技术领域
[0001] 本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种酵母包被的益生菌微胶囊、制备方法及其应用。
相关背景技术
[0002] 益生菌主要有乳酸杆菌类、双歧杆菌类以及革兰氏阳性球菌等，补充益生菌对维持肠道微生态，促进人体健康有重要作用。由于益生菌对胃液、胆盐等消化液的不可耐受性，导致益生菌的肠道定殖率偏低，益生菌制剂往往起不到预期的效果。市面上市的益生菌制剂大多是口服制剂，他们通过提高产品中益生菌数量，从而增加益生菌的肠道定殖率。这些方法成本高，效果也不尽如人意。有的采用包埋法处理益生菌，不仅能使菌种新陈代谢速率减慢、有助于菌种的保藏，而且可减轻益生菌受胃酸、胆盐等消化液的破坏，有望使肠道内的定殖率大大提高。中国发明专利201610745817.0公开了一种囊材为海藻酸钠与壳聚糖的双层益生菌微球的制备方法，中国发明专利200610081042.8公开了一种包覆成分为奶粉、玉米淀粉、改质淀料以及滑石粉等的耐酸益生菌组成分，皆有效提高了益生菌的耐酸性能。然而，目前的益生菌包覆物大多为高分子材料，在包覆过程中难以避免发生化学交联等化学反应并且产生反应副产物，不利于益生菌活性的保持。
[0003] 酵母菌是一种单细胞真核生物，比细菌单细胞个体大得多，绝大多数对人体无害。酵母菌可有效抵挡胃液的侵蚀，且体内含有蛋白质、维生素、酶等，因此常被用作食品强化营养剂。暂时未有使用酵母菌作为载体包被材料用于益生菌的研究报道。因此研发一种安全有效、可长时间保持益生菌活性的新型益生菌微胶囊成为亟待解决的问题。
具体实施方式
[0026] 实施例1
[0027] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为5％的L-半胱氨酸成活化培养基。在厌氧培养箱内将嗜热链球菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD为0.3，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜嗜热链球菌分散液。
[0028] MRS培养基配方(g/L)：peptone10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖20，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.1，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，吐温80 1，pH＝6.5。
[0029] 2、用YPD培养基培养产朊假丝酵母菌至OD＝1.3，121℃、15分钟灭活产朊假丝酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体，用等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min；重复2次，得到一定浓度的产朊假丝酵母胞壁分散液。
[0030] YPD培养基配方：1％酵母膏，2％peptone，2％葡萄糖。
[0031] 3、将步骤1所得的益生菌分散液与步骤2酵母分散液按体积比为1：1混合(上述步骤测量的OD值即为浓度)，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0032] 实施例2
[0033] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为15％硫代乙醇酸钠。在厌氧培养箱内将双歧杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.6，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜双歧杆菌分散液。
[0034] 2、用YPD培养基培养酿酒酵母至OD＝1.5，121℃、30分钟灭活酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体后用等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min，重复3次，得到一定浓度的酿酒酵母胞壁分散液。
[0035] 3、将步骤1所得的双歧杆菌分散液与步骤2酿酒酵母胞壁分散液按体积比为10：1混合(上述步骤测量的OD值即为浓度)，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0036] 实施例3
[0037] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为10％L-半胱氨酸。在厌氧培养箱内将保加利亚乳酸杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.5，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜保加利亚乳酸杆菌分散液。
[0038] 2、用YPD培养基培养毕赤酵母至OD＝1.4，121℃，20分钟灭活酿酒酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体，用等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min，重复2次，得到一定浓度的毕赤酵母胞壁分散液。
[0039] 3、将步骤1所得的保加利亚乳酸杆菌分散液与步骤2毕赤酵母胞壁分散液按体积比为5：1(步骤1与步骤2所测OD值即代表浓度值)混合，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0040] 实施例4
[0041] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为15％硫代乙醇酸钠。在厌氧培养箱内将乳双歧杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.6，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜乳双歧杆菌分散液。
[0042] 2、用YPD培养基培养布拉酵母菌至OD＝1.5，121℃、30分钟灭活酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体后用等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min，重复3次，得到一定浓度的布拉酵母菌胞壁分散液。
