[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组及其应用。

[0002] 侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)又称侵袭性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)、深部真菌感染(deep fungal infection,DFI)，是指真菌侵入人体组织、血液，在其中生长和繁殖，引起炎症反应，并导致组织损害、器官功能障碍的病理生理过程。近二三十年来，随着实体器官和造血干细胞移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂等新技术在临床中的广泛应用，使侵袭性真菌病的发病率和病死率逐年升高，已日益成为导致住院患者死亡的主要原因之一。由于感染侵袭性真菌病多发于入住ICU，高龄，糖尿病，恶性血液系统疾病，念珠菌定植，侵袭性操作，应用抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等人群中，其机体免疫力低下，重症死亡率高，因此对侵袭性真菌感染的早期检测及确定感染菌种有极为重要的意义。

[0003] 毛霉目真菌属于接合菌纲，在自然界中种类多，可存在于人的口咽部，是人体的机会致病菌，其中引起人类感染的病原体主要包括稻根霉菌、伞状毛霉菌、卷枝毛霉菌及微小根毛霉等，可导致毛霉菌病(mucormycosis)。该病发病急，进展快，死亡率高。易感人群为免疫抑制者，糖尿病酮酸中毒症患者，去铁胺治疗的慢性肾病患者等。

[0004] 现有的侵袭性真菌感染检测方法主要包括常规检查法和特殊检查法两种。其中常规检查法主要包括：1)真菌显微镜检，即直接涂片染色镜检；2)真菌培养鉴定；3)组织病理学检查。特殊检查法主要包括：1)血清学检查；2)分子生物学检查。其中常规检查法仍被视为确诊侵袭性真菌感染的基石，但其存在敏感度较低，操作繁复，阴性结果不能排除诊断，检测周期较长(通常需要几天到几周的时间)等问题，而导致延误病情及用药，增加死亡率等；血清学检测难以排除真菌某些属的种间抗原抗体交叉反应从而导致误判。相较前两种方法，分子生物学技术具有高特异性和高准确性的优点，并可从基因水平阐明真菌种群之间和中内的分类学关系，因而在近年来越来越得到广泛认可和应用。目前建立的相关分子学诊断方法有普通PCR方法、脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR技术(RTFQ-PCR)等，其共有的问题是对实验操作要求较高，检测时间较长(2.5h-3h)左右。因此，建立快速准确的分子诊断方法，为临床提供早期诊疗依据是解决现状的关键。

[0219] 本发明公开了一种引物组及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0220] 本发明提供的引物组及其应用中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。

[0221] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0222] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0223] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0224] 反应液为博奥生物集团有限公司产品，产品目录号为CP.440020。

[0225] DNA拷贝数的计算方法如下：

[0226] 1A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；

[0227] 核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；

[0228] 平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；

[0229] 摩尔＝6.02×1023；

[0230] 平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；

[0231] 拷贝数计算公式:

[0232] (6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。

[0233] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0234] 实施例1引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ的制备

