技术领域
[0001] 本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种一步式胚胎培养液及其制备方法。
相关背景技术
[0002] 体外受精-胚胎移植InVitro Fertilization-Embryo Transfer简称IVF-ET，是指分别将卵子与精子取出后，体外受精，再将胚胎前体——受精卵移植回母体子宫内发育成胎儿。试管婴儿是用人工方法让卵子和精子在体外受精并进行早期胚胎发育，然后移植到母体子宫内发育而诞生的婴儿。
[0003] 自从世界上第一个“试管”婴孩于1978年7月25日在英国出生后，到2012年7月1日已有500万个“试管”婴孩诞生。IVF为全球超过占5000万不孕症夫妇带来了福音。然而，三十多年的临床实践并没有显著提高IVF的成功率。2011年，美国妊娠协会统计35岁病人IVF成功率(受孕率)在25-30％左右，而1997年也在30％左右，而婴儿出生率更低。其中一个重要的原因是IVF胚胎培养液的质量，这是IVF胚胎质量最重要的决定性因素之一。
[0004] IVF培养通常分为两种流程即两种培养液系列：全程(单/一步式培养液系列)和分程(双培养液系列)。利用双培养液系列流程对胚胎早期和后期阶段提供不同的培养液成份，但也丢失了由胚胎分泌入培养液中的重要的有效成份，如胚胎营养因子。全程培养液系列流程保留了这些重要的有效成份，但也保留了培养液中有害的分解产物。
[0005] 目前使用的受精液调配的营养不全，或其物理或化学指标过余宽，同样的试验过程、同批次精液在培养过程中容易使精子或卵细胞死亡、或精子获能不足活力较低、或卵细胞生存受到影响，如在精子活力试验中，精子保持活力的比率较低，或其比率接近或低于合格标准(保持活力率≥75％)。有些受精液的稠度较高，其含有有害成份和炎细胞去除不干净，严重影响受精卵的发育成长。
[0006] 另外，一般培养液在使用前不能直观地判断有效性的好坏，如果在其变质后仍继续使用将对试验或临床操作造成不可逆转的结果。因此需要开发一种无需更换培养液、含有重要有效成分并能抑制有害产物的一步式胚胎培养液。
具体实施方式
[0056] 以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0057] 实施例1一步式胚胎培养液
[0058]
[0059] 实施例2一步式胚胎培养液
[0060]
[0061]
[0062] 实施例3一步式胚胎培养液
[0063]
[0064] 对比例1一步式胚胎培养液
[0065]
[0066] 对比例2
[0067] 不加关键物料A、B，其他与实施例1相同
[0068]
[0069]
[0070] 对比例3
[0071] 只加关键物料A，其他与实施例1相同
[0072]物料 百级条件
氯化钠 99.93mmol/L
氯化钾 5.53mmol/L
硫酸镁 1mmol/L
葡萄糖 1mmol/L
庆大霉素 50mg/L
乙二胺四乙酸 0.01mmol/L
丙酮酸钠 10.51mmol/L
丙氨酰谷氨酰胺 27.49mmol/L
牛磺酸 0.48mmol/L
D-山梨醇 0.23mmol/L
氯化钙 1.8mmol/L
磷酸二氢钠 0.15mmol/L
磷酸二氢钾 0.15mmol/L
碳酸氢钠 0.64mmol/L
(±)-α-硫辛酸(A) 0.078mmol/L
必需氨基酸 0.7mmol/L-2.3mmol/L
非必需氨基酸 0.5mmol/L-1.5mmol/L
人血清白蛋白 0.5g/L
[0073] 对比例4
[0074] 只加关键物料B，其他与实施例1相同
[0075]
[0076]
[0077] 实施例4一步式胚胎培养液的制备方法
[0078] 实施例1～3和对比例1～3的一步式胚胎培养液按一下方法制备，包括以下步骤：
[0079] 1)将配置器皿经过250℃，30min干热除热源。
[0080] 2)在百级条件下配制，按上述各自比例依次物料准确称量添加到超纯水中，混合后得溶液I；
[0081] 3)在溶液I中冲6-7％CO2保护气；
[0082] 4)在冲6-7％CO2保护气的过程中加入上述分量的氨基酸和人血清白蛋白，混合后得溶液II；
[0083] 5)将步骤3)配置好的溶液II用0.2μm的滤膜过滤除菌后在放置37℃、6％的CO2培养箱中平衡5-10小时，此步骤用来调节PH在7.20-7.40范围内；
[0084] 6)将步骤4)平衡好的溶液II在6-7％CO2保护气无菌分装，得一步式胚胎培养液。
[0085] 实施例5一步式胚胎培养液指标检测
[0086] 一、对本发明的一步式胚胎培养液进行检测
[0087] 取分装好的一步式培养液进行检测，检测项目是pH值、渗透压、细胞毒性、皮内刺激、致敏、无菌、热原、细菌内毒素、体外鼠胚试验来判断卵裂培养液是否合格。
[0088] 二、一步式培养液检测方法及结果
[0089] (一)pH值检测
[0090] 取一定量成品用血气分析仪进行检测记录三次的值并取平均值为最终液体的pH值，在范围内为合格。
[0091] (二)渗透压
