[0001] 本发明涉及来自狭叶白蜡(Fraxinus angustifolia)(具体是来自其翅果)的提取物、提供此类提取物的工艺、以及涉及此类提取物的方法及用途。特别地，本发明涉及逆转与肥胖相关和/或代谢综合征相关的肠道菌群生态失调治疗、治疗或预防诸如肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)等病症、以及调节和/或调整肠道菌群的方法。

[0002] 在本说明书中列出或讨论明显在先公开的文件不应被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。

[0003] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是定义如下的病症：肝脏中以甘油三酯的形式积累过量脂肪(脂肪变性)(称为组织学上大于5％肝细胞的积累)。它是发达国家最常见的肝脏疾病；例如，影响了约30％的美国成年人。如果不治疗，病情可能逐渐恶化，最终可能导致肝硬化。NAFLD在肥胖患者中尤为普遍，约80％被认为患有该疾病。

[0004] 除了过量脂肪积累外，亚组NAFLD患者还显示肝细胞损伤和炎症。这种被称为非酒精性脂肪肝炎(NASH)的病症在组织学上几乎与酒精性脂肪肝炎(ASH)难以区分(如世界胃肠病学组织(WGO)在《WGO全球指南：非酒精性脂肪性肝病与非酒精性脂肪肝炎(2012)(WGO Global Guidelines:Non-alcoholic Fatty Liver Disease and Non-alcoholic Steatohepatitis(2012))》中所述)。虽然在NAFLD中见到的单纯性脂肪变性与短期发病率或死亡率的增加并不直接相关，但这种病症进展为NASH会急剧增加肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌(HCC)的风险。

[0005] 虽然NASH患者的肝脏发病率和死亡率大大增加，但它们与心血管疾病的发病率和死亡率之间的相关性更强。NASH被广泛认为是通常称为代谢综合征的病症的肝脏表达，其包括与2型糖尿病、胰岛素抵抗、中枢性(躯干)肥胖、高脂血症、低密度脂蛋白(HDL)胆固醇、高甘油三酯血症及高血压相关的疾病(例如参见N Wiernsperger，糖尿病、代谢综合征与肥胖(Diabetes Metab Syndr Obes)，6，379-388(2013))。

[0006] 目前糖尿病和肥胖症在世界范围内流行。至少有14.6亿成年人超重或肥胖，截至2008年，世界上约有1.7亿儿童被认定为超重或肥胖。这些数字持续上升，表明NASH将成为富裕国家和发展中国家日益普遍的肝脏问题，增加全球肝病负担并影响全球公共卫生和医疗费用。

[0007] 在2012年，据估计，NAFLD和NASH将使五年中直接和间接医疗费用增加约26％。如上所述，现在估计发达国家中约30％的成年人患有NAFLD，并且认为约2-6％的此类成年人患有NASH。特别地，NAFLD被认为影响多达70-80％的肥胖个体(例如参见Z M Younossi等人，临床肠胃病学与肝病学(Clin Gastroenterol Hepatol)，9，524-530(2011))。

[0008] NASH的确切原因尚未阐明，但几乎肯定并非每个患者都相同。它与胰岛素抵抗、肥胖以及代谢综合征密切相关；然而，并非所有患有这些病症的患者都有NAFLD/NASH，并非所有患有NAFLD/NASH的患者都患有这些病症之一。然而，鉴于NASH是一种潜在的致命疾病，导致肝硬化、肝功能衰竭和HCC，迫切需要有效的治疗。

[0009] 目前，对于NAFLD/NASH，尚无基于证据的批准药物治疗。在任何逆转NAFLD/NASH病程的尝试中，生活方式改变都至关重要，并且治疗目标是胰岛素抵抗和氧化应激。尽管正在评估几种治疗选择方案，但大多数治疗方法的价值仍不确定，或者停药后效果会逆转。治疗NASH的目的是减少组织学特征，并改善胰岛素抵抗和肝酶水平。