[0235] 试剂盒由四个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测一种念珠菌。

[0236] 用于检测稻根霉菌引物组如下(5’→3’)：

[0237] 外引物F3(SEQ ID No.1)：GGTAGCAAATCCAGTC；

[0238] 外引物B3(SEQ ID No.2)：CCTCCCAAGCGATC；

[0239] 内引物FIP(SEQ ID No.3)：

[0240] ACGGGTCGTGTCAAGGTTCTGGACTGCCTCCAA；

[0241] 内引物BIP(SEQ ID No.4)：

[0242] CGTCCATCTTGGCGATGTTGGGAATCCCCATGTTCA；

[0243] 环引物LF(SEQ ID No.5)：CCGGAGCCAATGACCT；

[0244] 环引物LB(SEQ ID No.6)：CTCAATCGGTCCATGC。

[0245] 用于检测伞状毛霉菌引物组如下(5’→3’)：

[0246] 外引物F3(SEQ ID No.7)：GGGTAAAAAAGGTGGATG；

[0247] 外引物B3(SEQ ID No.8)：CATTGGATCCCTTTTTC；

[0248] 内引物FIP(SEQ ID No.9)：

[0249] CCAAGAGGTGAGGTTGGGATGTTGCCTCTTCAGCTTC；

[0250] 内引物BIP(SEQ ID No.10)：

[0251] TTCTGGTATTCACGAGACTGATGTTGGAGTACAAGTCCTTAC；

[0252] 环引物LF(SEQ ID No.11)：AGAGAGCCTCGGGA；

[0253] 环引物LB(SEQ ID No.12)：CATCATGAAGTGCGAT。

[0254] 用于检测卷枝毛霉菌引物组如下(5’→3’)：

[0255] 外引物F3(SEQ ID No.13)：GTTTGCTAGACCTGAATGG；

[0256] 外引物B3(SEQ ID No.14)：CTGCAAGAGCTGTTCGAA；

[0257] 内引物FIP(SEQ ID No.15)：

[0258] CACGACTGGTGCCATCGCCTGTTCCTCCACCTC；

[0259] 内引物BIP(SEQ ID No.16)：

[0260] ACTCACAAATTGTCTGACGTGCGAGCACCCTCTGATTCACAA；

[0261] 环引物LF(SEQ ID No.17)：ATTTGAATAGAGGGACGA；

[0262] 环引物LB(SEQ ID No.18)：AAGGCGAATGGTAACG。

[0263] 用于检测微小根毛霉引物组如下(5’→3’)：

[0264] 外引物F3(SEQ ID No.19)：GGGTACGTCTAGTTC；

[0265] 外引物B3(SEQ ID No.20)：AAGTTCAGATCCATAGTTG；

[0266] 内引物FIP(SEQ ID No.21)：

[0267] ACAACATACAAATTGTTCGGGTACTTTGGATTTGCGGTG；

[0268] 内引物BIP(SEQ ID No.22)：

[0269] CCTTGAGGGTTTGCATTGGTGGTTGATTGACCTTTATACTT；

[0270] 环引物LF(SEQ ID No.23)：TTGAACGGATGAAAATCCA；

[0271] 环引物LB(SEQ ID No.24)：TACCAGTGTGCTTCGA。

[0272] 用于检测稻根霉菌的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测伞状毛霉菌的引物组命名为引物组Ⅱ。用于检测卷枝毛霉菌的引物组命名为引物组Ⅲ。用于检测微小根毛霉的引物组命名为引物组Ⅳ。

[0273] 检测念珠菌引物组合由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ组成，该引物组合中，各单链DNA各自独立包装。

[0274] 引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；

[0275] 引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1；

[0276] 引物组Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。

[0277] 引物组Ⅳ中，引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1。

[0278] 实施例2毛霉菌引物组合的特异性

[0279] 一、待测样本的制备

[0280] 待测样本1：稻根霉菌质粒

[0281] 待测样本2：伞状毛霉菌质粒

[0282] 待测样本3：卷枝毛霉菌质粒

[0283] 待测样本4：微小根毛霉质粒

[0284] 稻根霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为AB167714.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为稻根霉菌检测基因质粒。

[0285] 伞状毛霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为GQ342716.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为伞状毛霉菌检测基因质粒。

[0286] 卷枝毛霉菌检测基因质粒：在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS间插入Genebank号为JF723861.2的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为卷枝毛霉菌检测基因质粒。

[0287] 微小根毛霉检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为JQ683230.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为微小根毛霉检测基因质粒。

[0288] 二、待测样本的检测

[0289] 各个待测样本分别进行如下步骤进行检测：

[0290] 以步骤一的基因组为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ对步骤一制备的四个质粒—稻根霉菌待测基因质粒DNA、伞状毛霉菌待测基因质粒DNA、卷枝毛霉菌待测基因质粒DNA和微小根毛霉待测基因质粒DNA进行环介导等温扩增检测，每个引物组合均检测四种质粒。

[0291] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ或引物组Ⅳ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0292] 反应条件：65℃恒温50min。

[0293] 反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

[0294] 采用引物组Ⅰ的结果见图1。只有当待测样本为稻根霉菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图1中稻根霉菌所指曲线)。当待测样本为待测样本2、3或4的时候均不显示阳性扩增曲线。图1中为待测样本1的结果；图1中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本2、待测样本3和待测样本4的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0295] 采用引物组Ⅱ的结果见图2。只有当待测样本为伞状毛霉菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图2中伞状毛霉菌所指曲线)。当待测样本为待测样本1、3、4的时候均不显示阳性扩增曲线。图2中为待测样本2的结果；图2中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1、待测样本3、待测样本4的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0296] 采用引物组Ⅲ的结果见图3。只有当待测样本为卷枝毛霉菌基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图3中卷枝毛霉菌所指曲线)。当待测样本为待测样本1、2、4的时候均不显示阳性扩增曲线。图3中为待测样本3的结果；图3中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1、待测样本2、待测样本4的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0297] 采用引物组Ⅳ的结果见图4。只有当待测样本为微小根毛霉基因组的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线，图4中微小根毛霉所指曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3的时候均不显示阳性扩增曲线。图4中为待测样本4的结果；图4中非“S型”扩增曲线中有各有一条分别为待测样本1、待测样本2、待测样本3的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0298] 以上结果表明，本发明提供的毛霉目真菌引物组合中的四个引物组分别对其靶标基因有很高的特异性。