[0092] 取25μL液体滴入0.5mlEP管放入渗透压仪(冰点渗透压仪)探头等待检测值稳定，读出数值，同样方法检测三遍取平均值即为该液体的渗透压，在范围内为合格。
[0093] (三)细胞毒性
[0094] 按GB/T 16886.5的规定进行，细胞毒性计分应不超过1分。
[0095] (四)皮内刺激
[0096] 按GB/T 16886.10的规定进行，无皮内刺激反应。
[0097] (五)致敏
[0098] 按GB/T 16886.10的规定进行，应无致敏反应。
[0099] (六)无菌检测
[0100] 采用中国药典的无菌检测的薄膜过滤法进行，过滤后的滤膜在细菌和真菌的培养基内培养应无菌生长为无菌合格。
[0101] (七)热原
[0102] 按照中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪD规定方法，体外受精液应无热原。
[0103] (八)细菌内毒素检测
[0104] 采用中国药典内毒素的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行，判为定小于1EU/mL合格；
[0105] (九)体外鼠胚试验
[0106] 1.超数排卵
[0107] 选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG 10IU/只；48h后经腹腔注射hCG 10IU/只，注射hCG当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜。
[0108] 2.准备培养皿
[0109] 培养胚胎前在细胞培养皿中制备一定数量30～50μL大小的液体微滴，表面覆盖培养用油，在CO2培养箱内预平衡4～18小时。
[0110] 3.鼠胚采集
[0111] 合笼第二天早上检查交配情况，选择见栓小鼠备用。
[0112] 1-细胞胚胎收集：注射hCG后18至22小时后处死见栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集1-细胞胚胎。将收集到的絮状受精卵团放置到37℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后立即转移、清洗后，挑选出正常形态的受精胚胎，转移到供试品卵裂培养液微滴中，用于1-细胞鼠胚检测试验。
[0113] 4.体外培养
[0114] 采用微滴法培养，将收集到的鼠胚随机分成一个阳性对照组、一个阴性对照组和一个供试品组，置于已平衡的培养液中，于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养；每组鼠胚数不少于50个。
[0115] 5.试验结果
[0116] 1-细胞胚胎体外分别培养96小时后记录囊胚数量。
[0117] 观察指标：囊胚形态观察。
[0118] 可接受准则：
[0119] 1)阳性对照组的囊胚形成率经统计学分析显著低于阴性对照组；
[0120] 2)阴性对照组的囊胚形成率≥80％。
[0121]
[0122] 实施例6培养液培养受精卵囊胚形成实验
[0123] 利用实施例1～3和对比例1～4的培养液培养100个受精卵记录囊胚形成结果：
[0124] 1.实施例1配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：
[0125]受精卵数 囊胚形成数
100 93
100 95
100 91
[0126] 2.实施例2配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：
[0127]受精卵数 囊胚形成数
100 90
100 89
100 89
[0128] 3.实施例3配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：
[0129]受精卵数 囊胚形成数
100 88
100 89
100 89
[0130] 4.对比例1配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：
[0131]受精卵数 囊胚形成数
100 75
100 72
100 73
[0132] 5.对比例2不添加关键物料A、B配制的培养液培养受精卵，观察结果，以下为三组重复实验数据：
[0133]受精卵数 囊胚形成数
100 60
100 63
100 61
[0134] 6.对比例3只添加关键物料A，且添加量依次递增，见下表数据及结果：
[0135]
[0136] 7.对比例4只添加关键物料B，且添加量依次递增，见下表数据及结果：
[0137]
[0138]
[0139] 根据以上实验结果可见，本发明的培养液在培养过程中关键物料A,B之间是相辅相成，尤其是关键物料A的含量直接关系囊胚形成率，且每个物料在一定范围内呈线性相关；不含关键物料A,B的培养液囊胚形成率低，＜63％，可见关键物料A,B对囊胚形成都有明显的生理作用。本发明的一步式胚胎培养液培养的囊胚形成率高，囊胚形成率可达95％。
[0140] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
