[0001] 本发明涉及一种葛根素衍生物B及其制备方法以及应用。

[0002] 葛根素属于异黄酮类化合物，具有退热、镇静和对垂体后叶素引起的急性心肌出血有保护作用等。临床上用于冠心病心绞痛、高血压等。

[0003] 由于葛根素本身水溶性和脂溶性都不好，口服吸收不完全，生物利用度低。临床上也主要以注射剂为主，但近年来发现注射剂型存在许多不良反应，如变态反应、休克和溶血性反应等。因此，对葛根素进行结构的修饰改造，解决其溶解性和生物利用度的课题研究特别有重大意义。

[0016] 下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：

[0017] 一种葛根素衍生物B，其结构式如下：

[0018]

[0019] R1、R2、R3均为饱和直链烷基，其中R1＝R2＝CH2CH3或C8H17或C10H21，R3＝CH3或CH2CH3。

[0020] 所述的葛根素衍生物B的制备方法，它包括以下步骤：

[0021] (1)化合物A的合成：将葛根素与氯乙酰氯反应得化合物A，其中化合物A的结构式为：

[0022]

[0023] (2)目标化合物葛根素衍生物B的合成：将步骤(1)所得的化合物A与叔胺反应即得所述的葛根素衍生物B；其中，所述叔胺为三乙胺、N-甲基二正辛胺、N-甲基二癸基胺中的一种。

[0024] 其中，所述步骤(1)的具体操作方法为：将葛根素溶于有机溶剂A中，加入有机碱，控制体系温度在0-5℃，慢慢滴加氯乙酰氯的有机溶剂A，滴加氯乙酰氯的过程中控制体系的温度不超过5℃；待氯乙酰氯滴加完毕之后，将体系温度升高到25-30℃(最优控制为28℃)，在25-30℃(最优控制为28℃)温度条件下反应20-24h(最优控制为22h)后，将反应液浓缩，得浓缩物；之后利用硅胶柱层析对浓缩物进行提纯得到化合物A；其中，所述葛根素、有机碱以及氯乙酰氯的摩尔比为1：1-2：1-2，葛根素、有机碱和氯乙酰氯的摩尔比优选为1：1.5：1.2；

[0025] 所述有机溶剂A为二氯甲烷、氯仿、庚烷、四氢呋喃、甲苯中的一种或几种的混合物，有机溶剂A优选为氯仿；

[0026] 所述有机碱为吡啶、三乙胺、DBU、DBN、DMAP中的一种，所述有机碱优选为吡啶；

[0027] 另外，对浓缩物进行硅胶柱层析时，所用的洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂，其中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为10：1。

[0028] 所述步骤(2)的具体操作方法为：将化合物A溶解于有机溶剂B，反应体系冷却到0-5℃，在0-5℃条件下加入叔胺，待叔胺加入完毕之后，将体系升温到45-65℃，反应8-20h后，冷却，得葛根素衍生物B粗产品，之后对葛根素衍生物B粗产品进行提纯得葛根素衍生物B；

[0029] 其中化合物A、叔胺的摩尔比为1：1-5，化合物A、叔胺的摩尔比优选为1：2；

[0030] 所述的有机溶剂B为二氯甲烷、氯仿、庚烷、四氢呋喃、甲苯中的一种或者几种的混合物，有机溶剂B优选为氯仿。

[0031] 下面结合具体实施例对本发明的内容作更细致阐述:

[0032] 实施例一：

[0033] 化合物A的合成：将4.16g(0.01mol)葛根素溶解于氯仿中，加入1.19g吡啶(0.015mol)，控制体系温度0℃，慢慢滴加1.36g氯乙酰氯(0.012mol)的氯仿溶液，滴加氯乙酰氯的过程中控制体系温度不超过5℃，待氯乙酰氯滴加完毕之后，将体系温度慢慢升高温度至28℃，在28℃温度下反应22h，反应过程中利用TLC跟踪反应进程，待反应22h后原料点基本消失。之后将反应液浓缩，得浓缩物，利用硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10：1)对浓缩物进行提纯，得到3.57g化合物A，收率为72.4％。

[0034] 核磁解析：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):8.42(1H,s),7.99(1H,d),7.43(1H,d),7.35(2H,m),6.99(2H,m),5.01(1H,d),4.86(1H,s),4.74(1H,m),4.56(2H,s)，3.41-3.99(5H,m),1.71(1H,s),1.67(1H,s),1.56(1H,s)1.37(1H,s).

