[0001] 本发明属于医学检测技术领域，涉及一种疟疾的快速检测技术，包括检测芯片及其制备方法和检测装置等。

[0002] 疟疾是广泛流行于热带、亚热带的一种重要虫媒传染病，极大地威胁着人类的健康。近年来，由于疟原虫及其传播媒介对药物和杀虫剂的抗性增强，以及外境人员输入性传染的影响，疟疾的控制日益重要，而疟疾的快速诊断对控制全球疟疾的作用显得尤为重要。

[0003] 我国的疟疾主要以输入性疟疾为主。目前主要的疟疾诊断方法包括：显微镜镜检、免疫学诊断实验、基于核酸扩增的检测技术等。迄今为止，显微镜镜检(厚、薄血膜)仍是疟疾诊断的金标准。但是显微镜镜检方法最大的问题在于费时费力，不适合临床快速检测和大规模样品的筛查。同时由于疟原虫体形小，形态相似，难以染色和检出，需要有经验的人员才能做到正确的诊断。

[0004] 免疫学诊断实验因其成本较高且反应时间长，不能满足临床快速诊断的要求。

[0005] 20世纪80年代以来随着分子生物学的发展而出现的基因诊断技术(如分子杂交、PCR、荧光定量PCR等)显示了较高的敏感性和特异性，可以对疟原虫的感染做出早期诊断。但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持，不适合作为临床常规的检测手段，难以在基层推广应用。

[0006] 因此，寻找一种高通量、高敏感、快速、简便的检测方法对于疟疾的防治具有重大的临床意义。

[0007] 表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术是一种光学传感器检测技术，利用表面等离子体共振原理，可将生物分子相互作用或生化反应的信号转化成光信号进行传感，具有无需标记、实时检测、快速、灵敏度高等优点。

[0008] 本领域尚未采用SPR技术实现疟疾的快速诊断。

[0038] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0039] 实施例涉及的仪器与试剂如下：

[0040] SPR检测仪：美国GWC公司，型号SPRi-mager II。

[0041] 荧光定量PCR仪：美国ABI 7500。

[0042] 芯片活化液：EDC/NHS溶液，其中EDC表示1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺，浓度为0.2mmol/L，NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺，浓度为0.4mmol/L。

[0043] 流动相：磷酸盐缓冲液(10mmol/L，PH＝7.4)。

[0044] 点样液：乙酸-乙酸钠(0.2mmol/L，PH＝4.5)。

[0045] 封闭液：乙醇胺(1mmol/L，PH＝8.5)。

[0046] 再生液：甘氨酸(100mmol/L，PH＝2.0)。

[0047] 疟原虫核酸测定试剂盒：购自上海之江生物科技股份有限公司。

[0048] 实施例1

[0049] 1.检测芯片的制备

[0050] 发明人意外发现，采用氨基偶联法可在SPR传感芯片表面上固定疟疾特异性HRP2抗原，检测相应的特异性抗体。

[0051] 本实施例的制备方法如下：

[0052] (1)芯片的清洗：芯片经过去离子蒸馏水，95％乙醇的依次清洗后再用等离子清洗仪清洗10min；

[0053] (2)高分子寡聚乙二醇处理：现配1mM SH-PEG-COOH(分子量3400)溶液10ml，浸泡清洗干净的芯片8-10h；

[0054] (3)芯片的活化：取10ml EDC/NHS活化液，浸泡芯片活化30min，水洗冲干；

[0055] (4)抗原点样：用点样液与甘油配制成含10重量％甘油的溶液，用此溶液配制HRP2抗原含量为300μg/ml的混合液，取0.5μl混合液点样于芯片表面的位置，室温固定2h。

[0056] 2.SPR技术检测血清样本

[0057] (1)将点样好的SPR芯片安装在SPR分析仪上，以PBS缓冲溶液(10mmol/L，PH＝7.4)为流动相，流速2μl/s；

[0058] (2)待基线平稳后，用封闭液乙醇胺处理10min，封闭芯片未反应的活化表面；

[0059] (3)待检测的血清样本经过PBS稀释后可上样进行检测，检测信号结果见图1。

[0060] (4)每个样本检测完后可用再生液甘氨酸(100mmol/L，PH＝2.0)再生芯片，然后进行下一个测定。

[0061] 实施例2-4

[0062] 重复实施例1的过程，区别在于在抗原点样的过程中，分别配制HRP2抗原浓度为600μg/ml、500μg/ml和200μg/ml的混合液进行检测，检测结果同样见图1。

[0063] 图1的结果表明，当HRP2抗原浓度为300μg/ml时，检测信号已较强；低于300μg/ml时，检测信号明显减弱；当HRP2抗原浓度为200μg/ml时信号微弱；当HRP2抗原浓度为100μg/ml时未能检测到SPR信号。

[0064] 实施例5-HRP2抗体检测限探索

[0065] 重复实施例1的过程，将特异性HRP2抗原200μg/ml固定在SPR芯片上，分别以NS1抗原(200μg/ml)和IgG(100μg/ml)作为对照，按照3*3设计芯片，检测HRP2抗体分别按照1：500，1：1000，1：2000，1：4000，1：5000，1：6000倍稀释，对应的浓度分别为14μg/ml，7.0μg/ml，3.5μg/ml，1.75μg/ml，1.4μg/ml，1.17μg/ml；以2μL/s的流速进样检测，结果显示在HRP2抗体为1.4μg/ml仍有检测信号，至1.17μg/ml时则无法检出，因此最低检测限为1.4μg/ml左右。

[0066] 由Igor分析软件处理，去除空白对照值后的检测信号强度示于图2。

[0067] 实施例6-SPR芯片的特异性检测

[0068] 在一张芯片上点上特异性的HRP2抗原和非特异性NS1抗原，另外点上点样液作为对照点，在SPR检测仪上检测HRP2抗体的阳性血清，结果显示HRP2点样点有特异性信号出现(见图3)，表示带有HRP2抗原的SPR芯片能特异性地检测疟疾。

[0069] 比较实施例1-荧光定量PCR检测疟疾

[0070] 参照疟原虫核酸测定试剂盒的说明书进行检测。试剂盒采用聚合酶式反应PCR技术结合荧光探针技术对疟原虫特异性核酸片段进行荧光PCR检测。

[0071] (1)疟原虫DNA提取模板DNA制备按照试剂盒说明书操作。

[0072] (2)荧光定量PCR检测

[0073] 荧光反应管置于定量荧光PCR仪上，荧光PCR扩增反应总体积为40μl，PCR扩增参数：37℃×2min，94℃×2min，93℃×15s，60℃×60s，共循环40次。

[0074] 实验结束后仪器根据标本浓度自动生成标准曲线。Ct值与起始模板量呈直线负相关。根据检测样品的Ct值，计算起始DNA含量。

[0075] 实施例7-SPR芯片技术与其他检测方法的对比分析

[0076] 临床76例疑似疟疾的标本分别用比较实施例1的荧光定量PCR和实施例1的SPR芯片技术进行检测，结果见表1。

[0077] 与荧光定量PCR方法相比，SPR芯片技术灵敏度为96.5％，特异性为94.7％，阳性预2
警值为98.2％，阴性预警值为90％，总一致性为96.1％。采用配对χ检验结果表明两种检测方法没有统计学差异(P＞0.05)。

[0078] 表1.实施例1的SPR技术和比较实施例1的荧光定量PCR之间的检测结果比较[0079]