[0010] 人类肠道菌群由数万亿微生物组成，其中大部分为细菌和病毒来源，它们被认为是非致病性的。菌群与宿主的防御和免疫系统协同作用，以防止病原体定植和入侵。它还具有必需的代谢功能，可作为必需营养素和维生素的来源，帮助从食物中提取能量和营养素，诸如短链脂肪酸(SCFA)和氨基酸(例如参见S Carding等人，健康与疾病中的微生物生态学(Microb Ecol Health Dis)，26，26191(2015))。

[0011] 微生物培养研究仅能检测少量肠道细菌的种类。如今，通过免培养的遗传和宏基因组技术揭示了肠道菌群的组成和多样性。宏基因组分析和16S核糖体RNA基因测序表明，在门的水平上，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteriodetes)占优势，其中也存在放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、螺旋体门(Spirochaetae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和黏胶球形菌门(Lentisphaerae)(出处同上)。虽然优势门在个体之间相对恒定，但多样性沿着分类学线增加，每个个体拥有超过一百个独特的种。

[0012] 肠道菌群已经与人类一起进化为共生伙伴；然而，肠道菌群的组成变化，即肠道菌群的生态组织改变(通常称为生态失调)，已被发现与几种临床病症有关，诸如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、过敏性疾病、胃肠疾病、自身免疫疾病和癌症(例如参见M Serino等人，当代心脏病学报告(Curr Cardiol Rep)，16(11)，540(2014))，以及与NAFLD有关(例如参见J Boursier和A M Diehl，美国科学公共图书馆病理学(PLoS Pathog)，11(1)，e1004559(2015))。实际上，肠道菌群生态失调被认为可导致肠道防御改变、细菌移位增加，从而引发组织炎症和肝脂肪变性。

[0013] 肠道菌群在肝脏脂肪变性进展中的可能作用包括几种可能的作用机制：通过从其它难以消化的膳食多糖中获取能量来诱导肥胖；调节肠道通透性并刺激低度炎症；调节膳食胆碱代谢；以及通过肠细菌刺激内源性乙醇产生(参见N Arslan，世界胃肠学杂志(World J Gastroenterol)，20(44)，16452-16463(2014))。

[0014] 此外，据认为致肥胖菌群能够通过刺激肝甘油三酯并通过调节全身脂质代谢替代肝功能，这可能间接地影响肝脏中脂肪酸的储存。因此，恢复最佳肠道微生物系统可能是预防脂肪变性进展、特别是阻滞NAFLD朝NASH进展的有前景的策略。

[0015] 本发明人现已惊奇地发现，从狭叶白蜡(本文称为FA)翅果或种子(具体是从翅果)获得的提取物通过调节或调整肠道菌群而具有逆转肠道菌群生态失调的有效活性。这些效果表明，此类狭叶白蜡提取物可具有多种治疗及非治疗(例如化妆品)用途，以及在预防医学病症中的用途。

[0203] 通过参考以下非限制性实例进一步描述本发明。

[0204] 实例

[0205] 实例1–用水提取狭叶白蜡

[0206] 将总共2.5kg的狭叶白蜡翅果在空气中干燥，然后研磨成粒度约1-2mm的粗粉末。将粗粉在渗滤器中在80-90℃下浸泡在水中5小时，并从渗滤器中排出水提取物。提取过程重复三次。将所有水提取物合并在一起并在旋转真空蒸发器中浓缩。蒸发水后，得到总共
550克干燥的粉末状提取物。HPLC分析表明该粉末状提取物含有两种主要的裂环烯醚萜苷类，11.4％(重量/重量)的女贞苷和6.2％的GB。该组合物还含有0.19％木樨榄苷-11-甲酯、
0.41％excelside B、0.63％GI5、0.2％红景天苷，以及一些次要的裂环烯醚萜苷类，包括ligstroside、木樨榄苷二甲酯和excelside A。

[0207] 实例2–用水、水-乙醇、乙醇提取狭叶白蜡

[0208] 制备5个样本，每个样本含有5克狭叶白蜡翅果。将每个样本研磨成粉末，并分别用200mL水、25％乙醇/75％水、50％乙醇/50％水、75％乙醇/25％水以及乙醇进行溶剂提取。
在室温(22-24℃)下提取24小时后，蒸发溶剂并通过HPLC分析残留的固体。裂环烯醚萜苷含量和红景天苷列于表1中。