[0299] 实施例3毛霉目真菌鉴定引物组合的灵敏性

[0300] 待测样本1：实施例2的稻根霉菌待测基因质粒DNA。

[0301] 待测样本2：实施例2的伞状毛霉菌待测基因质粒DNA。

[0302] 待测样本3：实施例2的卷枝毛霉菌待测基因质粒DNA。

[0303] 待测样本4：实施例2的微小根毛霉待测基因质粒DNA。

[0304] 1、待测基因质粒DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。

[0305] 2、以步骤1得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ或引物组Ⅳ进行环介导等温扩增。

[0306] 待测样本为待测样本1时，采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时，采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本3时，采用引物组Ⅲ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本4时，采用引物组Ⅳ进行环介导等温扩增。

[0307] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为3 2
CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为10、10或101)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ或引物组Ⅳ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0308] 反应条件：65℃恒温50min。

[0309] 反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

[0310] 根据稀释液中基因组拷贝数的不同，共如下12个反应体系：

[0311] 反应体系1：1μL稀释液中含有的稻根霉菌质粒DNA拷贝数分别为103；

[0312] 反应体系2：1μL稀释液中含有的稻根霉菌质粒DNA拷贝数分别为5×102；

[0313] 反应体系3：1μL稀释液中含有的稻根霉菌质粒DNA拷贝数分别为102；

[0314] 反应体系4：1μL稀释液中含有的伞状毛霉菌质粒DNA拷贝数分别为103；

[0315] 反应体系5：1μL稀释液中含有的伞状毛霉菌质粒DNA拷贝数分别为5×102；

[0316] 反应体系6：1μL稀释液中含有的伞状毛霉菌质粒DNA拷贝数分别为102；

[0317] 反应体系7：1μL稀释液中含有的卷枝毛霉菌质粒DNA拷贝数分别为103；

[0318] 反应体系8：1μL稀释液中含有的卷枝毛霉菌质粒DNA拷贝数分别为5×102；

[0319] 反应体系9：1μL稀释液中含有的卷枝毛霉菌质粒DNA拷贝数分别为102；

[0320] 反应体系10：1μL稀释液中含有的微小根毛霉质粒DNA拷贝数分别为103；

[0321] 反应体系11：1μL稀释液中含有的微小根毛霉质粒DNA拷贝数分别为5×102；

[0322] 反应体系12：1μL稀释液中含有的微小根毛霉质粒DNA拷贝数分别为102。

[0323] 每个反应体系设置20次重复。

[0324] 如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

[0325] 结果见图5～图16。

[0326] 引物组Ⅰ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图5)和5×102(图6)时20个检测均可检测出来且重复性好，102(图7)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅰ的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。

[0327] 引物组Ⅱ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图8)和5×102(图9)时20个检测均可检测出来且重复性好，102(图10)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅱ的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。

[0328] 引物组Ⅲ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图11)和5×102(图12)时20个检测均可检测出来且重复性好，102(图13)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组Ⅲ的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。

[0329] 引物组Ⅳ检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图14)和5×102(图15)时20个检测均可检测出来且重复性好，102(图16)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，2
因此引物组Ⅳ的灵敏度为5×10个拷贝数/反应体系。

[0330] 实施例4反应体系的筛选

[0331] 待测样本：微小根毛霉检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为JQ683230.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为微小根毛霉检测基因质粒。

[0332] 1、提取待测样本的质粒DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。

[0333] 2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1制备的引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。

[0334] 反应体系1(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。

[0335] 反应体系2(10μL)：6.7μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1.2μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。

[0336] 反应体系3(10μL)：6.5μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1.3μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。

[0337] 反应体系4(10μL)：7.3μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、0.8μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。

[0338] 反应体系5(10μL)：7.5μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、0.7μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*2
10copies)，补水至10μL。

[0339] 引物混合物即引物组Ⅰ的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0340] 反应条件：65℃恒温50min。

[0341] 反应过程中，采用恒温扩增仪检测荧光信号。

[0342] 每个反应体系设置8次重复。

[0343] 如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

[0344] 结果见图17-图21。引物组合检测靶标基因在反应体系1、反应体系2和反应体系4时8个检测均可检测出来且重复性好，引物组合检测靶标基因在反应体系3和反应体系5时8个检测不可完全出峰且重复性较差。

