[0001] 本发明涉及一种棒杆菌启动子及其应用，尤其是一种棒杆菌中的胁迫感应启动子PdnaK及其应用，属于基因工程技术领域。

[0002] 启动子位于转录起始点上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，由此启动转录。

[0003] 棒杆菌是安全生产菌，无内毒素及胞外水解酶活性，广泛应用于多种氨基酸及有机酸的生产，如谷氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，尼龙-4等，其产品可作为饲料添加剂，食品添加剂，医药中间体，可降解塑料的前体，在化妆品行业也有着重要应用。近年来棒杆菌启动子工程取得了很大的进展，棒杆菌基因组上的启动子如Psod，Ptuf，PcspB等近年来被应用于增强相关基因的表达，并取得了一定的成效。虽然组成型启动子、诱导型启动子、合成启动子等都有所报道，但是真正应用于棒杆菌的还比较少，且迫切需求更多的启动子来增强基因的表达，平衡代谢流，以实现高产目的代谢产物的目标。

[0012] 下面通过实例来证明Pdnak，PdnaK(+1)，PdnaK(-1)启动子的应用，但并非局限于只能用作谷氨酸脱羧酶基因的启动子，还可应用于棒杆菌中任何基因及相关代谢产物的合成。

[0013] 菌株：本发明所用到的菌株：高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌本实验室储藏，大肠杆菌JM 109购自天根生物公司。

[0014] 试剂：限制性内切酶XbaI，PstI，T4DNA连接酶，PCR试剂均购自Thermo公司，基因组提取试剂盒，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒，卡那霉素均购自上海生工，其他试剂均为国产或进口的分析纯试剂。

[0015] 种子培养基(100ml)：葡萄糖2.5％，玉米浆3％，尿素0.8％，K2HPO4·3H2O 0.1％，MgSO40.02％，NaOH调pH 7.2。

[0016] 发酵培养基(100ml)：葡萄糖10％，K2HPO4·3H2O 0.2％，玉米浆0.2％，MgSO40.04％，MnSO4·H2O 2mg/L，FeSO4·7H2O 2mg/L，NaOH调pH 7.2。

[0017] 启动子对gadB2的表达效果测定：(1)实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR主要用于检测gadB2的转录水平，取20h和40h发酵液，提取RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR的测定；(2)谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活检测：GAD酶活测定时，取40h发酵液，测定OD值，离心去上清，用pH7.2的磷酸缓冲液洗两次，去除发酵液及胞外粘附的杂质，再将细胞悬浮在含0.1％Triton的0.02M pH4.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，获得全细胞液；GAD酶促反应体系为1ml，包括0.2M pH5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，30mM的谷氨酸钠，0.03mM的磷酸吡哆醛及400μl全细胞液，底物和全细胞提前于37℃预热10min，然后全细胞液加到反应体系中，于37℃反应1h，再煮沸10min结束反应，离心20min，上清用于检测合成的γ-氨基丁酸(GABA)含量；(3)高效液相色谱OPA柱前衍生法测定GABA产量：发酵液上清用终浓5％的TCA(三氯乙酸)稀释50倍，沉淀4h以上，12000rpm离心30min去除沉淀，取上清用于检测γ-氨基丁酸及谷氨酸的含量。

[0018] 实施例1：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK强度检测

[0019] 1、以

[0020] 上游引物PdnaK-F:

[0021] 5'-CGCGTCTAGAATTGGGTGGTTGAAAATTAG-3'

[0022] 下游引物PdnaK-R:

[0023] 5'-CGCGTCTAGAGTGATTTTAGTACTGTCCA-3'扩增启动子片段PdnaK(SEQ ID NO.1)，将启动子PdnaK与测试质粒pJYW-5-gadB2(pJYW-5构建方法见公开号CN103834679A、发明名称“一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统”的专利，pJYW-5在酶切位点XbaI及PstI之间连gadB2，gadB2见公开号CN102154345A、发明名称“谷氨酸脱羧酶基因及其应用”的专利)用XbaI酶切，载体需要去磷酸化，然后将启动子片段和载体用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞JM109，挑选出正确的转化子，构建pJYW-5-PdnaK-gadB2。

[0024] 2、将质粒pJYW-5-PdnaK-gadB2电转进谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，挑选出正确转化子，SH/pJYW-5-PdnaK-gadB2。