[0043] 3、将步骤1所得的乳双歧杆菌分散液与步骤2布拉酵母菌胞壁分散液按体积比为10：1(步骤1与步骤2所测OD值即代表浓度值)混合，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0044] 实施例5
[0045] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为15％硫代乙醇酸钠。在厌氧培养箱内将嗜酸乳杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.6，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜嗜酸乳杆菌分散液。
[0046] 2、用YPD培养基培养产朊假丝酵母至OD＝1.5，121℃、30分钟灭活酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体后等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min，重复3次，得到一定浓度的产朊假丝酵母胞壁分散液。
[0047] 3、将步骤1所得的嗜酸乳杆菌分散液与步骤2产朊假丝酵母胞壁分散液按体积比为10：1(步骤1与步骤2所测OD值即代表浓度值)混合，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0048] 实施例6
[0049] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为15％硫代乙醇酸钠。在厌氧培养箱内将干酪乳杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.6，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜干酪乳杆菌分散液。
[0050] 2、用YPD培养基培养酿酒酵母至OD＝1.5，121℃、30分钟灭活酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体后用等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min，重复3次，得到一定浓度的酿酒酵母胞壁分散液。
[0051] 3、将步骤1所得的干酪乳杆菌分散液与步骤2酿酒酵母胞壁分散液按体积比为10：1(步骤1与步骤2所测OD值即代表浓度值)混合，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0052] 实施例7
[0053] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为15％硫代乙醇酸钠。在厌氧培养箱内将短乳杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.6，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜短乳杆菌分散液。
[0054] 2、用YPD培养基培养布拉酵母菌至OD＝1.5，121℃、30分钟灭活酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体后用等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min，重复3次，得到一定浓度的布拉酵母菌胞壁分散液。
[0055] 3、将步骤1所得的短乳杆菌分散液与步骤2布拉酵母菌胞壁分散液按体积比为10：1(步骤1与步骤2所测OD值即代表浓度值)混合，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0056] 实施例8
[0057] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为15％硫代乙醇酸钠。在厌氧培养箱内将植物乳杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.6，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜植物乳杆菌分散液。
[0058] 2、用YPD培养基培养毕赤酵母至OD＝1.5，121℃、30分钟灭活酵母菌，4℃、1500g离心5min，收集菌体后用等体积的无菌水重悬。4℃、1500g离心5min，重复3次，得到一定浓度的毕赤酵母胞壁分散液。
[0059] 3、将步骤1所得的植物乳杆菌分散液与步骤2毕赤酵母胞壁分散液按体积比为10：1(步骤1与步骤2所测OD值即代表浓度值)混合，得到酵母包被的益生菌微胶囊制剂，置于4℃充氮保存。
[0060] 对比例
[0061] 1、将MRS培养基灭菌后通入N2以排除O2，加入浓度为10％L-半胱氨酸。在厌氧培养箱内将双歧杆菌菌株接种至活化培养基中，培养至OD＝0.5，离心，菌体重悬于等体积的无菌除氧的生理盐水中，配置成一定浓度的新鲜双歧杆菌分散液。
[0062] 2、现有方法为未被包覆的益生菌冻干物。
[0063] 对实施例作进一步的效果检测。
[0064] 用1mL无菌生理盐水重悬本发明所得的益生菌微胶囊制剂和对比例，加入到9mL pH＝1.5的人工胃液中，置于37℃水浴摇床中震荡培养，分别在0min、60min、120min时取样，梯度稀释(101-106)涂布平板计数，测其活菌率(实验组)。未被酵母菌包覆的双歧杆菌作为对照组。
[0065] 从表1显示，在未浸入胃液时(0min)，实验组和对照组的菌株数大致相当，菌存活率为100％。60min之后，未被包覆的双歧杆菌的数量下降4个数量级。而实施例1-3所得微胶囊中的嗜酸链球菌的数量仅下降2个数量级。120min后，未被包覆的嗜酸链球菌的存活率几乎为0，而实施例1～3所得微胶囊中的双歧杆菌的存活率仍保持为6.2％、4.6％、3.8％。实验证实，本发明制备的酵母菌微胶囊可有效保护益生菌的活性。
[0066] 表1微胶囊稳定性试验结果
[0067]
[0068] 表1中可知，随着时间的增加，实施例的酵母菌可使益生菌免受消化液破坏，在人工胃液中持续时间比对照组长。而且本发明的包埋效率比对比例高，高达82％或以上。存活率比对比例高，证明本发明的微胶囊制剂稳定性好。
[0069] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