[0035] 实施例二：

[0036] 化合物A的合成：将4.16g(0.01mol)葛根素溶解于氯仿中，加入0.791g吡啶(0.01mol)，控制体系温度2℃，慢慢滴加1.13g氯乙酰氯(0.01mol)的氯仿溶液，滴加氯乙酰氯的过程中控制体系温度不超过5℃，待氯乙酰氯滴加完毕之后，将体系温度慢慢升高温度至25℃，在25℃温度下反应24h，反应过程中利用TLC跟踪反应进程，待反应24h后原料点基本消失。之后将反应液浓缩，得浓缩物，利用硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10：1)对浓缩物进行提纯，得到3.32g化合物A，收率为67.4％。

[0037] 实施例三：

[0038] 化合物A的合成：将4.16g(0.01mol)葛根素溶解于氯仿中，加入1.582g吡啶(0.02mol),控制体系温度0℃，慢慢滴加2.26g氯乙酰氯(0.02mol)的氯仿溶液，滴加氯乙酰氯的过程中控制体系温度不超过5℃，待氯乙酰氯滴加完毕之后，将体系温度慢慢升高温度至30℃，在30℃温度下反应20h，反应过程中利用TLC跟踪反应进程，待反应20h后原料点基本消失。之后将反应液浓缩，得浓缩物，利用硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10：1)对浓缩物进行提纯，得到3.41g化合物A，收率为69.2％。

[0039] 实施例四：

[0040] 化合物A的合成：将4.16g(0.01mol)葛根素溶解于氯仿中，加入1.19g吡啶(0.015mol)，控制体系温度2℃，慢慢滴加1.36g氯乙酰氯(0.012mol)的氯仿溶液，滴加氯乙酰氯的过程中控制体系温度不超过5℃，待氯乙酰氯滴加完毕之后，将体系温度慢慢升高温度至30℃，在30℃温度下反应22h，反应过程中利用TLC跟踪反应进程，待反应22h后原料点基本消失。之后将反应液浓缩，得浓缩物，利用硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10：1)对浓缩物进行提纯，得到3.38g化合物A，收率为68.7％。

[0041] 实施例五：目标产物葛根素衍生物B-1的合成，葛根素衍生物B-1的结构式为：

[0042]

[0043] B-1

[0044] R1＝R2＝R3＝CH2CH3

[0045] 将4.93g(0.01mol)化合物A溶解于氯仿中，将反应体系冷却到0-5℃，在此温度条件下慢慢加入2.02g(0.02mol)三乙胺的氯仿溶液，三乙胺的加入过程中控制体系温度不超过5℃，待三乙胺加入完毕之后，将体系升温到62℃，在此温度条件下反应10h，冷却，析出大量固体，固体经抽滤、干燥后得葛根素衍生物B-1粗产品，葛根素衍生物B-1粗产品经乙醇重结晶后得到4.29g葛根素衍生物B-1纯产品，收率为70.3％.葛根素衍生物B-1在水中具有良好的水溶性，加入水中稍微一搅拌就溶解。葛根素衍生物B-1在水中的溶解度约为481mg/mL。

[0046] 核磁解析：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):8.45(1H,s),8.01(1H,d),7.43(1H,d),7.35(2H,m),7.01(2H,m),5.03(1H,d),4.82(1H,s),4.64(2H,s),4.22(1H,m),3.79-3.86(2H,m),3.70(6H,m),3.44-3.57(3H,m),2.84(1H,s),1.70(1H,br),1.58(1H,br),1.56(1H,br),1.34(9H,t).

[0047] 实施例六：目标产物葛根素衍生物B-2的合成，葛根素衍生物B-2的结构式为：

[0048]

[0049] B-2

[0050] R1＝R2＝(CH2)7CH3；R3＝CH3

[0051] 将4.93g(0.01mol)化合物A溶解于氯仿中，将反应体系冷却到0-5℃，在此温度条件下慢慢加入5.11g(0.02mol)N-甲基二正辛胺的氯仿溶液，N-甲基二正辛胺的加入过程中控制体系温度不超过5℃，待N-甲基二正辛胺加入完毕之后，将体系升温到65℃，在此温度条件下反应12h，冷却后将反应液旋干，得葛根素衍生物B-2粗产品，葛根素衍生物B-2粗产品经硅胶柱层析(洗脱液为氯仿：乙醇＝10:1)提纯后，得到5.44g葛根素衍生物B-2纯产品,收率为71.2％.葛根素衍生物B-2在水中的溶解度约为367mg/mL。

[0052] 核磁解析：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):8.42(1H,s),7.99(1H,d),7.43(1H,d),7.35(2H,m),6.99(2H,m),4.92(1H,d),4.85(1H,s),4.58(2H,s),4.56(1H,m),4.03(1H,m),3.76(2H,m),3.37-3.44(6H,m),3.26(3H,s),2.05(1H,br),1.78(4H,m),1.70(1H,s),1.61(1H,s),1.59(1H,s),1.26-1.33(20H,m),0.88(6H,m).

