技术领域
[0001] 本文涉及基因突变的检测，尤其涉及选择性富集稀有基因突变的方法，相应的富集体系，该富集体系中的引物和阻物。
相关背景技术
[0002] 基因突变是指基因组DNA分子发生的碱基序列的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展，尤其是第二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)的建立，使基因突变检测进入了一个高通量的新时期。但是在野生型模板的较高背景下，不管是传统的qPCR检测技术还是NGS技术，针对较低含量的基因突变的检测能力都有限。
[0003] 稀有基因突变，是指存在于大量野生基因序列背景中的极为稀少的基因突变。稀有基因突变最为常见的例子就是发生在肿瘤细胞中的低频基因变异，许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所得到的DNA样本中会带有大量野生型DNA，基因突变的含量常常都在10％以下或者更低。在临床中，癌症初期病人和治疗前后的肿瘤病人，病人血液中会含有少量的肿瘤突变DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，并且ctDNA的含量随肿瘤负荷和治疗反应而发生变化，通常都在1％以下或甚至更低。这些ctDNA携带了与肿瘤细胞中一样的基因突变信息，同样可以用于肿瘤的早期检测、靶向用药和预后检测。另外，ctDNA是无创取样，从突变信息上说更能反映肿瘤基因突变的全貌，因此，以ctDNA为检测对象的液体活检技术具有其优越性，应用也越来越受到重视。
[0004] 目前稀有突变检测方法中，主要有作为“金标准”的Sanger基因测序。但是Sanger测序的灵敏度有限，在大量野生型基因的背景下，Sanger测序仅能检测到含有5％的突变，所以不适于对ctDNA的检测。目前，定量qPCR也是常用的稀有突变检测方法，可以用于肿瘤细胞基因突变检测，对ctDNA基因突变的检测，也显示一定的能力。但是，这些qPCR技术存在通量小，单个成本高，分辨能力有限，样本消耗量大的缺点，不利于广泛应用。
[0005] 靶向NGS技术是目前最为大家认可的用于检测ctDNA的技术。由于ctDNA含量很低，靶向NGS需要选择性设计检测位点组合(panel)，通过采用探针捕获或者Ampliseq扩增技术来对待测区域进行富集和建库，以提高数据有效率。但是，对低频的突变，这些富集方法并不能提高检测的灵敏性，只能依靠加深测序深度(对相同模板的读取次数)才能完成对稀有突变的检测。例如，对含量为0.1％的突变，就需要10000x以上的测序深度才能检测出来。因测序芯片容量和成本限制，对低于0.1％的突变，NGS就面临挑战。如何在保证待测区域得到富集的前提下，进一步提高稀有突变的比率以降低对测序深度的依赖，就成为提高NGS灵敏性和降低测序成本的关键。
具体实施方式
[0095] 以下通过举例进一步说明本文公开的技术方案。
[0096] 如图1所示，针对待检测的目标基因突变位点设计相应的上游正向引物、下游反向引物和覆盖突变位点的阻物。上下游引物不存在对野生型和突变型的选择性。阻物针对野生型设计，与突变型模板存在错配。上游引物的3’-末端与阻物的5’-末端有2～6核苷酸(nt)的重叠，阻物的3’-末端被PO4基团封闭。如图2所示，第一轮PCR中只有一个针对引物的退火温度(54℃)，比正向引物的解链温度(Tm-Po)低1～5℃，退火时间为20s；第二轮PCR中有两个退火温度，一个是58℃(时间30s)，针对阻物退火，另一个是54℃(时间20s)，跟第一轮相同，针对引物退火。这样一来，在第二轮PCR中，阻物就对模板有选择性，可以稳定结合野生型模板并阻止其扩增，最终只有突变型才得到扩增。
[0097] 选取KRAS第2号外显子G12D突变和EGFR第19号外显子的一个INDEL缺失，第20号外显子T790M，第21号外显子L858R这四种体细胞突变为研究对象。相应的引物和阻物见表1：
[0098] 表1用于检测EGFR基因4种体细胞突变的引物和阻物