[0345] 因此确定反应体系配比为：反应体系10μL：(6.7～7.3)μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、(0.8～1.2)μL引物组合、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5*102copies)，补水至10μL。

[0346] 实施例5利用毛霉目真菌鉴定引物组合检测临床样本

[0347] 待测样本为如下样本一、样本二、样本三或样本四：

[0348] 样本一：已通过PCR测序鉴定确认含有稻根霉菌的人的肺泡灌洗液；

[0349] 样本二：已通过PCR测序鉴定确认含有伞状毛霉菌的人的肺泡灌洗液；

[0350] 样本三：已通过PCR测序鉴定确认含有卷枝毛霉菌的人的肺泡灌洗液；

[0351] 样本四：已通过PCR测序鉴定确认含有微小根毛霉的人的肺泡灌洗液。

[0352] 1、提取待测样本的总DNA。

[0353] 2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组对这四个样本进行环介导等温扩增，每个引物组合均检测四种样本。

[0354] 反应体系与反应条件均同实施例2。

[0355] 反应过程中，采用恒温扩增仪检测荧光信号。

[0356] 样本一的结果见图22。只有采用引物组Ⅰ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的其它三个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图22为引物组Ⅰ的结果；图22中非“S型”扩增曲线中各有一条分别为引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0357] 样本二的结果见图23。只有采用引物组Ⅱ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅱ以外的其它三个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图23为引物组Ⅱ的结果；图23中非“S型”扩增曲线中各有一条分别为引物组Ⅰ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0358] 样本三的结果见图24。只有采用引物组Ⅲ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅲ以外的其它三个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图24为引物组Ⅲ的结果；图24中非“S型”扩增曲线中各有一条分别为引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅳ的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0359] 样本四的结果见图25。只有采用引物组Ⅳ检测的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅳ以外的其它三个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线，与实际情况一致。图25为引物组Ⅳ的结果；图25中非“S型”扩增曲线中各有一条分别为引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ的结果，其余均为未添加模板的结果。

[0360] 以上结果表明，利用本发明提供的念珠菌鉴定引物组合可以进行4种常见毛霉目真菌的检测，结果准确可靠。

[0361] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0362] 对比试验

[0363] 1伞状毛霉菌

[0364] 对比引物序列：

[0365] 表1

[0366]F3-1 SEQ ID No.25 gggtaacgagcggta
B3-1 SEQ ID No.26 atccctttttccctttt
FIP-1 SEQ ID No.27 aagaggtgaggttgggatgttgcctcttcagcttcc
BIP-1 SEQ ID No.28 gcttctggtattcacgagactgatgttggagtacaagtcctt
LF-1 SEQ ID No.29 agagagcctcgggagc
LB-1 SEQ ID No.30 taactccatcatgaagt

[0367] 采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。

[0368] 灵敏度对比：

[0369] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。

[0370] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0371] 反应条件：65℃恒温50min。

[0372] 反应引物：现用引物与对比引物

[0373] 结果：现采用引物重复性优于对比引物。

[0374] 特异性对比：

[0375] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行三种无关菌模板的扩增。

[0376] 稻根霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为AB167714.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为稻根霉菌检测基因质粒。

[0377] 卷枝毛霉菌检测基因质粒：在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS间插入Genebank号为JF723861.2的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为卷枝毛霉菌检测基因质粒。

[0378] 微小根毛霉检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为JQ683230.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为微小根毛霉检测基因质粒。

[0379] 制备上述三种质粒。

[0380] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ或引物组Ⅱ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0381] 反应条件：65℃恒温50min。

[0382] 反应引物：现用引物与对比引物

[0383] 结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现稻根霉菌非特异性扩增。

[0384] 2稻根霉菌

[0385] 对比引物序列：

[0386] 表2

[0387]F3-2 SEQ ID No.31 GACTGCCTCCAAACC
B3-2 SEQ ID No.32 CGCTTTACCTGATATCGC
FIP-2 SEQ ID No.33 GCATGGACCGATTGAGGATTGACAGGCTCCGGTACCTA
BIP-2 SEQ ID No.34 CTTGGGTGAACATGGGGAGGGAAACTTGTCAACGGCT
LF-2 SEQ ID No.35 AGACATCGCCAAGAT
LB-2 SEQ ID No.36 GGAGGCTGCTTCGA