[0025] 3、将活化好的重组谷氨酸棒杆菌SH/pJYW-5-PdnaK-gadB2接种到30ml种子培养基，30℃、200rpm，培养8h，转接到发酵培养基中，初始OD5621.9接到发酵培养基，10h-24h，通过补加尿素的方法维持发酵液pH在6.5-7.5，从24h开始，每12h取样测定OD、残糖、pH、GABA产量等各参数，直至72h发酵结束。发酵各参数测定结果表明，含Pdnak菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的4.59倍、39.7倍，是含Ptuf菌株的3.09倍、54.3倍；含PdnaK菌株的谷氨酸脱羧酶活性是含Psod、Ptuf菌株的10倍、1.68倍；从72h GABA积累情况来看，含PdnaK菌株比含Psod、Ptuf菌株分别提高了2.29倍和10％，综合三方面均证明启动子PdnaK比对照启动子Psod、Ptuf更强。

[0026] 实施例2：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK(+1)强度检测

[0027] 1、以：

[0028] 上游引物PdnaK(+1)-F:

[0029] 5'-CGCGTCTAGAATTGGGTGGTTGAAAATTAG-3'

[0030] 下游引物PdnaK(+1)-R:

[0031] 5'-CATCAATCCTCTCCTTTCAGTTGGTGGTTCCAAGGTCA-3'

[0032] 扩增出启动子片段PdnaK(+1)(SEQ ID NO.2)

[0033] 2、以引物：

[0034] gadB2-F

[0035] 5'-GAAAGGAGAGGATTGATGAA-3'

[0036] gadB2-R

[0037] 5'-AAATCTGCAGTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3'

[0038] 从质粒pJYW-5-gadB2扩增出基因片段gadB2，将启动子片段PdnaK(+1)和基因片段gadB2，通过重叠延伸的方法将两个片段重叠在一起。

[0039] 3、将重叠后的片段和测试质粒pJYW-5-gadB2用XbaI和PstI酶切，产物纯化，随后用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞，挑选出正确转化子，成功构建pJYW-5-PdnaK(+1)-gadB2。

[0040] 4、将质粒pJYW-5-PdnaK(+1)-gadB2电转入谷氨酸棒杆菌，挑选出正确转化子，成功构建重组菌SH/pJYW-5-PdnaK(+1)-gadB2。

[0041] 5、发酵各参数测定结果表明，含PdnaK(+1)的菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的1.59倍、8.9倍，是Ptuf的1.07倍、12.17倍；含PdnaK(+1)菌株的谷氨酸脱羧酶酶活是Psod、Ptuf的5.54倍、0.92倍；72h GABA积累量来看，含PdnaK(+1)菌株比含Psod、Ptuf的菌株分别提高了2.35倍和13％，综合三方面均证明启动子PdnaK(+1)比对照启动子Psod、Ptuf更强。

[0042] 实施例3：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK(-1)强度检测

[0043] 1、以：

[0044] 上游引物PdnaK(-1)-F:

[0045] 5'-ATTACTCTAGAGCGTGAGACTTGGTGTCAAA-3'

[0046] 下游引物PdnaK(-1)-R:

[0047] 5'-CATCAATCCTCTCCTTTCGTGATTTTAGTACTGTCCAC-3'扩增出启动子片段PdnaK(-1)[0048] 2、以引物：

[0049] gadB2-F

[0050] 5'-GAAAGGAGAGGATTGATGAA-3'

[0051] gadB2-R

[0052] 5'-AAATCTGCAGTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3'

[0053] 从质粒pJYW-5-gadB2扩增基因片段gadB2，将启动子片段PdnaK(-1)和基因片段gadB2，通过重叠延伸的方法将两个片段重叠在一起。

[0054] 3、将重叠后的片段和测试质粒pJYW-5-gadB2用XbaI和PstI酶切，产物纯化，随后用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞，挑选出正确转化子，成功构建pJYW-5-PdnaK(-1)-gadB2。

[0055] 4、将质粒pJYW-5-PdnaK(-1)-gadB2电转入谷氨酸棒杆菌，挑选出正确转化子，成功构建重组菌SH/pJYW-5-PdanK(-1)-gadB2。

[0056] 5、发酵各参数测定结果表明，含PdnaK(-1)的菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的1.39倍、20.11倍，是含Ptuf菌株的0.93倍、27.47倍；含PdnaK(-1)菌株的谷氨酸脱羧酶酶活是Psod、Ptuf的5.18倍、86％；72h GABA积累量来看，含PdnaK(-1)菌株比含Psod、Ptuf的菌株分别提高了2.27倍和10％，综合三方面均证明启动子PdnaK(-1)比对照启动子Psod、Ptuf更强。

[0057] 从72h积累的GABA产量来看，PdnaK，PdnaK(+1)，PdnaK(-1)菌株分别积累了15.8g/L、16.1g/L、15.7g/L GABA，说明在PdnaK的基础上向上下游分别延伸60bp后，启动子活性基本不受影响，即三种启动子活性差不多。

[0058] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。