[0209] 表1：使用不同溶剂的主要裂环烯醚萜苷含量和红景天苷(结果表示为重量百分比)

[0210]化合物 EtOH 75％EtOH 50％EtOH 25％EtOH 水
女贞苷 9.05 15.04 15.43 14.10 1.50
GI3 9.20 14.77 17.06 9.18 1.14
木樨榄苷甲酯 0.57 0.91 0.78 0.74 0.96
Excelside B 0.06 0.09 0.10 0.12 0.03
GI 5 0.91 1.45 1.70 0.83 0.10
红景天苷 0.08 0.17 0.16 0.18 0.74

[0211] 实例3–从狭叶白蜡中分离裂环烯醚萜类

[0212] 加入3.5L甲醇并与500克实例1所示过程得到的粉末提取物在室温下混合3小时。通过过滤方法将甲醇溶液与粉末分离。重复相同的过程一次，合并两种甲醇萃取液，减压浓缩，得到总共54克干燥的甲醇萃取物。将甲醇提取物重新溶解在水中并过滤以除去非水溶性物质。将滤液进一步在C-18树脂上进行反相柱色谱分离，用水和梯度MeOH-水溶剂系统从
10％MeOH水溶液至100％MeOH洗涤。收集总共7个馏分。从柱中洗脱的各个馏分在真空下蒸发并通过HPLC分析合并。将馏分2、3和7装载到填充有硅胶树脂的色谱柱上，并用氯仿-甲醇系统洗脱，从CHCl3、10％MeOH/CHCl3、20％MeOH/CHCl3开始，直至100％MeOH。通过HPLC分析比较从硅胶柱收集的馏分，并将每个分离的洗脱液在MCI GEL CHP-20P和/或Sephadex LH-
20树脂上重复进行柱色谱，并用水-甲醇系统洗脱，直至获得单一纯化合物。鉴定化合物excelside A、excelside B、女贞苷、GI3、GI5、ligstroside、木樨榄苷二甲酯、木樨榄苷-1,
1-甲酯和红景天苷。通过光谱方法阐明所有化学结构。

[0213] 实例4–测试狭叶白蜡提取物对小鼠肝脂肪变性的影响

[0214] 9周龄成年雄性C57BL/6小鼠购自查尔斯河(Charles River)(法国罗纳拉尔布雷勒(L'Arbresle)查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))并在恒定的室温和湿度下饲养并在SPF条件下保持12/12h光/暗循环。用由SAFE(科学动物食品与工程(Scientific Animal Food&Engineering)，法国Augy)获得的来自脂肪的能量为60％的高脂肪饮食(HFD)喂养它们12周，自由给水。表2和表3分别给出了HFD的成分列表和营养价值。

[0215] 表2：来自SAFE(法国Augy)的纯合日粮260HF饮食的成分列表

[0216]纯合日粮260HF 量(g)
酪蛋白 22.800
DL-蛋氨酸 0.200
麦芽糊精 17.015
蔗糖 16.633
无水黄油 33.350
大豆油 2.500
矿物质预混料AIN93G-mx 4.550
碳酸氢钠 1.050
柠檬酸钾 0.400
维生素预混物AIN93G-vx 1.300
重酒石酸胆碱 0.200
抗氧化剂 0.002
总计 100

[0217] 表3：来自SAFE(法国Augy)的纯合日粮260HF饮食的营养价值

[0218]

[0219] 在治疗组中，狭叶白蜡(Vahl)提取物直接混合在饮食中，从而按200mg/kg/天通过口服途径给药，其代表人类当量剂量1g/天(根据FDA的公式(2005)：人等效剂量HED(mg/kg)＝按mg/kg计的动物剂量×(按kg计的动物重量kg/按kg计的人体重))。通过如本文所述用30％(v/v)乙醇水溶液提取来获得狭叶白蜡翅果的干燥提取物。基于植物提取物的总干重，提取物可优选含有约10％(％w/w)的女贞苷和GL3。通过比较消耗HFD和提取物(狭叶白蜡组)的大鼠中与仅消耗HFD(高脂肪饮食)的大鼠(对照组)的不同参数，分析狭叶白蜡(Vahl)提取物消耗的效果。