[0388] 采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。

[0389] 灵敏度对比：

[0390] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。

[0391] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0392] 反应条件：65℃恒温50min。

[0393] 反应引物：现用引物与对比引物

[0394] 结果：现采用引物重复性优于对比引物。

[0395] 特异性对比：

[0396] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行三种无关菌模板的扩增。

[0397] 卷枝毛霉菌检测基因质粒：在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS间插入Genebank号为JF723861.2的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为卷枝毛霉菌检测基因质粒。

[0398] 微小根毛霉检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为JQ683230.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为微小根毛霉检测基因质粒。

[0399] 伞状毛霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为GQ342716.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为伞状毛霉菌检测基因质粒。

[0400] 制备上述三种质粒。

[0401] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0402] 反应条件：65℃恒温50min。

[0403] 反应引物：现用引物与对比引物

[0404] 结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现微小根毛霉/卷枝毛霉菌/伞状毛霉菌的非特异性扩增。

[0405] 3卷枝毛霉菌

[0406] 对比引物序列：

[0407] 表3

[0408]F3-3 SEQ ID No.37 CTCCACCTCAAGTTCG
B3-3 SEQ ID No.38 CAAACATCCATTCAACATC
FIP-3 SEQ ID No.39 GCACGTCAGACAATTTGTGAGTCACTCTATTCAAATGGATGG
BIP-3 SEQ ID No.40 GAATGGTAACGTGAAGCTGCAAGAGCTGTTCGAATT
LF-3 SEQ ID No.41 TCGTCTTCACCACGA
LB-3 SEQ ID No.42 CGTTGTGAATCAGAGGG

[0409] 采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。

[0410] 灵敏度对比：

[0411] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。

[0412] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0413] 反应条件：65℃恒温50min。

[0414] 反应引物：现用引物与对比引物

[0415] 结果：现采用引物重复性优于对比引物。

[0416] 特异性对比：

[0417] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行三种无关菌模板的扩增。

[0418] 稻根霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为AB167714.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为稻根霉菌检测基因质粒。

[0419] 微小根毛霉检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为JQ683230.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为微小根毛霉检测基因质粒。

[0420] 伞状毛霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为GQ342716.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为伞状毛霉菌检测基因质粒。

[0421] 制备上述三种质粒。

[0422] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的混合模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0423] 反应条件：65℃恒温50min。

[0424] 反应引物：现用引物与对比引物

[0425] 结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现稻根霉菌非特异性扩增。

[0426] 4微小根毛霉

[0427] 对比引物序列：

[0428]F3-4 SEQ ID No.43 AGAAATGATTCAAGACGA
B3-4 SEQ ID No.44 GGGGTTAATAAAGATACTGA
FIP-4 SEQ ID No.45 CATTTGCTACGCTCTTCAAAACAACTTTAAGCAATGGATCAC
BIP-4 SEQ ID No.46 AAGTAATGCGATCTGCAGCCTTGACGTACCCAATGGATG
LF-4 SEQ ID No.47 TGCGAGAACCAA
LB-4 SEQ ID No.48 TCATCGAATTCTCGAA

[0429] 采用现引物序列与对比引物序列，进行对比试验。

[0430] 灵敏度对比：

[0431] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行检测限级的20重复扩增。

[0432] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为5×102)，补水至10μL。引物混合物即引物组Ⅰ或引物组Ⅱ中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0433] 反应条件：65℃恒温50min。

[0434] 反应引物：现用引物与对比引物

[0435] 反应重复：20重复

[0436] 结果：现采用引物重复性优于对比引物。

[0437] 特异性对比：

[0438] 实验设计：采用现引物和对比引物，进行三种无关菌模板的扩增。

[0439] 稻根霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为AB167714.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为稻根霉菌检测基因质粒。

[0440] 卷枝毛霉菌检测基因质粒：在pUC57质粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS间插入Genebank号为JF723861.2的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为卷枝毛霉菌检测基因质粒。

[0441] 伞状毛霉菌检测基因质粒：在pEasy-blunt质粒(北京全式金生物技术有限公司)的MCS间插入Genebank号为GQ342716.1的核苷酸的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为伞状毛霉菌检测基因质粒。

[0442] 制备上述三种质粒。

[0443] 反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的模板拷贝数为104)，补水至10μL。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。

[0444] 反应条件：65℃恒温50min。

[0445] 反应引物：现用引物与对比引物

[0446] 结果：现采用引物特异性良好，无非特异扩增；对比引物出现稻根霉菌非特异性扩增。

[0447] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。