[0099]
[0100] 表2引物和阻物的Tm(℃)
[0101]序列 Tm-Po 序列 Tm-Pn 序列 Tm-BW Tm-BM
SEQ ID NO:1 57.2 SEQ ID NO:2 57.2 SEQ ID NO:3 62 54.9
SEQ ID NO:4 57.7 SEQ ID NO:5 58.5 SEQ ID NO:6 61.9 40.9
SEQ ID NO:7 57.6 SEQ ID NO:8 57.3 SEQ ID NO:9 61.4 53.3
SEQ ID NO:10 56.6 SEQ ID NO:11 58.5 SEQ ID NO:12 61 53.8
[0102] 为了考察该方法的灵敏性和有效性，先对这4种阻物进行单一PCR对比实验。在含有纯合野生型模板的PCR体系中加入阻物，与没有加入阻物的PCR比较Ct值的差异，以观察阻物的效率。
[0103] 在对这4种突变的20μL SyBr Green PCR反应体系中，含有20ng片段化的人基因组野生型模板(购自未因生物公司，产品号为HD780，其中含有100％野生型模板)，75mM Tris-HCl,0.01％Tween 20，50mM KCl,1U热启动Taq酶(高保真，Life Technologies)，2.5mM Mg2+，200nM阻物,200nM上游引物和200nM下游引物。相应不含阻物的反应管作为对照。PCR反应程序为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃30秒，54℃25秒，72℃20秒，40个循环。
[0104] 图3显示结果：与不加阻物的PCR扩增相比，针对这四种野生型模板，加入阻物后的Ct值都有不同程度的增加，无模板的阴性对照未出现扩增曲线。在本试验中，PCR结果显示4种阻物对其相应的野生型模板的抑制效率在100-500倍之间。实验结果与理论推测较一致，说明该技术具有较高的特异性，即野生型模板的扩增被有效抑制。
[0105] 为进一步观察该方法的特异性，用各自含有一种纯合突变的4种克隆片段(100％突变型，TAKARA公司合成)作为模板，分别加入各自对应的阻物，按上述条件进行PCR扩增，并与不含阻物的PCR反应比较。图4结果显示，含有阻物的PCR反应与不含阻物的PCR反应其Ct曲线基本一致，说明阻物对突变型模板的扩增没有抑制作用。
[0106] 为了检测该方法对NGS分析稀有突变的有效性，采用含有0.1％频率的上述4种突变的cfDNA阳性标准品(未因生物公司，产品号为HD780，其中含有0.1％稀有基因突变和100％野生型模板)为模板，按上述PCR体系，进行两轮多重PCR扩增。第一轮用20个循环，不含阻物。第二轮用15个循环，含有400nM的阻物(对照不含有阻物)。PCR产物经过纯化建库等操作，最后在DA8600平台(达安基因)上进行测序分析，并与不含阻物的对照作比较。
[0107] 测序结果表明，在10000X测序深度的情况下，不含有阻物时，这4种频率为0.1％的基因突变的实际检测频率在0至0.12％之间(突变型读数与野生型读数的比率)；而在含有阻物时，实际检测到的频率到达8％-32％。这说明，在阻物存在的情况下，这些突变型模板被选择性地富集了80至320倍。可见，在10000X测序深度的情形下，通过对突变型的上百倍富集，本文所述的技术方案可以高效检测到0.001％频率的突变；而如果是检测0.1％频率的基因突变，通过对突变型的上百倍富集，所需要的测序深度可以下降到100X以内，由此显著降低NGS检测的数据量和检测成本。
[0108] 综上所述，本发明采用突变位点特异的阻物来阻止野生型模板的扩增，并实现对模板中稀有突变的富集，从而高选择性地检测稀有突变。对稀有突变的上百倍的富集，不但显著提高检测灵敏度，同时也大大降低了对NGS测序深度的要求，因而也大大降低了NGS测序的成本。
[0109] 以上只是本发明技术方案的具体举例，只要阻物符合上述要求，本发明同样适应于除本实施例外的其它基因突变的检测，也适应于其它基因分型等基因检测的应用平台。因此，本发明的保护范围不限于实施例。