[0220] 在12周期间跟踪体重和体重增加，并且在治疗结束时通过NMR评估身体组成(脂肪质量、瘦组织质量和水的百分比)。在治疗12周后通过在禁食小鼠中施用2g/kg体重的葡萄糖并且在葡萄糖施用后2小时内通过跟踪血糖来进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。

[0221] 在处死时，小心地取出肝脏，称重并调节以进行组织学分析。为了检测肝脏中的脂质沉积，如先前报道的那样从冷冻肝脏制备肝切片并用油红O染色(SD  Fowler、PO Greenspan，组织化学与细胞化学杂志(J.Histochem Cytochem)，33，833-836(1985))。用ImageJ分析软件(国家精神健康研究所，美国马里兰州Bethesda)分析油红O染色的载玻片，以获得脂肪变性的定量组织学测量。每个肝脏活组织检查取5个放大倍数的随机图像，以确保每个样本的代表性样本。由图像生成像素强度的直方图，测量面积并将结果表示为脂肪百分比面积。

[0222] 如图1所示，高脂肪饮食的12周消耗诱导了强烈的体重增加，这可以通过同时食用狭叶白蜡提取物来抵消。特别地，狭叶白蜡提取物能够在12周内减少喂食HFD的小鼠的脂肪量。

[0223] 如图2所示，血糖负荷后30及60分钟血糖浓度显著降低(p<0.05)并且(血糖对时间)曲线(AUC)下面积显著减少(p＝0.07)，这显示饮用狭叶白蜡提取物也能够显著降低喂食HFD的小鼠的葡萄糖耐受不良。

[0224] 如图3所示，高脂肪饮食的12周消耗导致肝脏中高水平的脂肪沉积，即对照组的脂肪变性(35.2％)，这种类型的饮食是饮食诱导的肥胖、糖尿病和肝脂肪变性的典型模型(参见：Takahashi Y、Soejima Y、Fukusato T，世界胃肠学杂志(World J Gastroenterol)，18(19)，2300-2308(2012)；以及Y Zhou和L Xie，美国肾脏病杂志(Am J Digest Dis)，2(1)，60-67(2015))。用狭叶白蜡提取物进行为期12周的治疗能够显著降低脂肪变性的严重程度(p＝0.004)，因为用提取物治疗的小鼠肝脏中仅发现22.8％的脂肪，这相当于减少35％的脂肪变性。根据世界胃肠病学组织组织学评分系统(2012)以及Kleiner和Brunt(DE Kleiner和EM Brunt，肝脏疾病研讨(Semin Liver Dis)，32，3-13(2012))的分类，其根据脂肪含量对脂肪变性的严重程度进行分类(0级：<5％，1级：5-33％，2级：34-66％，3级：>
67％)，用狭叶白蜡治疗可保证脂肪变性严重程度从2级降低到1级。

[0225] 实例5-测试狭叶白蜡提取物对小鼠肠道菌群的影响

[0226] 为了评估狭叶白蜡提取物在喂食高脂肪饮食的小鼠中诱导的肠道菌群改变，在具有或不具有狭叶白蜡提取物的HFD消耗开始(4周)和12周后，对小鼠粪便样本进行16S rDNA宏基因组学研究(每组10只小鼠，总共40只小鼠)。使用下一代高通量测序16S rDNA细菌基因的可变区(V3-V4)来确定样本中含有的细菌群。

[0227] 宏基因组学工作流程用于通过扩增16S核糖体RNA基因中的特定区域来由宏基因组样本分类生物。该宏基因组学工作流程是细菌专有的。主要输出是位于几个分类水平的读数的分类：门、纲、目、科和属。已经使用下一代高通量测序16S rRNA细菌基因的可变区来确定样本中存在的微生物群。工作流程包括以下步骤：

[0228] (1)文库建设及测序

[0229] 使用靶向细菌16S核糖体基因V3-V4区的16S通用引物进行PCR扩增。由于2×300对端MiSeq试剂盒V3，连接对长度设置为包含476个碱基对扩增子。对于每个样本，通过添加测序接头产生测序文库。使用MiSeq 技术进行测序片段的检测。