[0053] 实施例七：目标产物葛根素衍生物B-3的合成，葛根素衍生物B-3的结构式为：

[0054]

[0055] B-3

[0056] R1＝R2＝(CH2)9CH3；R3＝CH3

[0057] 将4.93g(0.01mol)化合物A溶解于氯仿中，将反应体系冷却到0-5℃，在此温度条件下慢慢加入6.23g(0.02mol)N-甲基二癸基胺的氯仿溶液，N-甲基二癸基胺的加入过程中控制体系温度不超过5℃，待N-甲基二癸基胺加入完毕之后，将体系升温到65℃，在此温度条件下反应14h，冷却后将反应液旋干，得葛根素衍生物B-3粗产品，葛根素衍生物B-3粗产品经硅胶柱层析(洗脱液为氯仿：乙醇＝15:1)提纯后，得葛根素衍生物B-3纯产品，收率为69.2％.葛根素衍生物B-3在水中的溶解度约为353mg/mL。

[0058] 核磁解析：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):8.41(1H,s),8.01(1H,d),7.43(1H,d),7.35(2H,m),6.99(2H,m),4.92(1H,d),4.85(1H,s),4.58(2H,s),4.56(1H,m),4.02(1H,m),3.76(2H,m),3.37-3.44(6H,m),3.26(3H,s),2.05(1H,br),1.78(4H,m),1.70(1H,s),1.61(1H,s),1.59(1H,s),1.26-1.33(28H,m),0.88(6H,m).

[0059] 实施例八：葛根素衍生物B-1、B-2以及B-3分别对大鼠血小板聚集功能的影响实验：

[0060] 1.动物：清洁级Sprague-Dawley大鼠，雄性，体重200g-250g。

[0061] 2.方法与结果

[0062] 动物随机分为空白对照组(等容量溶剂)、阿司匹林组(ASA，50mg/kg)、氯吡格雷组(7mg/kg)、B-1低剂量组(0.625mg/kg)、B-1中剂量组(1.25mg/kg)、B-1高剂量组(2.5mg/kg)，B-2低剂量组(0.625mg/kg)、B-2中剂量组(1.25mg/kg)、B-2高剂量组(2.5mg/kg)，B-3低剂量组(0.625mg/kg)、B-3中剂量组(1.25mg/kg)、B-3高剂量组(2.5mg/kg)，每组8只，灌胃给药，1次/d，连续5d。于末次给药后1h，以3％戊巴比妥钠分别麻醉大鼠(30mg/kg)，经腹主动脉采血，以3.8％枸橼酸钠溶液抗凝(血：抗凝剂＝9:1)，1000r/min，分离富血小板血浆(PRP)，剩余部分再以3000r/min离心15min，分离贫血小板血浆(PPP)，按比浊法以ADP(252umol/L)为诱导剂，用LBY-NJ血液凝聚仪测定5min内血小板聚集率，并按以下公式计算血小板聚集抑制率，数据用％表示，以组间t检验进行统计学处理，结果见表1。

[0063] 血小板聚集抑制率＝(空白对照血小板聚集率％-给药管血小板聚集率％)/空白对照血小板聚集率％*100％

[0064] 根据实验结果可知，葛根素衍生物B-1、B-2以及B-3各剂量组可明显抑制体内血小板聚集，药效与阳性药阿司匹林和氯吡格雷持平。

[0065] 表1各种药对血小板的聚集抑制率(n＝8)

[0066]

[0067]

[0068] 与空白组比较，**P<0.001*P<0.01。

[0069] 结论：以阿司匹林和氯吡格雷作为阳性药，通过实验证明，葛根素衍生物B-1、B-2以及B-3能明显的抑制血小板聚集，与阳性药持平,可以用来制备抗血小板聚集药物。

[0070] 需要说明的是，虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。