过8000rpm、20分钟的离心分离回收菌体。

[0524] (5)将回收的菌体以达到5mL/1g(菌体)的方式悬浮于20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，使用超声波发生装置(インソネーター201M(商品名)、久保田商事制)，在4℃下以约150W的输出功率将菌体破碎约10分钟。对于菌体破碎液，在4℃下进行2次20分钟、8000rpm的离心分离，回收上清。

[0525] (6)将(5)中得到的上清以流速5mL/分钟进样至预先用20mM的磷酸缓冲液(8mM磷酸二氢钠、12mM磷酸氢二钠)(pH7.0)平衡化的填充有140mL的TOYOPEARL CM-650M(东曹制)的VL32×250柱(Merckmillipore制)，利用平衡化中使用的缓冲液洗涤后，用含有0.5M的氯化钠的20mM的磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱。

[0526] (7)将(6)中得到的洗脱液进样至预先用含有150mM的氯化钠的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡化的填充有IgG琼脂糖凝胶(GE Healthcare制)90mL的XK26/20柱(GE Healthcare制)。利用平衡化中使用的缓冲液洗涤后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量的1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)而使pH恢复到中性附近。

[0527] 通过上述纯化，得到高纯度的添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIa-Am6＿Cys约20mg。

[0528] 实施例23改良型重组FcγRIIa-Am6＿Cys固定化凝胶的制作和分离性能评价[0529] (1)将2mL的分离剂用亲水性乙烯基聚合物(东曹制)的表面的羟基用碘代乙酰基活化后，使4mg实施例22中制备的添加了半胱氨酸标签的改良型重组FcγRIIa-Am6＿Cys反应，由此得到FcγRIIa-Am6固定化凝胶。

[0530] (2)将(1)中制作的FcγRIIa-Am6固定化凝胶1.2mL填充于 的不锈钢柱，由此制作FcγRIIa-Am6柱。

[0531] (3)将(2)中制作的FcγRIIa-Am6柱与高效液相色谱装置(东曹制)连接，用50mM的Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.5)的平衡化缓冲液进行平衡化。

[0532] (4)将用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)(pH7.4)稀释为1.0mg/mL的单克隆抗体(利妥昔单抗(全药工业制)；贝伐单抗；英夫利昔单抗)及多克隆抗体(人免疫球蛋白)以流速0.6mL/分钟进样5μL。

[0533] (5)在保护流速0.6mL/分钟的状态下用平衡化缓冲液洗涤10分钟后，通过利用50mM的Tris-甘氨酸缓冲液(pH3.0)的pH梯度(用30分钟使50mM的Tris-甘氨酸缓冲液(pH3.0)达到100％的梯度)洗脱所吸附的单克隆抗体。

[0534] 将结果(洗脱图谱)示于图3。图3中，a)为将利妥昔单抗进样到FcγRIIa-Am6柱时的结果，b)为将贝伐单抗进样到FcγRIIa-Am6柱时的结果，c)为将英夫利昔单抗进样到FcγRIIa-Am6柱时的结果，d)为将人免疫球蛋白进样到FcγRIIa-Am6柱时的结果。可知：当单克隆抗体、多克隆抗体的种类不同时，各抗体的结构(氨基酸序列、所带的糖链结构)不同，因此这些结构差异有助于与Fc结合性蛋白的相互作用，按照每种抗体而分离为不同的峰。

[0535] 产业上的可利用性

[0536] 本发明的改良型重组FcγRIIb及FcγRIIa作为包括诊断试剂在内的药品、生化试剂及用于对IgG进行纯化或分析的亲和色谱用配体是有用的。