[0230] (2)生物信息学算法流水线(pipeline)

[0231] 使用以下生物信息学算法流水线分析来自菌群的靶向宏基因组序列；简而言之，在对条码识别Illumina配对读数进行拆分(demultiplex)后，清洗单个读取序列并将每个样本配对成独立的较长片段。在对16S参考数据库进行质量过滤和对齐之后，进行识别阈值为97％的操作分类单元(OTU)的聚类以及分类分配，以确定群落图谱。

[0232] 基于这些结果，图表示1)个体研究样本以及2)每个样本类型/群的平均值中存在的分类群(门、纲、目、科和属)的相对比例。

[0233] 如图4、图5、图6和图7所示，在高脂饮食消耗(T1)开始时，肠道菌群特征相似，与未随HFD同时消耗提取物的小鼠相比，在已消耗狭叶白蜡提取物的小鼠中，在纲水平可以看到一些微小的差异，而在科水平则更为集中。

[0234] 进行主坐标分析(PCoA)以基于Generalized UniFrac距离度量来比较样本(C Lozupone、ME Lladser、D Knights、J Stombaugh、R Knight(2011)《UniFrac：用于微生物群落比较的有效距离度量(UniFrac:an effective distance metric for microbial community comparison)》，多学科微生物生态学杂志(ISME J.)5(2)：169-172)，以说明小鼠组的差异。

[0235] 如图8和图9所示，虽然小鼠的肠道菌群组成在高脂肪饮食消耗(T1)开始时相似，如个体分布的可堆叠轮廓所示，但可以看出，经过使用狭叶白蜡提取物治疗3个月后，根据其肠道菌群组成，经治疗的个体可以与未治疗的个体区分开来。

[0236] 然后使用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)(N Segata等人，基因组生物学(Genome Biol)，12(6)，R60(2011))方法分析宏基因组数据的高维类别比较。LefSe是用于高维生物标识发现和解释的算法，其可以识别表征两种或更多种生物条件之间差异的分类群。它强调统计学意义和生物相关性，使研究人员能够识别出与生物学上有意义的类别(子类)一致的差异丰富的特征。首先，LEfSe可以有效识别生物类别中统计学上不同的特征。然后，它进行附加检测，以评估这些差异是否与预期的生物学行为一致。使用默认值(类别中的因子Kruskal-Wallis检验和子类别之间的成对Wilcoxon检验的alpha值均为0.5，判别特征的对数LDA评分的阈值为2.0)和策略多级分析设置为“多对多(all-against-all)”，来确定线性判别分析效应大小。

[0237] 如图10和图11所示，LefSe分析显示，在属或OTU水平，与喂食HFD的未治疗小鼠比较，用狭叶白蜡提取物治疗的小鼠中富集了不同的分类群(伯克霍尔德氏菌属、萨特氏菌属、副萨特氏菌属、β-变形菌属和肠杆菌属以及其他OTU)。相反，与喂食HFD的未治疗小鼠相比，用狭叶白蜡提取物治疗的小鼠中较少出现普雷沃氏菌属、黄杆菌属、梭菌属IV和产丁酸球菌属以及其他分类群。这些结果突出了由狭叶白蜡提取物补充诱导的肠道菌群的改变。

[0238] 通过使用随机森林分析方法(W.G  Touw等人，生物信息学精要(Brief Bioinform)，14(3)，315-26(2013))分析微生物组分析和脂肪变性严重程度之间的相关性。如图12、图13和图14所示，分别在科或属的水平上的几个分类群的相对丰度与喂食高脂肪饮食的小鼠的脂肪变性严重程度相关，清楚地表明狭叶白蜡提取物能够改变肠道菌群，特别是一些科或属(红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)的相对丰度，并且这些修饰可以减少脂肪变性的发展。分类群(按科和属)的丰度与脂肪变性严重程度之间相关性的分析结果显示在以下表4和表5中。

[0239]

[0240] 表4：按科的分类群丰度与脂肪变性严重程度之间相关性的统计分析。

[0241]

[0242] 表5：按属的分类群丰度与脂肪变性严重程度之间相关性的统计分析。